Enzimas de Restrição
Enzimas de restrição, ou endonucleases de restrição, são usadas em uma variedade de diferentes aplicações na biologia molecular. Essas enzimas reconhecem e cortam uma sequência específica de DNA, chamada de local de restrição. O vídeo que você está prestes a assistir fornece algumas informações de fundo sobre essas moléculas milagrosas e mostra como configurar uma enzime de restrição digestão.
De onde vêm as enzimas de restrição? Essas enzimas são uma adaptação de bactérias que agem como um mecanismo de defesa contra vírus conhecidos como bacteriófagos. Graças à adição de grupos de metila a locais de enzimas de restrição no DNA bacteriano, enzimas de restrição só reconhecem e cortam o DNA de phage, prevenindo assim a infecção.
Enzimas de restrição têm nomes bem estranhos. Por exemplo, HindiII, NotI, EcoRI e BamHI. As três primeiras letras de um nome enzimád me refere ao organismo do qual foi isolado. Por exemplo, a enzima de restrição EcoRI foi isolada da E. coli. A quarta letra, se necessário, refere-se à cepa bacteriana da qual a enzima foi isolada. O numeral romano indica se é a primeira, segunda, terceira, enzima isolada desse organismo em particular.
Enzimas de restrição reconhecem uma sequência de nucleotídeos, geralmente de quatro a oito pares de base de comprimento, chamado de local de reconhecimento. Em nucleotídeos específicos dentro da sequência, a enzima quebrará as ligações fosfodiester na espinha dorsal do DNA. Os sites de reconhecimento são geralmente palindômicos, o que significa que a sequência lê os mesmos para frente e para trás. Quando o palíndromo é encontrado em fios complementares de molécula de DNA é chamado de palíndromo invertido-repetitivo.
Enzimas de restrição podem deixar diferentes tipos de extremidades uma vez que o DNA é cortado: extremidades pegajosas e extremidades cegas. As extremidades pegajosas deixam 3' e 5' saliências enquanto as extremidades contundentes não deixam saliências. O tipo de extremidade dita como o fragmento de DNA isolado pela restrição do digestor enzimáte será recombinado com outros fragmentos de DNA em um processo conhecido como ligadura.
Uma digestão enzimápica de restrição deve ser cuidadosamente planejada. Uma reação de digestão normalmente consiste no seguinte: água deionizada, o DNA que vai ser cortado, tampão específico para a enzima que você vai usar, e às vezes uma proteína chamada albumina de soro bovino ou BSA. A BSA estabilizará a reação impedindo que a enzima grude na lateral do recipiente que abriga o digestor. Cada enzima de restrição pode potencialmente ter diferentes condições de buffer, temperaturas de incubação e requisitos para BSA. Fornecedores de enzimas de restrição terão recursos que se pode verificar para obter todas as informações necessárias.
Para começar a configurar o digestor, recupere a enzima de restrição do congelador ou da geladeira. Mantenha a enzima de restrição no gelo ou um recipiente resistente térmico para garantir que haja atividade ideal para reações futuras. A um tubo de microfuça devem ser adicionados na seguinte ordem. Primeiro, um volume de água estéril e livre de nuclease que produzirá um volume final de reação de 20μL. Em seguida, 10x Restrição Enzima Tampão, em seguida, BSA, se necessário, até 1μg de DNA, e 2-10 unidades de enzima. As unidades são definidas como a quantidade de enzima necessária para produzir um digestor completo de 1μg de DNA de controle em 60 minutos a 37°C em um volume de reação de 50μL. Depois, misture por vórtice e, em seguida, centrífuga brevemente a 12.000xg em um microcentrifuuge para coletar o conteúdo na parte inferior do tubo. Em seguida, incubar a uma temperatura ideal para sua enzima de restrição, geralmente 37°C em um bloco de aquecimento por 1 a 4 horas.
Uma vez que o seu digestor tenha concluído, é uma boa ideia incubar a mistura de reação a 65°C para inativar as enzimas de restrição. Embora as enzimas de restrição cortem especificamente o local na maior parte do tempo, tempos de incubação prolongados podem levar à atividade estelar, que está cortando em locais semelhantes, mas distintos de seus locais típicos de digestão.
Após a inativação, o DNA deve ser executado em um gel de agarose para garantir que o digestão tenha sido bem sucedido.
Aqui estão algumas dicas úteis para executar seus digestores e garantir o sucesso.
Às vezes você pode encontrar-se em uma situação onde múltiplas enzimas precisam ser usadas para gerar um fragmento de DNA específico. Neste caso, você precisa verificar se as condições do tampão e as temperaturas de incubação são compatíveis entre as duas enzimas, se assim for, então você pode realizar uma digestão dupla e ter ambas as enzimas cortadas na mesma reação. Às vezes, no entanto, você encontrará incompatibilidade nas condições de reação entre as duas enzimas, e neste caso a solução alternativa é usar as enzimas sequencialmente. Por exemplo, o digestor pode ser realizado com uma enzima primeiro, e, em seguida, a composição do buffer, pode ser alterada para ser ideal para a segunda enzima. Outra maneira de superar a incompatibilidade do buffer e realizar um digestão sequencial é purificar o DNA após a digestão inicial e, em seguida, realizar a segunda digestão.
Usar controles é uma boa maneira de entender por que uma digestão pode dar errado. Por exemplo, um controle sem enzimas permitirá verificar a integridade da amostra de DNA e determinar se a atividade exonuclease está presente. O uso de DNA de controle com locais de restrição conhecidos permite que a atividade da enzima seja testada.
Agora que vimos como os digestos são realizados, vamos dar uma olhada em várias maneiras de enzimas de restrição podem ser usadas.
Enzimas de restrição podem ser utilizadas diagnosticicamente, a fim de identificar amostras específicas. Carregando um digestor em um chip especializado e, em seguida, colocando esse chip em uma máquina chamada bioanalzer. Os pesquisadores podem examinar os tamanhos dos fragmentos de DNA, produzidos pelo digestor, a fim de determinar a autenticidade das amostras de peixes. Os diferentes padrões de banda do mesmo gene de uma determinada espécie, ou neste caso diferentes espécies, são chamados de polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição.
Enzimas de restrição também podem ser usadas no subcloamento para isolar um fragmento de DNA de um plasmídeo e inserir em outro, para que o fragmento desejado possa ser replicado usando bactérias.
Ao empregar a reação da cadeia de polimerase, ou PCR para introduzir locais de restrição em genes em locais muito específicos, enzimas de restrição podem ser usadas para determinar a presença de diferenças de nucleotídeos únicos em formas alternativas do mesmo gene, ou alelo. Estes polimorfismos de nucleotídeos únicos, ou SNPs, são difíceis de detectar apenas com PCR e eletroforese gel. Com a introdução do local de restrição dentro do SNP, um simples digestor pode distinguir entre os alelos.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre enzimas de restrição. Você aprendeu de onde essas enzimas vêm, foi ensinado alguns fundamentos sobre como elas funcionam, viu como configurar um digestor, e aprendeu como enzimas de restrição podem ser usadas em biologia molecular. Como sempre, obrigado por assistir!
Enzimas de restrição ou endonucleases reconhecem e cortam DNA em uma sequência específica. Essas enzimas ocorrem naturalmente em bactérias como uma de…
Enzimas de restrição, ou endonucleases de restrição, são usadas em uma variedade de diferentes aplicações na biologia molecular. Essas enzimas reconhecem e cortam uma sequência específica de DNA, chamada de local de restrição. O vídeo que você está prestes a assistir fornece algumas informações de fundo sobre essas moléculas milagrosas e mostra como configurar uma enzime de restrição digestão.
De onde vêm as enzimas de restrição? Essas enzimas são uma adaptação de bactérias que agem como um mecanismo de defesa contra vírus conhecidos como bacteriófagos. Graças à adição de grupos de metila a locais de enzimas de restrição no DNA bacteriano, enzimas de restrição só reconhecem e cortam o DNA de phage, prevenindo assim a infecção.
Enzimas de restrição têm nomes bem estranhos. Por exemplo, HindiII, NotI, EcoRI e BamHI. As três primeiras letras de um nome enzimád me refere ao organismo do qual foi isolado. Por exemplo, a enzima de restrição EcoRI foi isolada da E. coli. A quarta letra, se necessário, refere-se à cepa bacteriana da qual a enzima foi isolada. O numeral romano indica se é a primeira, segunda, terceira, enzima isolada desse organismo em particular.
Enzimas de restrição reconhecem uma sequência de nucleotídeos, geralmente de quatro a oito pares de base de comprimento, chamado de local de reconhecimento. Em nucleotídeos específicos dentro da sequência, a enzima quebrará as ligações fosfodiester na espinha dorsal do DNA. Os sites de reconhecimento são geralmente palindômicos, o que significa que a sequência lê os mesmos para frente e para trás. Quando o palíndromo é encontrado em fios complementares de molécula de DNA é chamado de palíndromo invertido-repetitivo.
Enzimas de restrição podem deixar diferentes tipos de extremidades uma vez que o DNA é cortado: extremidades pegajosas e extremidades cegas. As extremidades pegajosas deixam 3' e 5' saliências enquanto as extremidades contundentes não deixam saliências. O tipo de extremidade dita como o fragmento de DNA isolado pela restrição do digestor enzimáte será recombinado com outros fragmentos de DNA em um processo conhecido como ligadura.
Uma digestão enzimápica de restrição deve ser cuidadosamente planejada. Uma reação de digestão normalmente consiste no seguinte: água deionizada, o DNA que vai ser cortado, tampão específico para a enzima que você vai usar, e às vezes uma proteína chamada albumina de soro bovino ou BSA. A BSA estabilizará a reação impedindo que a enzima grude na lateral do recipiente que abriga o digestor. Cada enzima de restrição pode potencialmente ter diferentes condições de buffer, temperaturas de incubação e requisitos para BSA. Fornecedores de enzimas de restrição terão recursos que se pode verificar para obter todas as informações necessárias.
Para começar a configurar o digestor, recupere a enzima de restrição do congelador ou da geladeira. Mantenha a enzima de restrição no gelo ou um recipiente resistente térmico para garantir que haja atividade ideal para reações futuras. A um tubo de microfuça devem ser adicionados na seguinte ordem. Primeiro, um volume de água estéril e livre de nuclease que produzirá um volume final de reação de 20μL. Em seguida, 10x Restrição Enzima Tampão, em seguida, BSA, se necessário, até 1μg de DNA, e 2-10 unidades de enzima. As unidades são definidas como a quantidade de enzima necessária para produzir um digestor completo de 1μg de DNA de controle em 60 minutos a 37°C em um volume de reação de 50μL. Depois, misture por vórtice e, em seguida, centrífuga brevemente a 12.000xg em um microcentrifuuge para coletar o conteúdo na parte inferior do tubo. Em seguida, incubar a uma temperatura ideal para sua enzima de restrição, geralmente 37°C em um bloco de aquecimento por 1 a 4 horas.
Uma vez que o seu digestor tenha concluído, é uma boa ideia incubar a mistura de reação a 65°C para inativar as enzimas de restrição. Embora as enzimas de restrição cortem especificamente o local na maior parte do tempo, tempos de incubação prolongados podem levar à atividade estelar, que está cortando em locais semelhantes, mas distintos de seus locais típicos de digestão.
Após a inativação, o DNA deve ser executado em um gel de agarose para garantir que o digestão tenha sido bem sucedido.
Aqui estão algumas dicas úteis para executar seus digestores e garantir o sucesso.
Às vezes você pode encontrar-se em uma situação onde múltiplas enzimas precisam ser usadas para gerar um fragmento de DNA específico. Neste caso, você precisa verificar se as condições do tampão e as temperaturas de incubação são compatíveis entre as duas enzimas, se assim for, então você pode realizar uma digestão dupla e ter ambas as enzimas cortadas na mesma reação. Às vezes, no entanto, você encontrará incompatibilidade nas condições de reação entre as duas enzimas, e neste caso a solução alternativa é usar as enzimas sequencialmente. Por exemplo, o digestor pode ser realizado com uma enzima primeiro, e, em seguida, a composição do buffer, pode ser alterada para ser ideal para a segunda enzima. Outra maneira de superar a incompatibilidade do buffer e realizar um digestão sequencial é purificar o DNA após a digestão inicial e, em seguida, realizar a segunda digestão.
Usar controles é uma boa maneira de entender por que uma digestão pode dar errado. Por exemplo, um controle sem enzimas permitirá verificar a integridade da amostra de DNA e determinar se a atividade exonuclease está presente. O uso de DNA de controle com locais de restrição conhecidos permite que a atividade da enzima seja testada.
Agora que vimos como os digestos são realizados, vamos dar uma olhada em várias maneiras de enzimas de restrição podem ser usadas.
Enzimas de restrição podem ser utilizadas diagnosticicamente, a fim de identificar amostras específicas. Carregando um digestor em um chip especializado e, em seguida, colocando esse chip em uma máquina chamada bioanalzer. Os pesquisadores podem examinar os tamanhos dos fragmentos de DNA, produzidos pelo digestor, a fim de determinar a autenticidade das amostras de peixes. Os diferentes padrões de banda do mesmo gene de uma determinada espécie, ou neste caso diferentes espécies, são chamados de polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição.
Enzimas de restrição também podem ser usadas no subcloamento para isolar um fragmento de DNA de um plasmídeo e inserir em outro, para que o fragmento desejado possa ser replicado usando bactérias.
Ao empregar a reação da cadeia de polimerase, ou PCR para introduzir locais de restrição em genes em locais muito específicos, enzimas de restrição podem ser usadas para determinar a presença de diferenças de nucleotídeos únicos em formas alternativas do mesmo gene, ou alelo. Estes polimorfismos de nucleotídeos únicos, ou SNPs, são difíceis de detectar apenas com PCR e eletroforese gel. Com a introdução do local de restrição dentro do SNP, um simples digestor pode distinguir entre os alelos.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre enzimas de restrição. Você aprendeu de onde essas enzimas vêm, foi ensinado alguns fundamentos sobre como elas funcionam, viu como configurar um digestor, e aprendeu como enzimas de restrição podem ser usadas em biologia molecular. Como sempre, obrigado por assistir!
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Enzimas de restrição, ou endonucleases de restrição, são usadas em uma variedade de diferentes aplicações na biologia molecular. Essas enzimas reconhecem e cortam uma sequência específica de DNA, chamada de local de restrição. O vídeo que você está prestes a assistir fornece algumas informações de fundo sobre essas moléculas milagrosas e mostra como configurar uma enzime de restrição digestão.
De onde vêm as enzimas de restrição? Essas enzimas são uma adaptação de bactérias que agem como um mecanismo de defesa contra vírus conhecidos como bacteriófagos. Graças à adição de grupos de metila a locais de enzimas de restrição no DNA bacteriano, enzimas de restrição só reconhecem e cortam o DNA de phage, prevenindo assim a infecção.
Enzimas de restrição têm nomes bem estranhos. Por exemplo, HindiII, NotI, EcoRI e BamHI. As três primeiras letras de um nome enzimád me refere ao organismo do qual foi isolado. Por exemplo, a enzima de restrição EcoRI foi isolada da E. coli. A quarta letra, se necessário, refere-se à cepa bacteriana da qual a enzima foi isolada. O numeral romano indica se é a primeira, segunda, terceira, enzima isolada desse organismo em particular.
Enzimas de restrição reconhecem uma sequência de nucleotídeos, geralmente de quatro a oito pares de base de comprimento, chamado de local de reconhecimento. Em nucleotídeos específicos dentro da sequência, a enzima quebrará as ligações fosfodiester na espinha dorsal do DNA. Os sites de reconhecimento são geralmente palindômicos, o que significa que a sequência lê os mesmos para frente e para trás. Quando o palíndromo é encontrado em fios complementares de molécula de DNA é chamado de palíndromo invertido-repetitivo.
Enzimas de restrição podem deixar diferentes tipos de extremidades uma vez que o DNA é cortado: extremidades pegajosas e extremidades cegas. As extremidades pegajosas deixam 3' e 5' saliências enquanto as extremidades contundentes não deixam saliências. O tipo de extremidade dita como o fragmento de DNA isolado pela restrição do digestor enzimáte será recombinado com outros fragmentos de DNA em um processo conhecido como ligadura.
Uma digestão enzimápica de restrição deve ser cuidadosamente planejada. Uma reação de digestão normalmente consiste no seguinte: água deionizada, o DNA que vai ser cortado, tampão específico para a enzima que você vai usar, e às vezes uma proteína chamada albumina de soro bovino ou BSA. A BSA estabilizará a reação impedindo que a enzima grude na lateral do recipiente que abriga o digestor. Cada enzima de restrição pode potencialmente ter diferentes condições de buffer, temperaturas de incubação e requisitos para BSA. Fornecedores de enzimas de restrição terão recursos que se pode verificar para obter todas as informações necessárias.
Para começar a configurar o digestor, recupere a enzima de restrição do congelador ou da geladeira. Mantenha a enzima de restrição no gelo ou um recipiente resistente térmico para garantir que haja atividade ideal para reações futuras. A um tubo de microfuça devem ser adicionados na seguinte ordem. Primeiro, um volume de água estéril e livre de nuclease que produzirá um volume final de reação de 20μL. Em seguida, 10x Restrição Enzima Tampão, em seguida, BSA, se necessário, até 1μg de DNA, e 2-10 unidades de enzima. As unidades são definidas como a quantidade de enzima necessária para produzir um digestor completo de 1μg de DNA de controle em 60 minutos a 37°C em um volume de reação de 50μL. Depois, misture por vórtice e, em seguida, centrífuga brevemente a 12.000xg em um microcentrifuuge para coletar o conteúdo na parte inferior do tubo. Em seguida, incubar a uma temperatura ideal para sua enzima de restrição, geralmente 37°C em um bloco de aquecimento por 1 a 4 horas.
Uma vez que o seu digestor tenha concluído, é uma boa ideia incubar a mistura de reação a 65°C para inativar as enzimas de restrição. Embora as enzimas de restrição cortem especificamente o local na maior parte do tempo, tempos de incubação prolongados podem levar à atividade estelar, que está cortando em locais semelhantes, mas distintos de seus locais típicos de digestão.
Após a inativação, o DNA deve ser executado em um gel de agarose para garantir que o digestão tenha sido bem sucedido.
Aqui estão algumas dicas úteis para executar seus digestores e garantir o sucesso.
Às vezes você pode encontrar-se em uma situação onde múltiplas enzimas precisam ser usadas para gerar um fragmento de DNA específico. Neste caso, você precisa verificar se as condições do tampão e as temperaturas de incubação são compatíveis entre as duas enzimas, se assim for, então você pode realizar uma digestão dupla e ter ambas as enzimas cortadas na mesma reação. Às vezes, no entanto, você encontrará incompatibilidade nas condições de reação entre as duas enzimas, e neste caso a solução alternativa é usar as enzimas sequencialmente. Por exemplo, o digestor pode ser realizado com uma enzima primeiro, e, em seguida, a composição do buffer, pode ser alterada para ser ideal para a segunda enzima. Outra maneira de superar a incompatibilidade do buffer e realizar um digestão sequencial é purificar o DNA após a digestão inicial e, em seguida, realizar a segunda digestão.
Usar controles é uma boa maneira de entender por que uma digestão pode dar errado. Por exemplo, um controle sem enzimas permitirá verificar a integridade da amostra de DNA e determinar se a atividade exonuclease está presente. O uso de DNA de controle com locais de restrição conhecidos permite que a atividade da enzima seja testada.
Agora que vimos como os digestos são realizados, vamos dar uma olhada em várias maneiras de enzimas de restrição podem ser usadas.
Enzimas de restrição podem ser utilizadas diagnosticicamente, a fim de identificar amostras específicas. Carregando um digestor em um chip especializado e, em seguida, colocando esse chip em uma máquina chamada bioanalzer. Os pesquisadores podem examinar os tamanhos dos fragmentos de DNA, produzidos pelo digestor, a fim de determinar a autenticidade das amostras de peixes. Os diferentes padrões de banda do mesmo gene de uma determinada espécie, ou neste caso diferentes espécies, são chamados de polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição.
Enzimas de restrição também podem ser usadas no subcloamento para isolar um fragmento de DNA de um plasmídeo e inserir em outro, para que o fragmento desejado possa ser replicado usando bactérias.
Ao empregar a reação da cadeia de polimerase, ou PCR para introduzir locais de restrição em genes em locais muito específicos, enzimas de restrição podem ser usadas para determinar a presença de diferenças de nucleotídeos únicos em formas alternativas do mesmo gene, ou alelo. Estes polimorfismos de nucleotídeos únicos, ou SNPs, são difíceis de detectar apenas com PCR e eletroforese gel. Com a introdução do local de restrição dentro do SNP, um simples digestor pode distinguir entre os alelos.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre enzimas de restrição. Você aprendeu de onde essas enzimas vêm, foi ensinado alguns fundamentos sobre como elas funcionam, viu como configurar um digestor, e aprendeu como enzimas de restrição podem ser usadas em biologia molecular. Como sempre, obrigado por assistir!
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Q1: Where do restriction enzymes come from and why do bacteria produce them?
Restriction enzymes are a bacterial defense mechanism against bacteriophages, viruses that infect bacteria. Bacteria produce these enzymes to recognize and cut invading phage DNA while protecting their own genomic DNA through methylation. This natural adaptation allows bacteria to survive viral infection.
Q2: What do the letters and numbers in restriction enzyme names mean?
Restriction enzyme names encode their origin and discovery order. The first three letters identify the organism source, such as EcoRI from E. coli. The fourth letter, if present, indicates the bacterial strain. Roman numerals denote whether it was the first, second, or third enzyme isolated from that organism.
Q3: What is the difference between sticky ends and blunt ends in restriction digests?
Sticky ends leave 3' and 5' overhangs after enzyme cleavage, while blunt ends produce no overhangs. The type of end determines how DNA fragments can be recombined with other fragments through DNA ligation reactions principle procedure and applications. Sticky ends are generally more useful for cloning applications.
Q4: What components are needed to set up a restriction enzyme digest?
A typical digest requires sterile, nuclease-free water, the DNA to be cut, buffer specific to the enzyme, and sometimes bovine serum albumin (BSA) to stabilize the reaction. BSA prevents the enzyme from sticking to the tube walls. Suppliers provide detailed information about buffer conditions, incubation temperatures, and BSA requirements for each enzyme.
Q5: How should a restriction enzyme digest be incubated and why is heat inactivation important?
Digests are typically incubated at 37°C in a heating block for 1 to 4 hours. After digestion completes, heat inactivation at 65°C stops enzyme activity and prevents star activity, which is unwanted cutting at sites similar to the recognition site. This ensures accurate, specific digestion results.
Q6: What is a double digest and when would you use sequential digestion instead?
A double digest uses two restriction enzymes simultaneously if their buffer conditions and incubation temperatures are compatible. If enzymes are incompatible, sequential digestion is used: perform the first digest, alter buffer conditions for the second enzyme, or purify DNA between digests. This approach ensures both enzymes can cut effectively.
Q7: How can restriction enzymes be used to identify DNA samples or detect genetic variations?
Restriction enzymes produce different banding patterns called restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) that identify samples or species. By introducing restriction sites at specific locations using PCR, enzymes can detect single nucleotide polymorphisms (SNPs) that distinguish between alleles. These applications enable diagnostic identification and genetic analysis.
Capítulos neste vídeo
0:00
Overview
0:38
Background and Nomenclature
1:53
Basic Principles
3:03
Setting up a Restriction Enzyme Digest
5:55
Hints
7:35
Applications
9:17
Summary