Name: Transplantes faciais em Xenopus laevis Os embriões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprenda a realizar transplantes de tecido facial EAD em embriões de Xenopus laevis para estudar o desenvolvimento craniofacial. Esta técnica permite investigar interações de sinalização e requisitos locais para a formação facial.

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Agradecemos Radek Sindelka por seu auxílio, e Cas Bresilla para ajudar com a criação de sapo e preparação embrião. Este trabalho foi financiado pelo NIH através do R01DE021109 concessão para HLS Laura Jacox foi financiado pelo Herschel Smith Graduate Fellowship na Universidade de Harvard e uma subvenção F30 indivíduo comunhão F30DE022989-01 através do NIDCR.

1. Reagentes Preparar <ol><li> 10x MBS: Preparar 1 L de 10x Modificado solução 17 de Barth Saline (MBS). Consulte a Tabela 1, Reagentes, ingredientes e instruções. Use água destilada para todas as soluções. Misture em uma proveta, utilizando uma barra de agitação, até a dissolução completa. Todas as soluções devem ser feitas à temperatura ambiente. </li><li> 1x MBS: Diluir 100 ml da solução de MBS 10x em 900 ml de água destilada para fazer 1 L de 1x MBS. Adicionar 0,7 ml de 1 M de solução de CaCl 2. </li><li> 0.1x MBS: diluir 1x MBS para preparar 1 L de solução 0,5 x MBS e 2 L de 0,1 x MBS solução. Para 1 L de 0,1 x MBS solução, adicionar 1 ml de 10 mg / ml solução de gentamicina. A solução de MBS 0,1 x com gentamicina será utilizado para a cultura de embriões de longo prazo. </li><li> Ficoll / MBS: Adicione 15 gramas de Ficoll 400 a 500 ml de solução de 0,5 x MBS. Misture vigorosamente. Adicionar uma barra de agitação e misturar até estar completamente dissolvido de Ficoll (várias horas). </li><li> Etanol a 70%: Diluir 100% de etanol para 70% de etanol usandoágua destilada. </li></ol> 2. Preparando vidro Ferramentas Operacionais <ol><li> Preparação da agulha: Carga tubos capilares em um extrator de agulha. <ol><li> Puxe as agulhas de acordo com as configurações mostradas na Tabela 2: Configurações do extrator de agulhas. As definições são para um extractor de micropipeta Sutter Instrument Co. Modelo P-80/PC e tubos capilares, como descrito na Tabela de reagentes e equipamentos específicos. No entanto, essas configurações são específicas para a agulha extrator Sutter, e terá de ser ajustado para outras máquinas. As configurações podem ser determinados utilizando um teste de rampa, conforme especificado pelo fabricante da máquina. </li><li> Puxe 4-6 agulhas em preparação para o procedimento. As agulhas devem ser quebradas de tal modo que a porção de cabelo como flexível da ponta de vidro é completamente removido, o que é tipicamente de 2-3 mm de comprimento. A ponta tem de ser relativamente rígido, mas ainda suficientemente estreita para ser utilizado como uma ferramenta de corte. Veja a foto de uma agulha ideal na Figura 1A. </li&gt; <li> Armazenar as agulhas numa placa de Petri com uma tira de barro para baixo do centro. Pressione o eixo de cada agulha na argila, para segurá-la no lugar e manter a ponta afiada frágil longe do fundo e os lados. </li></ol></li><li> Para ferramentas adicionais, obter lamínulas de vidro, um par de pinças longas padrão teste padrão, um bico de Bunsen, e 3-4 pipetas Pasteur de vidro (tamanho 5 ¾ in). </li><li> Ferramenta Pipeta: Para fazer uma ferramenta de pipeta, acender o queimador de Bunsen e colocar a ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro para a parte azul da chama durante a rotação dele, de tal modo que a ponta se derrete e o furo completamente vedações, formando uma, extremidade arredondada fechada . A ponta arredondada está selado posteriormente usada para fazer depressões na louça de barro que detém os embriões durante a operação. Ver Figura 1B. </li><li> Pontes de vidro: fazer pontes de vidro, utilize uma pinça de padrão longo padrão de quebrar cuidadosamente off 3 mm x 3 milímetros pedaços de vidro tampa de deslizamento. Com o pedaço de lamínula com tweezers, coloque o vidro da chama até que todas as quatro bordas amaciar e curva descendente, formando uma pequena cúpula de vidro. As bordas não devem mais ser afiada. Ver Figura 1C. </li><li> Guarde as pontes deslizamento tampa de vidro, inserindo-os, bordas para baixo, em massa de modelar, que reveste a parte inferior de uma placa de Petri. Inserir as pontes de tal modo que a parte superior da ponte permanece acima da superfície da argila. Não muito difícil empurrar de tal modo que os intervalos de ponte, e não incorporar completamente a ponte para a argila, uma vez que pode ser difícil de remover. Após a esterilização com uma chama ou etanol a 70%, as pontes podem ser reutilizados de experiência para experiência. </li></ol> 3. Preparação para a Operação Embryo <ol><li> Forre uma pequena 60 milímetros de plástico placa de Petri com massa de modelar. Entre as utilizações, a superfície do prato e argila é cuidadosamente lavado com água destilada e em seguida com etanol a 70%. NOTA: Use vermelho, branco ou amarelo, Van Aken Plastalina massa de modelar, que podem ser comprados em um local paray ou loja de arte. Barro preto não é recomendado porque ele libera um resíduo. </li><li> Encha o prato com 3% de solução Ficoll 0.5x MBS. A concentração mais elevada de sal previne a dissociao de tecido, e o polissacárido de Ficoll ajuda a engrossar a solução, o que ajuda a segurar o rosto em posição. </li><li> Use a ferramenta pipeta Pasteur inflamado (ver Figura 1) para fazer rasas, 2-3 mm depressões na argila, sobre a profundidade de um corpo embrião estágio 20. Faça 20-30 depressões, 1-2 mm, de cada lado do prato, para que haja um total de 40-60 depressões. Rotular um lado LOF / GOF, eo outro tipo selvagem lado, pela escultura iniciais no barro com uma pinça. </li></ol> 4. Preparação pré-operação Embryo <ol><li> Obtenha e cultura de Xenopus laevis embriões usando métodos padrão 17. Para uma descrição detalhada da criação de sapo, consulte Sive et al. 17 <ol><li> Quarenta e oito horas antes do ensaio obtaem ovos de rãs fêmeas e realizar a fertilização in vitro. </li><li> Injetar 0,5-1 ng de membrana tampado GFP mRNA, além de qualquer mRNA desejado ou anti-senso oligonucleotídeos antisense modificados por morpholino (&quot;morpholinos&quot;) na fase de uma célula ou em duas células na fase 2 celular. A certa altura da célula dura aproximadamente 70-90 min. Injetar um volume total de 1-3 nl. Em lugar de codificação de RNA para uma proteína fluorescente (GFP, tal como ARN ou RFP), pode-se injectar com FITC etiquetado morfolino ou dextrano marcado por fluorescência. A fluorescência é importante para determinar se a cura do tecido transplantado e permanece na cabeça. </li><li> Tampado ARNm pode ser preparado a partir de um plasmídeo linearizado usando uma SP6 mMessage mMachine ou kit T7. Morpholinos pode ser projetado e encomendado através Gene Ferramentas LLC. A quantidade de morfolino necessária para um efeito desejado deve ser determinada para cada gene 18. </li><li> Armazenar os embriões injectados a 15 ° C durante 48 horas, até que atinjam a fase de 19-20. (Fou todas as etapas subseqüentes, embriões em estágio de acordo com a tabela normal de Xenopus laevis por Nieuwkoop and Faber 19.) NOTA: No dia da cirurgia, os dois embriões receptores e doadores devem estar dentro de um estágio de cada um para os transplantes de trabalhar de forma otimizada. No entanto, os embriões injetados com morpholinos (&quot;morphants&quot;), por vezes, desenvolver mais lentamente do que o tipo selvagem ou controlar embriões morphant, tornando-se necessário coordenar as experiências para que ambos morphant e embriões tipo selvagem estão no mesmo estágio. Morphants pode necessitar de ser mantido a uma temperatura mais elevada durante 12-24 horas antes do procedimento. Para aumentar a probabilidade de que os embriões podem ser encontrados nas fases correspondentes, os embriões podem ser mantido a várias temperaturas. Vinte e quatro horas antes do ensaio, deve-se dividir os embriões em um vários pratos e coloque morphants a 18-20 ° C e embriões tipo selvagem em 15-18 ° C. </li></ol></li><li> No dia da experiência transplante, remove os embriões de the15 ° C incubadora e encenar los de acordo com Nieuwkoop and Faber 19. Se eles são mais jovens do que neurula tarde (fase 19), deixá-los em temperatura ambiente por 1-2 horas, até atingirem o estágio 19. </li><li> Peneirar os embriões injectados sob um microscópio fluorescente. Selecione embriões que mostram uniforme, fluorescência brilhante para o experimento. </li><li> Remover a desordem e possíveis contaminantes perto da área de operação. Limpe a superfície de operação, microscópio estereoscópico e todas as ferramentas com etanol 70%. </li><li> Uma vez que os embriões estão em fase 19, retire a membrana vitelina usando # 5/45 fórceps Dumont sob microscópio estereoscópico. <ol><li> Retirar a membrana vitelina de 20-30 de cada um dos dadores e embriões hospedeiros. </li><li> Para os primeiros experimentos de transplante de face, deve-se praticar com alguns embriões para cada condição. O método é difícil e requer a prática cuidadoso antes que ele possa ser utilizado numa escala maior, mais rapidamente e com sucesso. Pode-se trabalhar up para fazer 20 transplantes / experimentais. </li></ol></li><li> Mover embriões hospedeiros para o prato de funcionamento utilizando uma pipeta de transferência de plástico graduado com a ponta cortada de tal forma que a abertura é muito mais ampla do que um embrião (pelo menos alguns milímetros). Tenha cuidado para evitar tocar embriões de bolhas ou a superfície da água, como embriões vai explodir na tensão superficial. </li><li> Use # 5/45 fórceps para inserir os embriões para as depressões de argila, com a posterior do embrião na argila. Feche a argila em torno das bases do embrião utilizando a pinça, deixando o quarto superior do embrião, a cabeça, que se projeta da depressão. </li><li> Uma vez que todos os embriões hospedeiros são fixadas nas suas depressões, mover-se para o outro lado da placa e começa a inserir os embriões de dadores nas suas depressões. Repita o processo de obtenção de embriões em seus poços. </li></ol> 5. Realização de Transplante Cirurgia Crânio-Facial <ol><li> Faca de corte: Como uma faca de corte para remoçãode tecido de doador de EAD, usar uma agulha capilar de vidro apropriadamente dividido (ver passo 2.3 e Figura 1). NOTA: Pode-se realizar diretamente o capilar entre os dedos (isso funciona bem para as pessoas com mãos pequenas) ou pode-se montar a agulha em um suporte inseto pin. Agulhas de tungsténio Electrosharpened 17 carregados num suporte de pino pode ser utilizado em vez de uma agulha do tubo capilar. Por favor, veja retentores de pinos sugeridas e agulhas de tungstênio na Tabela de reagentes específicos e Equipamentos. </li><li> Sob um microscópio estereoscópico, inserir a agulha na cabeça do embrião à esquerda da glândula de cimento. A agulha deve ser inserida profundamente, de modo que passa a partir do lado de fora do embrião, através da cabeça, e para o intestino anterior. Para transplante de toda a EAD, cortes deve estender-se desde o exterior do embrião para o intestino anterior. Para transplantes somente ectoderma, os cortes devem ser mais raso e estender apenas através do ectoderma. <ol><li> Flick a agulha da esquerda para o lado direito dacabeça, ao longo de toda a largura da glândula cimento. O movimento súbito é importante, pois o movimento dá um corte limpo. Consulte a Figura 2A para um resumo da técnica e figura 2B para uma demonstração dos cortes. A glândula de cimento e os olhos são marcos importantes para os cortes. A ordem dos cortes não afetam o resultado e pode variar de acordo com a preferência do usuário ou lateralidade. </li></ol></li><li> Coloque a agulha no início do corte anterior, na margem esquerda da glândula de cimento, e agite a agulha para cima, até atingir o fundo do olho esquerdo. Isto irá criar um corte vertical da margem esquerda da glândula de cimento para o fundo do olho esquerdo. </li><li> Coloque a agulha na borda direita da glândula de cimento, e agite a agulha para cima até que ele atinja o fundo do olho direito. Isto irá criar um corte vertical da margem direita da glândula de cimento para a parte inferior do olho direito. </li><li> A ressecção total do tecido, flick a agulha a partir da parte inferior do olho esquerdo para o fundo do olho direito, a criação de um corte horizontal que vai libertar o tecido. Os cortes podem estender-se desde o exterior do embrião para o intestino anterior, incluindo tanto ectoderme e endoderme no explante EAD. Como alternativa, cortes superficiais pode ser usado para ectoderma somente transplantes EAD. Uma vez que o tecido é removido EAD, deve haver um furo rectangular, a partir do exterior do embrião dentro do intestino anterior, estendendo-se a partir da glândula cimento até um pouco abaixo dos olhos (de cima para baixo). O buraco deve se estender a partir da fronteira para dentro do olho esquerdo até a fronteira interior do olho direito (lado a lado). Veja a figura 2bb. </li><li> Com cuidado, empurre o tecido retirado na ponta da agulha, e levantá-lo através do buffer para a parte do prato contendo embriões de acolhimento. Não exponha o tecido ao ar na superfície ou ele vai ficar danificado. </li><li> Excisar o mesmo tecido a partir do embrião hospedeiro, como para o dador. Descarte o explante EAD host ou salvá-lo para insert para o rosto do doador, para transplantes recíprocos. </li><li> Insira o explante doador para o buraco anfitrião resultante usando # 5/45 fórceps. </li><li> Uma vez que o tecido do doador está corretamente posicionado e totalmente inserido, coloque cuidadosamente uma ponte de vidro (veja a Figura 1 e Figura 2BC) sobre o rosto do embrião para realizar o transplante no lugar. As extremidades da ponte deve inserir no barro, segurando-o no lugar. A ponte deve aplicar uma pressão suave para o tecido transplantado, de tal forma que o transplante se encontra alinhada com a cabeça de acolhimento, sem que saindo da cabeça ou deitado no fundo da cabeça. A cabeça pode ser ligeiramente achatado pela lamínula, mas tenha cuidado para não danificar o embrião com muita pressão. Transplantes deve ser realizada no prazo de 5 minutos. NOTA: Um investigador experiente pode realizar cerca de vinte transplantes por experiência, mais de 2-3 horas. Durante este período, os embriões vai avançar a partir da fase 20-22. Completando o transplante de rostos na fase 21 ou 22 não afeta os resultados. Transplantes posteriores (em estágios 22-26) pode ser feito, mas são mais difíceis como a região da linha média EAD o livre-crista é estreitada como movimentos da crista neural cranial para o rosto. Consistência entre os transplantes é crítica. </li></ol> 6. Transplante de rosto recuperação pós-operação <ol><li> Cura normalmente leva 2-3 horas. Deixe os embriões em temperatura ambiente sem ser perturbado em suas depressões de argila com as pontes de vidro segurando o tecido do doador no lugar. </li><li> Uma vez que os transplantes de ter curado, retire cuidadosamente as pontes de vidro, remova o barro em torno da base dos embriões, usando uma pinça, e use um plástico formado transferência pipeta para aspirar suavemente os embriões de suas depressões. </li><li> Coloque os embriões em uma placa de Petri devidamente rotulados, metade cheia de MBS 0,1 x limpas com gentamicina. </li><li> Crescer os embriões a 15 ° C ou 18 ° C durante vários dias, até alcançarem a alimentação fase de girino na fase 40, wgalinha fenótipos faciais podem ser pontuadas. <ol><li> A solução MBS 0,1 x com gentamicina deve ser trocada diariamente, e quaisquer embriões mortos devem ser removidos imediatamente para evitar a contaminação e morte de outros embriões. </li><li> A boca abre na fase 40. Na fase 40-41, deve-se verificar se o tecido transplantado permanece curada no lugar, visualizando sua fluorescência. Transplantes ocasionalmente cair, por isso é preciso garantir que todos os embriões marcados têm o tecido do doador no lugar. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Etapas críticas e limitações: O procedimento de transplante de rosto EAD é tempo e trabalho intensivo. Requer prática, mãos firmes, e destreza para aperfeiçoar. O protocolo de transplante de rosto depende da capacidade do pesquisador para remover de forma eficiente e tecidos para transplante. Se alguém leva muito tempo para inserir o transplante no rosto do anfitrião, o rosto de acolhimento começará a se contrair e curar. Pinça pode ser utilizado para expandir delicadamente a região facial. No entanto, se contraç...

Para entender os mecanismos subjacentes defeitos craniofaciais congênitos 1-2, tecidos importantes e suas contribuições de sinalização durante o desenvolvimento craniofacial devem ser identificados. No sapo Xenopus laevis, parte do rosto, incluindo a boca e as narinas forma do &quot;Extreme Anterior Domain&quot; (EAD), onde ectoderma e endoderma estão diretamente justapostas 3-4. A EAD também actua como um centro de sinalização para influenciar os tecidos circundantes, incluindo a crista neural craniano, que forma as mandíbulas e outras regiões da face 5. Para identificar genes que contribuem para a função de EAD, uma técnica de &quot;transplante de face &#39;foi desenvolvido, em que o tecido transplantado de um dador para um embrião hospedeiro, após a remoção da região do hospedeiro correspondente. Seguindo o transplante, resultando desenvolvimento facial é avaliada. Assim, os efeitos da perda de função (LOF) ou ganho de função (GOF) de um gene específico em EAD são analisadas localmente, onde o restante do head e corpo é formado por um tecido do tipo selvagem. O transplante recíproco pode ser realizado, em que o tecido do tipo selvagem é transplantado em embriões com LOF mundial ou GOF em genes específicos. Transplante tem sido frequentemente usado em Xenopus e pintainho estuda 6. Por exemplo, o transplante de Xenopus abordou indução homogenetic neural, lente e competência neural, e migração da crista neural 7-10. Quail-chick enxerto quimérico analisou o desenvolvimento da placa neural anterior, cume neural anterior, crista neural, e os ossos cranianos 11-14. Esta é a primeira técnica de transplante para o estudo do desenvolvimento craniofacial em Xenopus. Esta técnica tem demonstrado um novo papel para os inibidores de Wnt Frzb1 e crescentes na regulação da formação de membrana basal na boca presuntivo 5. Xenopus laevis é um modelo ideal para o estudo do desenvolvimento craniofacial como embriões são grandes, desenvolver externamente, umand o rosto é facilmente visível, permitindo micromanipulação e imagem do desenvolvimento. Mecanismos subjacentes ao desenvolvimento facial aparecem conservado, indicando que as descobertas feitas no sapo fornecer uma visão sobre o desenvolvimento humano 4,15-16.

<table><tbody><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>VWR</td><td>14672-400</td><td>Vidro Lima&nbsp;</td></tr><tr><td>Tamanho 5 3/4 in</td><td>Pipeta de Transferência Graduada</td><td></td><td></td>com Plugue de Algodão</tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>16001-180</td><td>Descartável&nbsp;</td></tr><tr><td>#5/45 fórceps</td><td>Fine Science Tools by Dupont medical</td><td>11251-35</td><td>Angled 45&deg;</td></tr><tr><td>Fórceps Padrão</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-20</td><td>Reto; ponta serrilhada; tubulação capilar de aço inoxidável</td></tr><tr><td>(para agulhas)</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fibra</td></tr><tr><td>Tampa de deslizamento&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393 252</td><td>24 x 60 mm&nbsp; micro vidro de cobertura;</td></tr><tr>Extrator de Agulhas <td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument Co</td><td>Needle Puller: descontinuado Filamento: FB300B</td><td>O extrator de agulhas mais semelhante, atualmente disponível, é o P-97. Para filamentos, use filamentos de caixa quadrada Sutter de 3,00 mm, 3,0 mm de largura.</td></tr><tr>Extrator <td></td><td></td>de micropipetas <td>modelo P-80</td><td>Flaming / Brown</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope Lighting by Fostec</td><td>Fostec</td><td></td><td>Use uma caixa de luz com 2 braços de fibra óptica.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Suporte de Pino Niquelado</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>Diâmetro de Abertura da Mandíbula: 0-1 mm</td></tr><tr><td>Suporte de Pino Niquelado Moria</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Diâmetro de abertura da mandíbula: 0-1 mm</td></tr><tr><td>Agulhas de Tungstênio</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-05</td><td>0.125 mm Diâmetro da haste</td></tr><tr><td>Van Aken Plastalina</td><td>Blick</td><td>#33268-2981</td><td></td></tr><tr><td>Argila de Modelagem- branco, vermelho, ou Kit mMessage mMashine</td> SP6 ou T7 amarelo <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr></tbody></table>

transplantes faciais em<em&gt; xenopus laevis</em&gt; os embriões

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Defeitos congênitos craniofaciais ocorrer em 1 em cada 700 nascidos vivos, mas etiologia raramente é conhecido devido à compreensão limitada do desenvolvimento craniofacial. Para identificar onde vias de sinalização e tecidos agir durante padronização do rosto em desenvolvimento, a técnica &quot;transplante de face&quot; foi desenvolvido em embriões de rã Xenopus laevis. Uma região de tecido facial presuntivo (o &quot;extremo anterior Domain&quot; (EAD)) é removido a partir de um embrião dador na fase tailbud, e transplantado para um embrião hospedeiro da mesma fase, a partir do qual a região equivalente foi removido. Isto pode ser usado para gerar uma cara quimérico onde o tecido do hospedeiro ou de doadores tem uma perda ou ganho de função no gene, e / ou inclui um rótulo linhagem. Após a cura, o resultado do desenvolvimento é monitorizada, e indica os papéis da via de sinalização dentro do doador ou tecidos hospedeiros circundantes. Xenopus é um modelo útil para o desenvolvimento de cara, tal como a região facial é grande e prontamente umccessible para micromanipulação. Muitos embriões podem ser analisadas, durante um curto período de tempo já que o desenvolvimento ocorre rapidamente. Constatações do sapo são relevantes para o desenvolvimento humano, uma vez que os processos craniofaciais aparecer conservadas entre Xenopus e mamíferos.

Tecido transplantado deve ser totalmente inserida na cabeça hospedeiro após o transplante, conforme mostrado na Figura 3A, e tem uma ponte de vidro apropriadamente colocado na face do embrião, como mostrado na Figura 2bc. O tecido do doador transplantadas devem ser corretamente dimensionado para a abertura de acolhimento, para o transplante seja bem sucedido. O tecido EAD não devem sobressair a partir da cabeça, de forma alguma, como pode ser visto nas Figuras 3B e <str...

Uma técnica para o transplante &quot;Extreme Anterior Domain&quot; tecido facial entre embriões de Xenopus laevis foi desenvolvido. Tecidos podem ser movidos de um gene de expressão fundo em outra, permitindo o estudo das necessidades locais para o desenvolvimento craniofacial e sinalização para as interações entre as regiões faciais.

Transplantes faciais em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Os embriões

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

O objetivo geral deste procedimento é transplantar tecido facial da região anterior extrema, ou EAD, entre embriões de Xenopus laevis. Isso é realizado primeiramente removendo o tecido EAD de embriões doadores e de embriões receptores com origens genéticas diferentes. Em seguida, os explantes de EAD dos embriões doadores são inseridos nas faces dos embriões receptores.No passo final, os embriões transplantados são mantidos por 60 a 70 horas após a fertilização para observação. Em última análise, a microscopia de campo claro e de fluorescência pode ser utilizada para observar alterações no desenvolvimento craniofacial dos animais transplantados. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do desenvolvimento craniofacial, a fim de aprimorar nossa compreensão das deformidades craniofaciais, como novos sinais necessários para o desenvolvimento oral que surgem do domínio anterior extremo. Antes da operação, carregue tubos capilares em um puxador de agulhas e, em seguida, puxe quatro a seis agulhas, quebrando cada agulha de modo que a porção flexível da ponta de vidro, semelhante a um fio de cabelo, de dois a três milímetros, seja completamente removida.A ponta deve ser relativamente rígida, mas suficientemente estreita para ser usada como uma ferramenta de corte. Em seguida, acenda um bico de Bunsen e coloque a ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro na parte azul da chama, girando a pipeta de modo que a ponta derreta e o orifício se feche completamente, formando uma extremidade arredondada e selada. Para fazer pontes de vidro, utilize pinças longas de padrão comum para quebrar cuidadosamente pedaços de lamínula de 3 milímetros por 3 milímetros.Em seguida, segure o pedaço de lamínula com pinça e coloque o vidro na chama até que todas as quatro bordas amoleçam e se curvem para baixo, formando uma pequena cúpula de vidro. A seguir, forre um bocal plástico de 60 milímetros com massa de modelar vermelha, branca ou amarela. E preencha o bocal com 3%phi.Prepare uma solução 0,5 XMBS. Em seguida, utilize a pastilha flamejada, sua ferramenta de pipeta preferida, para fazer 40 a 60 depressões rasas de dois a três milímetros de profundidade — aproximadamente a espessura do corpo de um embrião em estágio 20 — na argila, 48 horas antes do experimento. Obtenha ovos de rãs fêmeas e fertilize-os in vitro.Em seguida, após injetar os embriões com membrana recoberta, mRNA de GFP e qualquer outra mensagem, armazene-os a 15 graus Celsius por 48 horas até que atinjam o estágio 19 a 20. No dia do experimento de transplante, use um microscópio fluorescente para selecionar os embriões injetados que apresentam fluorescência brilhante e uniforme. Após limpar a superfície de operação, o microscópio estereoscópico e as ferramentas com etanol 70%, use pinças Dumont número 5 45 para remover a membrana vitelina de cada embrião selecionado sob um microscópio estereoscópico.Em seguida, utilize uma pipeta plástica de transferência graduada com a ponta cortada para mover os embriões hospedeiros para o recipiente cirúrgico. Tenha cuidado para não tocar os embriões na interface ar-água. Insira os embriões com o lado posterior voltado para baixo nas depressões de argila e use a pinça para fechar suavemente a argila ao redor da base de cada embrião, deixando a cabeça projetada para fora da depressão. Para remover o doador com o rosto voltado para baixo, insira uma das agulhas puxadas na cabeça do embrião à esquerda da glândula de cimento, profundamente o suficiente para que ela atravesse o exterior do embrião, passando pela cabeça e penetrando no intestino anterior.Mova a agulha do lado esquerdo para o lado direito da cabeça, atravessando toda a largura da glândula cementária, para obter um corte limpo. Em seguida, posicione a agulha no início do corte, na borda esquerda da glândula cementária, e mova-a para cima até atingir a base do olho esquerdo, criando um corte vertical da borda esquerda da glândula cementária até a base do olho esquerdo. A seguir, posicione a agulha na borda direita da glândula cementária e mova-a para cima até atingir a base do olho direito, criando um corte vertical da borda direita da glândula cementária até a base do olho direito.Em seguida, para remover completamente o tecido, mova a agulha de baixo do olho esquerdo até abaixo do olho direito, criando um corte horizontal que soltará o tecido. Agora, empurre suavemente o tecido removido até a ponta da agulha e levante-o através do tampão até a região da placa que contém os embriões receptores. Remova o tecido do embrião receptor conforme demonstrado, descartando o receptor, o explante de EAD e inserindo o explante do doador no embrião receptor completo resultante.Uma vez que o tecido doador esteja corretamente posicionado e totalmente inserido com cuidado, coloque uma das pontes de vidro previamente preparadas sobre o rosto do embrião para manter o transplante no lugar, inserindo as extremidades da ponte na argila para estabilizá-la. Após a cirurgia, deixe os embriões em repouso, sem perturbações, à temperatura ambiente por duas a três horas. Em seguida, quando os transplantes tiverem cicatrizado, remova cuidadosamente as pontes de vidro dos embriões e a argila ao redor da base dos embriões.Em seguida, utilize uma pipeta plástica graduada para aspirar suavemente os embriões das suas depressões. Transfira os embriões para uma placa de Petri devidamente identificada, preenchida pela metade com 0,1 XMBS limpo suplementado com Gentamicina, e cultive os embriões a 15 a 18 graus Celsius por vários dias, até que atinjam o estágio 40. Troque a solução de MBS diariamente e observe o tecido transplantado por fluorescência para confirmar que o explante permanece cicatrizado no lugar.Os tecidos transplantados devem ser totalmente inseridos na cabeça do hospedeiro após o transplante, conforme acabou de ser demonstrado, e devem ter o tamanho correto em relação à abertura do hospedeiro para que o transplante seja bem-sucedido. O tecido EAD não deve protrair da cabeça de forma alguma, como pode ser observado nestas duas imagens de explantes posicionados incorretamente. Além disso, o transplante facial não deve ser rotacionado em relação à sua posição no corpo do doador, conforme mostrado aqui.Após várias horas, o tecido transplantado e a face circundante devem cicatrizar, e no dia seguinte, o embrião deverá apresentar-se como no exemplo mostrado nestas imagens, sendo que a microscopia de fluorescência acabada de demonstrar pode ser usada para confirmar que o transplante permaneceu no lugar durante o processo de cicatrização. No estágio 42, o tecido controle transplantado contribuirá para a boca e permanecerá fluorescente verde. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como transplantar tecido EAD de um embrião para outro.Facilitar o uso deste método para identificar qual camada germinativa ou região do DEA é mais crucial para o desenvolvimento facial.

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Research

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