Em larga escala Knockdown Gene em C. elegans Usando bibliotecas de alimentação dsRNA para gerar fenótipos robustos perda de função

O objetivo geral deste procedimento é realizar telas de interferência de RNA em larga escala na elegância C usando uma biblioteca de alimentação de RNA DS bacteriano para derrubar a expressão gênica. Isso é feito primeiro cultivando clones bacterianos de uma biblioteca de RNA DS. Sob condições de crescimento que evitam a perda de plasmídeo, comece duplicando cada placa de biblioteca primária e, em seguida, usando a placa de biblioteca duplicada de 96 poços para gerar caules temporários de bactérias em placas omni de ágar.

As bactérias dessas placas omni são cultivadas durante a noite em cultura líquida e posteriormente transferidas para a superfície das placas de alimentação de minhocas. Cada clone bacteriano da biblioteca carrega um plasmídeo codificador DSRNA exclusivo que tem como alvo um gene C elgan para knockdown. O segundo passo é colocar minhocas sincronizadas nas placas de alimentação.

Em seguida, os vermes são cultivados por vários dias em uma câmara umidificada a 20 graus Celsius. À medida que os vermes se alimentam das bactérias, os RNAs DS induzidos são liberados no intestino do animal, onde se espalham para os tecidos circundantes para causar efeitos sistêmicos de knockdown. A etapa final é examinar os animais alimentados quanto a efeitos fenotípicos causados pelo knockdown específico do gene.

Esses ensaios fenotípicos são usados para identificar genes importantes para o processo biológico em estudo. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a microinjeção de RNAs de fita dupla na gônada do verme, é que ela é de alto rendimento. Usando bibliotecas de alimentação, podemos examinar a função biológica de quase todos os genes do sea elgin em apenas algumas semanas.

Muitos laboratórios têm lutado com essa abordagem de knockdown porque a maioria dos genes e a elegância C são haplo suficientes. E assim o knockdown de RNA deve diminuir a expressão gênica em mais de 50% para produzir fenótipos de perda de função. Para garantir um nocaute genético robusto, é fundamental que todas as bactérias alimentadas com os vermes expressem o plasmídeo de RNA de fita dupla.

Para iniciar o procedimento para determinar a perda de plasmídeo, remova uma pequena amostra de bactérias conforme descrito em cada etapa relevante e adicione-a a 450 microlitros de água estéril. Use 100 microlitros desta amostra diluída para criar diluições em série adicionais usando água estéril. Misturar bem as soluções entre as diluições.

Espalhe 100 microlitros de cada diluição nas placas LB e LB AMP e incube durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte, identifique a placa LB que contém entre 100 e 500 colônias bacterianas. Conte o número de colônias nesta placa e na placa de lb amp correspondente contendo a mesma diluição de bactérias. Determine a perda de plasmídeo usando esta equação.

A porcentagem de bactérias que não contêm o plasmídeo é calculada subtraindo o número de colônias na placa LB amp do número de colônias na placa LB, dividindo pelo número de colônias na placa LB e multiplicando por 100 A perda de plasmídeo é evitada pelo crescimento de bactérias em altas concentrações de sellin carbônico Para um knockdown eficaz. Verifique se há perda de plasmídeo antes de alimentar os animais e continue apenas se a perda de plasmídeo for inferior a 15%Comece este procedimento removendo as placas de biblioteca duplicadas do freezer de 80 graus Celsius negativos. Retire o lacre de alumínio enquanto as culturas ainda estão congeladas.

Recoloque a tampa plástica das placas e coloque as placas duplicadas da biblioteca em uma superfície nivelada para descongelar em temperatura ambiente por no máximo 30 minutos. Esterilize o replicador bucal de 96 pinos. Coloque-o em um banho de etanol e queime o etanol.

Revestindo os pinos usando um pão e queimador. Deixe a chama se apagar e repita. Os pinos de um replicador limpo devem ser enxaguados com água destilada e depois esterilizados antes de cada uso.

Coloque o replicador esterilizado nos poços da placa duplicada descongelada e use-o para agitar suavemente as culturas. Pequenos volumes da cultura irão aderir aos pinos do replicador. Remova cuidadosamente o replicador dos poços da placa duplicada e coloque-o suavemente fixado na superfície da placa omni.

Tenha cuidado para não perfurar a superfície do ágar. Deixe o replicador na superfície da placa omni por três a quatro segundos para que as bactérias dos pinos do replicador sejam transferidas para a superfície do ágar. Para evitar a perda de plasmídeo em meio sólido, o coma contém dois miligramas por mililitro.

Sellin carbônico. Remova o replicador e deixe o pequeno volume de cultura bacteriana ser absorvido pelo ágar. Depois que ambas as placas tiverem sido duplicadas.

Incubar as placas omni invertidas por 15 a 18 horas a 37 graus Celsius na manhã seguinte. Essas placas omni podem ser usadas para inocular 96 culturas líquidas de poços ou armazenadas por até sete dias a quatro graus Celsius. As bactérias para alimentar vermes são preparadas como culturas líquidas usando bactérias das placas omni usando um pipetador repetido e uma ponta combinada de 50 mililitros, dispense um mililitro de meio de crescimento bacteriano em cada dois mililitros.

Poço profundo de uma placa de 96 poços esterilize o replicador e coloque-o na superfície de uma placa omni contendo colônias bacterianas, certificando-se de que os pinos estejam em contato com cada uma das 96 colônias bacterianas. Mova cuidadosamente o replicador da superfície da placa omni para a placa de poço profundo, certificando-se de que os pinos não raspem as laterais dos poços profundos até que estejam imersos em meio de crescimento. Para desalojar as bactérias no meio de crescimento.

Mova o replicador lentamente em um movimento quadrado seguindo a parede interna da placa de poço profundo. Tenha cuidado para não respingar e contaminar os poços. Para cada placa de cultura de poço profundo de 96 poços, dois controles devem ser incluídos.

Bactérias que expressam o RNA DS como controle positivo para o knockdown esperado, fenótipo e bactérias contendo vetor de RNA DS vazio como controle negativo. Usando uma alça de inoculação estéril, remova uma única colônia isolada do poço da placa de controle positivo e inocule um poço vazio no poço profundo chamado placa. Registre a posição do poço que foi inoculado.

Repita para o controle negativo. Agite as placas de poços profundos em uma posição plana a 650 RPM em um micro agitador a 37 graus Celsius durante a noite. Após a incubação noturna das culturas, as bactérias das 96 placas de poços profundos serão transferidas para 12.

A transferência de placas de alimentação de poços pode ser feita quatro poços de cada vez. Coloque as pontas da pipeta em cada terceiro canal de uma pipeta multicanal de 12 canais. Remova 150 microlitros de cultura bacteriana da placa de poço profundo e ejete na superfície de quatro poços da placa de alimentação de 12 poços.

É importante não perfurar a superfície do ágar durante a transferência, pois os vermes se enterram e não se alimentam das bactérias que expressam o RNA DS. Depois que cada conjunto de quatro poços for transferido, substitua as quatro pontas da pipeta por quatro novas pontas de pipeta estéreis e semeie os próximos quatro poços da placa de alimentação, armazene as placas semeadas na vertical no escuro em temperatura ambiente durante a noite para que as bactérias possam ser absorvidas pelo ágar. Antes de transferir L, uma larva de C elgan presa para placas de alimentação de RNA DS para uma tela de alimentação.

Deve determinar-se a concentração das larvas previamente preparadas de L one. Misturar o erlenmeyer contendo as larvas L one presas para distribuir os animais. Em seguida, remova uma alíquota de 10 microlitros e coloque gota a gota em uma placa NGM de seis centímetros não assentada.

Em quatro a cinco gotas no centro do prato. Certifique-se de que todos os meios sejam expelidos da pipeta. Usando a extremidade da ponta da pipeta, espalhe os pontos da suspensão sem-fim para formar uma única linha contínua de líquido que abrange o diâmetro da placa.

Usando um microscópio de dissecação, conte todos os animais começando em uma extremidade da linha de líquido e continuando até a outra extremidade antes que o líquido seja absorvido pela placa e os animais se dispersem. Isso pode exigir uma reorientação constante do escopo de dissecação para garantir que nenhum animal seja perdido. Repetir este processo de contagem para três alíquotas separadas de 10 microlitros para determinar o número médio de vermes por microlitro de suspensão de minhocas e registar este número directamente no erlenmeyer.

Para iniciar a tela de alimentação, use a suspensão de larvas presas de L one e água estéril para preparar uma solução contendo 2000 vermes por mililitro. Cada placa de alimentação de 12 poços exigirá 120 microlitros desta suspensão de minhoca bem misturada para garantir uma distribuição uniforme dos animais e transferi-los para um reservatório estéril para pipetagem. Usando a pipeta multicanal configurada com pontas a cada três posições, transfira 10 microlitros da solução sem-fim diretamente para o gramado bacteriano das placas de alimentação.

Tome cuidado para não perfurar a superfície do ágar, pois os vermes se enterrarão no ágar e não se alimentarão das bactérias que expressam DSRNA. Após a transferência da solução de minhoca para cada duas fileiras de placas de alimentação, remisture a solução de minhoca no reservatório, espalhando-a suavemente enquanto as minhocas se acomodam rapidamente Examine alguns poços no início sob o escopo de dissecação para garantir que cada poço esteja recebendo de 20 a 30 minhocas. Uma vez que todas as placas de alimentação tenham minhocas, armazene as placas na vertical em uma caixa umidificada em uma incubadora de 20 graus Celsius no dia seguinte após a suspensão de minhocas ter sido absorvida pela placa, inverta as placas e retorne ao umidificador a 20 graus Celsius.

Os animais nessas placas podem ser observados após três dias para os fenótipos P zero e novamente após seis dias para os fenótipos F1. O protocolo aqui descrito foi usado para testar quatro genes para knockdown do ovo L 30 dumpy 17, PAT 10, e em quatro ovos L 30 e em quatro são expressos no sistema nervoso. Pat 10 é expresso no músculo da parede corporal e o atarracado 17 é expresso nas células epidérmicas.

Os mutantes Erie one Lin 15 B foram usados nas telas devido à sua sensibilidade aumentada ao RNAi como controle negativo. Os vermes foram alimentados com bactérias contendo o plasmídeo PL 44 40 vazio que não expressou um RNA DS como esperado. Animais RIE one Lin 15 B alimentados com bactérias contendo no plasmídeo vazio não apresentaram defeitos morfológicos ou comportamentais.

Esta fotografia mostra animais em movimento livre, como evidenciado por sua postura corporal normal. A seta preta indica a posição de um animal adulto jovem. A seta branca indica a posição de um grupo de ovos postos.

O comportamento normal dos vermes é mostrado neste videoclipe, o ovo L 30 codifica o orto da elegância do mar da subunidade G alfa Q.Quando L de um estágio Erie uma larva Lin 15 B foram alimentadas com bactérias que expressam o ovo L 30 DS RNA. As larvas cresceram e se tornaram adultos que apresentavam defeitos claros na locomoção e no comportamento de postura de ovos. Após três dias, 100% dos animais alimentados com RNA DS contra o ovo L 30 ficaram paralisados e incapazes de botar ovos.

Esta fotografia mostra que todos os animais adotaram uma aparência rígida típica de animais paralisados. A completa ausência de ovos postos no prato também deve ser observada. Dumpy 17 codifica uma proteína de colágeno necessária para a formação da cutícula no mar.

Elgan e 17 mutantes nulos são mais baixos e mais gordos do que os animais do tipo selvagem. Neste experimento, não foram observados defeitos morfológicos em animais P zero alimentados com 17 D-S-R-N-A. No entanto, 98% dos animais F1 mostrados nesta figura apresentaram o fenótipo atarracado.

Observe que os animais adultos no campo, um dos quais é marcado pela seta, são mais baixos e mais gordos do que o animal adulto marcado pela seta preta. No painel A.A falta de animais P zero curtos e gordos indica que a função do gene 17 atarracado é necessária nos estágios larvais iniciais para uma morfologia corporal adequada. Pat 10 codifica a proteína CA troponina muscular da parede corporal contendo quatro motivos de mão EF que se ligam ao cálcio.

Observou-se neste estudo que 100% dos animais Erie one Lin 15 B alimentados com RNA Pat 10 DS ficaram paralisados em três dias e não botaram ovos, levando a um fenótipo letal. Observe que, embora os animais estejam paralisados, eles ainda podem mover os músculos da cabeça para se alimentar, conforme indicado pela limpeza de bactérias perto da cabeça marcada pela seta em quatro codificações, uma proteína de domínio homeo expressa em neurônios motores do cordão ventral e é necessária para a entrada sináptica adequada. A escolha de quatro foi escolhida como gene de teste neste estudo porque provou ser resistente às estratégias anteriores de alimentação de RNA DS.

Os resultados deste estudo mostraram que 62% dos animais alimentados com quatro bactérias que expressam RNA DS da preparação da biblioteca mostraram defeitos no comportamento de locomoção em comparação com animais do tipo selvagem que recuam livremente em um movimento sinusoidal quando cutucados na cabeça, UNC quatro mutantes nulos não voltam, mas contraem firmemente causando um flexor dorsal, que muitas vezes se torna tão extremo que a cabeça e a cauda do animal se tocam, colocando o corpo em uma posição enrolada. Esta tabela mostra a porcentagem de animais que exibem fenótipos semelhantes aos nulos quando alimentados com DNA DS contra cada um dos quatro genes testados: 100 animais foram examinados para cada experimento de knockdown. Esses resultados demonstram a importância da retenção de plasmídeos para o sucesso do RNA DS.

Telas de interferência fenótipos de perda de função robustos e altamente penetrantes podem ser observados em todos os tecidos. Quando todas as bactérias alimentadas com vermes expressam DS RNA Uma vez dominada, toda a biblioteca de alimentação pode ser rastreada por uma pessoa em cerca de dois meses. Para melhorar o rendimento, testamos cada clone bacteriano apenas uma vez em uma tela de alimentação.

Quaisquer genes identificados na primeira passagem pela biblioteca são então testados novamente. Em triplicado, insistimos que o fenótipo desejado seja observado em todos os retestes para que o gene seja elevado ao quadrado como um acerto positivo. O plasmídeo é então purificado da bactéria e sequenciado para verificar a identidade do gene codificado.

Uma vez que um gene é identificado, solicitamos um mutante L, se disponível, e o testamos para o fenótipo desejado antes de realizar qualquer caracterização adicional do gene.