2.13: Reações de Ligação de DNA

A ligação pode ser definida como o ato de unir e, em biologia, o termo refere-se a uma reação enzimática que une duas biomoléculas com uma ligação covalente. Este vídeo descreve a aplicação da ligação de DNA na pesquisa de biologia molecular.

Na célula, as DNA ligases são enzimas que identificam e selam quebras no DNA, catalisando a formação de ligações fosfodiéster entre os grupos 3?-hidroxila e 5?-fosfato da estrutura do DNA. A ligação ocorre como parte de processos celulares normais, como a replicação do DNA, para reparar quebras de DNA de fita simples e dupla.

Em laboratório, o DNA ligases é usado rotineiramente na clonagem molecular - um processo que une fragmentos de DNA digeridos por endonuclease, ou inserções, com um vetor digerido por endonuclease, como um plasmídeo, para que o fragmento possa ser introduzido nas células hospedeiras e depois replicado.

A digestão da endonuclease envolve o uso de endonucleases de restrição, ou enzimas de restrição, que criam cortes em trechos específicos do DNA.

Esses cortes podem se assemelhar a quebras de fio único produzindo 3? e 5? saliências, chamadas de extremidades pegajosas ou quebras de fios duplos sem saliências, chamadas de extremidades rombas. Ligar as extremidades pegajosas é vantajoso, porque os pares de bases salientes complementares estabilizam a reação. Como as ligações de extremidade romba não têm nenhum emparelhamento de bases complementar, a ligação é menos eficiente e mais difícil para a enzima unir as extremidades. Pontas pegajosas e rombas não podem, em circunstâncias normais, ser ligadas juntas.

No entanto, o fragmento de Klenow, produto da DNA polimerase 1, digerido com subtilisina, pode converter pontas pegajosas em pontas rombas. Klenow possui 3? para 5? atividade de exonuclease que mastiga 3? saliências e atividade da polimerase que embota 5?saliências estendendo as 3? final da fita complementar.

Quando o objetivo é inserir um gene em um plasmídeo, o resselamento do DNA do vetor, chamado de autoligação, é um resultado indesejável comum para uma reação de ligação. O tratamento com fosfatase alcalina do DNA do vetor pós-digestão remove 5?fosfatos em ambas as extremidades e evita esse resultado indesejável.

Como mencionamos anteriormente, os DNAs vetoriais e inseridos são digeridos com endonucleases antes de iniciar uma ligadura. Após a purificação em gel do vetor digerido e da inserção, as concentrações de DNA são medidas por um espectrofotômetro para determinar a concentração do vetor purificado e da inserção.

A partir dessa concentração, o número de moléculas de inserção ou vetor em 1 μl pode ser determinado com base no peso molecular médio de um par de bases de DNA e no número de pares de bases em cada fragmento. Com base na concentração molecular calculada do vetor e da pastilha, é calculada uma proporção de 3 para 1 de pastilha para vetor, para determinar o volume do vetor e da pastilha usados na reação. Essa proporção de 3 para 1 de inserção de DNA para vetor é desejável, porque aumenta a probabilidade de a inserção ser ligada ao vetor versus a própria ligação do vetor.

Agora que determinamos a quantidade de vetor e inserimos DNA a ser usado na reação, passamos a configurar a reação de ligação no gelo. A ordem de adição em quais componentes de reação devem ser adicionados ao seu tubo de microcentrífuga é a seguinte: água estéril o suficiente para fazer um volume final de 10 l, no nosso caso usaremos 4 l, 1 l 10X de tampão de ligação, 1 l 10mM de ATP, 1 l de vetor e 3 l de DNA inserido, conforme calculado e, finalmente, 1 μl DNA Ligase. A reação é bem misturada, centrifugada e incubada à temperatura adequada.

Se você está fazendo uma ligadura de extremidade pegajosa ou romba, afeta a temperatura e a duração da reação de ligação. Por exemplo, uma ligadura de extremidade pegajosa com uma saliência de seis pares de bases pode ser realizada perto da temperatura ambiente por cerca de 1 hora, porque as extremidades complementares estabilizam a união dos fragmentos. Saliências curtas ou ligaduras de extremidade romba devem ser realizadas entre 14-20? C durante a noite.

Agora que aprendemos como configurar uma reação de ligadura, vamos dar uma olhada em algumas das aplicações desse procedimento.

As ligações podem ser usadas para inserir diretamente fragmentos amplificados por PCR em plasmídeos linearizados. Aqui você vê um pesquisador pegando uma amostra de cérebro de camundongo congelado, isolando o DNA genômico dele e, em seguida, submetendo-o a PCR de bissulfito, que é um método baseado em PCR para detectar DNA metilado. Os produtos de PCR são então ligados diretamente ao plasmídeo para criar uma biblioteca de genes que são metilados nessa região específica do cérebro.

As ligações podem ser usadas para anexar ligantes de oligonucleotídeos, que contêm locais de ligação para primers de PCR, para purificar fragmentos de DNA. Ao trabalhar com amostras de tumores, os cientistas podem usar essa abordagem para sequenciar o DNA genômico do tumor, com a esperança de identificar mutações causadoras de tumores.

Neste vídeo, a ligadura é realizada em DNA isolado de células fixadas em formaldeído e posteriormente tratada com uma enzima de restrição e klenow na presença de biotina, que é então usada para puxar para baixo o DNA ligado. Este DNA é então amplificado usando PCR e os produtos sequenciados para identificar interações de cromatina em várias escalas, conforme mostrado.

Você agora aprendeu sobre a DNA ligase, vários princípios envolvidos na criação da ligação em laboratório, problemas e correções potenciais e várias aplicações da ligação na pesquisa de biologia molecular. Obrigado por assistir.