Question 1

O que é a ligação de DNA e como funciona nas células?

Accepted Answer

A ligação de DNA é uma reação enzimática que une duas moléculas de DNA formando uma ligação covalente de fosfodiéster. As DNA ligases identificam e selam quebras na espinha dorsal do DNA catalisando a formação de ligações entre os grupos 3'-hidroxila e 5'-fosfato. Nas células, a ligação ocorre durante a replicação do DNA e repara quebras de fita simples e dupla como parte dos processos celulares normais.

Question 2

Por que as extremidades pegajosas são preferidas às extremidades rombas na ligação de DNA?

Accepted Answer

As extremidades pegajosas contêm pares de bases sobrepostos complementares que estabilizam a reação de ligação, tornando o processo mais eficiente e mais fácil para a enzima unir Fragmentos de DNA. As extremidades sem sobreposição não possuem emparelhamento de bases complementares, resultando em uma ligação menos eficiente que é mais difícil para a enzima completar. Extremidades pegajosas e sem sobreposição não podem ser ligadas juntas em circunstâncias normais.

Question 3

Como é que o fragmento Klenow converte extremidades pegajosas em extremidades cegas?

Accepted Answer

O fragmento Klenow, derivado da DNA polimerase 1 digerido com subtilisina, possui atividade de exonuclease de 3' para 5' e atividade de polimerase. A atividade de exonuclease remove sobreposições 3', enquanto a atividade a polimerase estende a extremidade 3' da fita complementar para converter sobreposições 5' sobrepostas em extremidades cegas, efetivamente convertendo extremidades pegajosas em extremidades cegas.

Question 4

Qual é o propósito do tratamento de fosfatase alcalina nas reações de ligação?

Accepted Answer

A fosfatase alcalina remove grupos fosfato 5' de ambas as extremidades do DNA do vetor após a enzima de restrição digestão. Isso previne a auto-ligação, um resultado indesejável onde o vetor se religa sem incorporar o DNA do inserto, aumentando assim a probabilidade de que o inserto seja ligado ao vetor.

Question 5

Por que uma proporção de inserção para vetor de 3 para 1 é usada em reações de ligação?

Accepted Answer

Uma razão molar de 3 para 1 de DNA de inserção para DNA do vetor aumenta a probabilidade de que a inserção será ligada ao vetor em vez do vetor se ligar a si mesmo. Esta razão é calculada com base nas concentrações de DNA medidas por espectrofotometria e nos pesos moleculares do vetor purificado e dos fragmentos de inserção para determinar volumes apropriados para a reação.

Question 6

Como a temperatura e a duração diferem entre ligações com extremidades adesivas e extremidades cegas?

Accepted Answer

Ligações de extremidades adesivas com sobreposições de seis pares de bases podem ser realizadas próximas à temperatura ambiente por aproximadamente uma hora porque as extremidades complementares estabilizam a união do fragmento. Sobreposições curtas ou ligações de extremidades cegas requerem temperaturas mais baixas entre 14-20°C e devem ser incubadas durante a noite para permitir tempo suficiente para o processo de união menos eficiente.

Question 7

Quais são as aplicações comuns da ligação de DNA na pesquisa em biologia molecular?

Accepted Answer

A ligação de DNA é usada para inserir fragmentos amplificados por PCR em plasmídeos linearizados para criar bibliotecas de genes, anexar conectores oligonucleotídeos contendo locais de ligação de primers de PCR a fragmentos de DNA purificados para sequenciamento e realizar ensaios de ligação de proximidade em células fixadas com formaldeído para identificar interações de cromatina em várias escalas.

Reações de Ligação de DNA - Questionário de avaliação