Name: Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Aprenda micro-iontoforese rápida de glutamato e GABA para investigar a integração de sinais pós-sinápticos em neurônios. Esta técnica de eletrofisiologia permite estudar com precisão como entradas excitatórias e inibitórias são processadas.

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Agradecemos Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann e Walker Jackson para a leitura atenta do manuscrito. Os autores receberam financiamento que foi fornecido pelo Ministério da pesquisa MIWF do estado Renânia do Norte-Westfalia (SR), o BMBF-Projekträger DLR colaboração EUA-alemão em neurociência computacional (CRCNS; SR), Centros de Excelência em Doenças Neurodegenerativas (COEN; SR), e da Universidade de Bonn programa de financiamento intramural (BONFOR; SR).

1. Requisitos do Sistema <ol><li> Sistema de microscópio: boa visualização do dendrito é crucial. Se possível, use um sistema de microscópio de varredura a laser de dois fótons. Em nossos experimentos utilizamos um Scope TRIM II, LaVision Biotec, Bielefeld, Alemanha ou um sistema de Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin equipado com um Ti: Safira ultra-pulsada do laser (Chameleon Ultra II, Coherent) e um objetivo de alto NA (60X, 0,9 NA, Olympus) para visualizar os dendritos que tinham enchido com um corante fluorescente através da pipeta patch. Embora foto-dano é pensado para ser menos intensa utilizando a digitalização em 2 de fotões, reduzir a potência do laser (abaixo de 8 MW no tecido) e os tempos de temporização (inferior a 1 ms), ou tanto quanto possível. </li><li> Uma segunda possibilidade é a de desencadear uma fonte de luz de fluorescência de campo amplo (diodo emissor de luz ou uma lâmpada fluorescente) em sincronia com a aquisição de reduzir o tempo de exposição tanto quanto possível. Temos usado um monocromador com uma fonte de luz integrada (TILLPhotônicos, Grafelfing, Alemanha) em uma Zeiss Axioskop 2 FS microscópio vertical que foi equipado com iluminação infravermelha Dodt contraste (TILLPhotonics, Gräfelfing, Alemanha). Em nossos experimentos tempos de exposição variaram de normalmente 10 ms máx. 30 ms. </li><li> Usar um amplificador de micro-iontoforese rápido, por exemplo, um micro-sistema de iontoforese dois canais MVCS-C-02 (NPI electrónico, Tamm, Alemanha), com a compensação de capacitância rápido. Os microeléctrodos de iontoforese de ponta fina têm resistências de 25-100 mohms (crucialmente, dependendo do tamanho e da forma da ponta de pipeta), e tempos de subida rápida só pode ser alcançada se a compensação de capacitância do amplificador iontoforético está sintonizado de maneira óptima. Esta compensação rápida é necessária para aplicar os impulsos de corrente com um rápido início e curta na gama de sub-milisegundo para a pipeta iontoforético e, assim, para ejectar o transmissor com uma elevada resolução espacial no local tamanhos inferiores a 1 mícron 13. Amplificadores de iontoforese são alassim disponível a partir de várias outras empresas, que não têm testado em nosso laboratório. Estes dispositivos são de nosso conhecimento não equipada com circuito de compensação de capacitância. </li></ol> 2. Preparar soluções <ol><li> Prepare líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) e solução interna, uma vez que é necessário para o projeto experimental. A única adição à solução interna, que é necessário, é um corante fluorescente vermelho ou verde (por exemplo, 50 a 200 fiM Alexa Fluor 488 ou 594 hidrazida, Invitrogen), dependendo do equipamento óptico. Aqui, um exemplo para ACSF sacarose, que pode ser utilizada para dissecação, em mM: NaCl 60, ​​100 de sacarose, 2,5 de KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, NaHCO 3 26, CaCl 2 1, 5 MgCl 2, 20 de glicose, e para ACSF normais solução para as experiências de patch-clamp em mM: 125 de NaCl, 3 de KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 2,6 CaCl2, 1,3 de MgCl2, 15 de glicose. </li><li>Carbogenize (95% O2, 5% de CO 2) todas as soluções extracelulares constantemente. </li><li> Preparar solução interna, por exemplo, em mM: 140 de K-gluconato, 7 KCl, HEPES 5-ácido, 0,5 MgCl2, 5 fosfocreatina, 0,16 EGTA, com 50-200 uM Alexa 488. </li><li> Para micro-glutamato iontoforese preparar uma solução com ácido glutâmico 150 mM e ajustar o pH para 7,0 com NaOH. Adicionar 50 -200 mM Alexa Fluor 488 ou 594 hidrazida (Invitrogen) para visualização. </li><li> Para iontoforese do GABA preparar uma solução 1 M de GABA e ajustar o pH a 5 com HCl 15. A este pH o GABA está carregada, então só pode ser aplicado utilizando a iontoforese. Por favor, note que o baixo pH da solução ejetado para o espaço extracelular pode efetuar-se a transmissão GABA 16,17. Proteger a solução da luz GABA e freqüentemente preparar nova solução estoque GABA, uma vez que uma solução mais velhos podem perder a sua eficácia. </li><li> Se é difícil ver os eventos GABAérgicos, aparelhagem hiGH Cl - solução interna força motriz, por exemplo, por deixar de fora de KCl, pode ajudar a visualizar os eventos GABAérgicos para ver se a iontoforese GABA está a trabalhar, no entanto para investigar integração sináptica uma força motriz fisiológico pode ser recomendada. Para a detecção geral de pequenos eventos GABAérgicos, um protocolo mostrado na Figura 8C pode ajudar. </li></ol> 3. Puxe e testar as Pipettes Iontoforese <ol><li> Em geral, puxando as pipetas certas é talvez o passo mais importante para conseguir iontoforese neurotransmissor controlada. Quando se utiliza a iontoforese em cultura de células, é possível puxar eléctrodos muito finos semelhantes a microeléctrodos afiados 10. Em experimentos de patch-clamp em fatias agudas, no entanto, estas pipetas muito finas sobre a superfície curva da fatia quando eles são reduzidos no tecido com um ângulo, o que torna impossível atingir dendritos mais profundas. </li><li> Portanto, puxe uma pipeta com uma ponta muito pequena, de modo que nenhum neurotransmitter pode vazar, mas a ponta tem de ser ainda suficientemente rígidos para penetrar no tecido (Figura 2). Por exemplo, use 150 GB F 8P pipetas classe (Science Products, Hofheim, Alemanha) e um puxador horizontal (por exemplo, um extrator DMZ-Universal, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, na Alemanha, ou um extrator P-97, Sutter Instrument Company , Novato, CA), com várias etapas, puxando para alcançar uma abertura pequena, mas também a uma curta recolector com um ângulo agudo (Figura 2 e Tabela 2). </li><li> Também é possível a utilização de pipetas de vidro de quartzo para puxar pipetas iontoforéticos 10. Estes são suposto ter melhores propriedades mecânicas e ser mais confiável, no entanto puxadores de laser especiais são necessários. Mas também é possível obter bons resultados com pipetas de vidro normais, os quais são normalmente utilizados para puxar pipetas remendo. </li><li> Teste o desempenho da pipeta e resistência em uma câmara sem tecido, antes de usá-los pela primeiratempo, uma vez que fugas de glutamato pode danificar os tecidos. </li><li> Configure o amplificador iontoforese corretamente. Em seguida, preencha a pipeta com o neurotransmissor e solução contendo corante e colocá-lo no banho (ACSF). </li><li> Compensar a capacitância (Figura 3). Normalmente pipetas muito afiada terá uma capacidade maior do que os contundentes. </li><li> Verificar a resistência da pipeta: O amplificador de micro-iontoforese usado aqui tem uma construção em característica para a medição da resistência da pipeta. Ela evoca breves pulsos de teste rectangulares, que podem ser monitorizados com um osciloscópio padrão ou uma placa de A / D ligado a um computador com o software de aquisição. Dependendo da forma e do tamanho do bico, a ponta deve ter uma resistência de entre 25-90 mohms. </li><li> Concentre-se na ponta com uma objetiva de imersão em água ou 60X 40X e mudar a imagem fluorescente e, se possível, zoom in Se os vazamentos de corante fluorescente para fora da ponteira, aplique uma pequena positivo (no caso da gluTamate) ou negativo (no caso de GABA, Figura 4) reter corrente (&lt;0,02 mA). Se isso não ajudar a cancelar o vazamento, mudar a pipeta. </li><li> Aplicar uma forte corrente passo ou utilizar o disparador manual e monitorar a ponta na imagem de fluorescência para verificar se a solução pode ser ejectado para fora da pipeta. Como mencionado acima, a polaridade do impulso de corrente é, dependendo da carga da molécula que é suposto ser ejectado. Para ejectar o glutamato é uma corrente negativa e para o GABA uma corrente positiva (Figura 4). </li><li> Bolhas de ar na pipeta que o bloco de ejeção de tinta e transmissor, pode ser apuradas através da aplicação de uma alta corrente de ejeção várias vezes. </li><li> Tomados em conjunto, se não houver nenhum vazamento visível e ejecção teste foi bem sucedido, a capacitância de compensação e iniciar a experiência. </li><li> Cuidado: Uma vez que a compensação de capacitância é conseguido através de um circuito de realimentação, este circuito pode ultrapassar ou oscilar, se for overcompensated. Com cuidado, use a configuração de discagem para a compensação de capacitância. </li><li> Dependendo da estabilidade puxador é por vezes necessário para ajustar as definições puxador ao longo do tempo, uma vez que o filamento pode ter mudado propriedades. No entanto, uma vez que, se uma boa pipeta é concebido, que pode ser usado para vários dias. Portanto, depois de terminada a experiência armazenar a pipeta iontoforético em um recipiente fechado, sem danificar a ponta. </li><li> Para a próxima experimento encher a pipeta com a solução de neurotransmissor, aplicar vários pulsos ejetar fortes para limpar a ponta e, em seguida, verificar se as propriedades (por exemplo, resistência) mudança significativa. Em seguida, compensar a capacitância e usar novamente a pipeta. Não use uma única pipeta com soluções diferentes neurotransmissores. </li></ol> 4. Prepare as fatias de cérebro <ol><li> Se micro-iontoforese é usado pela primeira vez definitivamente preparar as fatias após o estabelecimento de um programa de trabalho do extrator de forma fiável. </li> &lt;procedimentos li&gt; Perform anestesia e decapitação, em conformidade com as diretrizes de cuidados de animais da sua instituição ou autoridade local. </li><li> Após a remoção do cérebro, transferi-lo para ACSF gelado de sacarose (ver protocolo 2.1). </li><li> Cortar a região de interesse em fatias de espessura adequada (por exemplo, 300 mm). </li><li> Incubar as fatias em ACSF sacarose a 35 ° C durante 30 min. Em seguida, transferi-los para uma câmara de retenção submersa contendo ACSF normal, à temperatura ambiente. </li><li> Durante a preparação e a experiência carbogenize ACSF em torno das fatias com 95% de O2, 5% de CO 2. </li></ol> 5. Estabelecer uma gravação de célula inteira <ol><li> Posicionar a pipeta iontoforese (s) já perto da superfície fatia antes de remendar uma célula, a fim de evitar o posicionamento de longa duração, após o que estabelece o modo de célula inteira. </li><li> Puxe uma baixa resistência remendo pipeta (3-5 mohms), preenchê-lo com o dYE contendo solução interna e aplicar a pressão positiva para a pipeta (30 - 60 mbar). </li><li> Entre no banho e abordagem da célula sob a orientação visual (contraste Dodt infravermelho ou dois contraste da imagem gradiente fóton). </li><li> Monitorar a resistência da pipeta com um pulso de teste (por exemplo, -10 mV, 20 ms) no modo de fixação de tensão. Ao tocar no tecido corrigir o potencial de deslocamento. </li><li> Aproxime-se do celular e empurre a ponta da pipeta até uma &quot;covinha&quot; pode ser visto claramente. Imediatamente após a libertação de pressão da pipeta, aplicam-se 40 - 60 mbar de pressão negativa e mudar o potencial da membrana a -65 mV. </li><li> Quando a corrente de retenção atinge valores abaixo de 100 pA, solte a pressão negativa. </li><li> Depois de estabelecer um selo giga (resistência&gt; 1 GÊ), ruptura da membrana com um curto, forte sucção da pipeta ou breve sobrecompensação do circuito de compensação de capacitância. </li><li> Dependendo do modo (fixador de tensão ou corrente) é necessáriapara o projeto experimental, compensar de forma adequada. </li><li> Iniciar a trazer a pipeta iontoforético para a sua posição final. Se uma descrição mais detalhada de como executar com sucesso as gravações patch clamp é necessário, existem vários excelentes diretrizes disponíveis 18,19. </li></ol> 6. Coloque o Pipeta iontoforético e gerar um potencial iontoforético Postsynaptic <ol><li> Em geral, os eventos podem ser evocados iontoforéticos em locais definidos, dependendo da experiência desejada, por exemplo, a uma dendrite espinhoso para glutamato de micro-iontoforese, no eixo dendrítica, soma ou segmento inicial do axónio para o GABA micro-iontoforese. </li><li> Aproxime-se da célula-se a cerca de 1 mM distância, sem tocá-lo. Depois de atingir a posição de interesse, é fundamental que não neurotransmissor está vazando e que a capacitância pipeta é compensado corretamente. </li><li> Se se aproximar da célula com uma pipeta cheia glutamato iontoforéticoe provoca a despolarização detectável do potencial de membrana, ajustar a actual se possível manter ou mudar a pipeta. </li><li> Aplicar negativos curtos impulsos de corrente, a partir de zero e aumentar a corrente sistematicamente (por exemplo, 0,1-0,4 ms, 0,01-1 uA pulsos). Isso ajuda a descobrir em qual faixa o atual iontophoretic evoca as respostas desejadas no experimental específico set-up. </li><li> Se não houver resposta detectável, levante a pipeta várias centenas de micrómetros e aplicar uma forte corrente de ejecção (&gt; 0,1 mA) para limpar a ponta. Ajuste a compensação de capacitância, a abordagem da célula, e tente novamente. </li><li> Se ainda não houver resposta, reduzir a corrente de reter. Tenha muito cuidado com as configurações de discagem uma vez que este procedimento pode causar a liberação do neurotransmissor descontrolada. Portanto, monitorar constantemente a gravação para detectar respectivas alterações no potencial de membrana. </li><li> Se é difícil detectar eventos GABAérgicos, pode ser útil usar umn composição da solução interna rendendo em um alto Cl - força motriz. Para alcançar este objectivo, reduzir o Cl - concentração da solução de pipeta (ver secção protocolo 2.6.). Isto irá resultar em acontecimentos GABAérgicos maiores em potencial de membrana em repouso, devido a uma força motriz superior. </li><li> Em alternativa, injecta-se etapas correntes longas, resultando em membranas possibilidades potenciais de -100 mV a -48 mV (Figura 8C). Com este protocolo o Cl - força motriz é aumentada em potenciais hiperpolarizados causando uma resposta GABA despolarização. </li><li> Também é possível utilizar o protocolo de injecção de corrente passo para determinar o potencial dos acontecimentos evocados, o que ajuda a determinar a natureza dos eventos GABAérgica reversão. Vazamento de GABA é mais difícil de detectar do que o vazamento de glutamato. Neste caso, um controlo constante da resistência de entrada pode ajudar, quando a pipeta cheia GABA é abordado. Se a resistência de entrada diminui, a corrente pode reter be aumento ou uma pipeta diferente deve ser usado. </li><li> Como experiências de controlo para iontoforese glutamato, sugerimos a 2 + experimento de imagem de Ca, usando 200 uM OGB-1 e não na solução de EGTA a pipeta para visualizar o influxo de cálcio local que pode ser causada por vazamento de glutamato. </li><li> Em geral, para conseguir uma resposta estável, é muito importante ter uma pipeta mecanicamente estável para evitar desvios ao longo do tempo. Tração pode ser causada por alterações da temperatura, por conseguinte, recomenda-se ligar o equipamento, pelo menos, meia hora antes das medições para evitar desvio térmico. Não se esqueça de usar bons selos de cartucho no suporte da pipeta ea dica é realmente fixo. O suporte propriamente dito pode ser adicionalmente fixado com fita de Teflon, além disso, ter a certeza de que não há tensão nos cabos do headstage ou manipulador, que é também uma fonte potencial de deriva. </li></ol>

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<li>Fino, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuBi-Glutamate%3A+Two-Photon+and+Visible-Light+Photoactivation+of+Neurons+and+Dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines.</a> Front Neural Circuits. 3, 2(2009).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui vamos explicar como aplicar rápida micro-iontoforese de neurotransmissores para investigar a integração sináptica em dendritos. Esta técnica tem sido utilizada com êxito para estudar a transmissão sináptica glutamatérgica e GABAérgicos em diferentes regiões do cérebro, in vitro e in vivo, 9,20-22. Micro-iontoforese tem sido usada há mais de 60 anos, mas nos primeiros anos era usado principalmente para se candidatar localmente neurotransmissores e drogas em escalas de tempo lenta ou inte...

Os neurónios no sistema nervoso central receber uma variedade de entradas sinápticas em seus processos dendríticos finas e ramificadas 1. Ali, a maioria das entradas dendríticas excitatórios são mediadas por sinapses glutamatérgicas. Estes sinapses pode ser activado de um modo espacialmente distribuídos, resultando na integração linear pós-sináptico excitatório de potenciais pós-sinápticos (EPSPS). Se as sinapses são activados simultaneamente e em proximidade espacial do dendrito, estas entradas excitatórias podem ser integrados supra-linearmente e gerar picos dendrítica 2-5. Além disso, a integração das entradas excitatórios depende da localização da entrada na árvore dendrítica. Os sinais que chegam à região tufo distal são muito mais atenuada do que entradas proximais, devido ao cabo de filtragem 6. No hipocampo, entradas distantes para os dendritos apicais de tufos são geradas por uma região do cérebro diferentes do que aqueles em proximal dendrites 7. Uma pergunta interessante é, portanto, como a entrada sináptica é processado por diferentes compartimentos dendríticas e se a integração dendrítica regula a influência desses insumos em camadas sobre a ativação neuronal em diferentes maneiras. Não só as propriedades funcionais, as características morfológicas da dendrite, a localização ea aglomeração das entradas estão a afectar a integração dendrítica de entradas excitatórios, também as entradas inibidores adicionais de terminais GABAérgicos crucial determinar a eficácia das sinapses glutamatérgicas 8,9. Estes diferentes aspectos da integração sináptica pode ser idealmente investigada utilizando neurotransmissor micro-iontoforese, o que permite a aplicação espacialmente definido de diferentes neurotransmissores para domínios dendríticas. Nós demonstramos aqui como estabelecer com sucesso micro-iontoforese de glutamato e GABA para investigar integração de sinal em neurónios. Para esta aplicação, de ponta finapipetas cheias de alta resistência, com soluções concentradas de neurotransmissores são utilizados. Estas pipetas estão posicionadas perto da membrana exterior da célula, onde os receptores de neurotransmissores estão localizados. É necessária uma boa visualização das ramificações dendríticas. Este é melhor conseguido usando corantes fluorescentes, que são introduzidos através da pipeta patch. Em seguida, um muito curto (&lt;1 ms) impulso de corrente (no intervalo de 10 - 100 nA) é usado para ejectar as moléculas carregadas neurotransmissores. Com estes pulsos curtos e compensação da capacitância efectiva, potenciais pós-sinápticos ou as correntes podem ser evocados com alta precisão espacial e temporal, o que significa que a localização da entrada excitatória é precisamente conhecida. O glutamato de micro-iontoforese pode activar sinapses em um raio definido, que é menor do que 6 um, como mostrado (Figura 1 9), mas também é possível chegar a resolução sinapse único 10-12. Heine, M., et ai </em&gt; mostraram que a resolução espacial dos micro-iontoforese rápido pode mesmo ser ajustado para detectar tamanhos abaixo de 0,5 um, o que é mais pequeno do que o local tamanhos obtidos regularmente com uncaging dois fotões do glutamato 13. Com micro-iontoforese rápido é facilmente possível usar dois ou mais pipetas iontoforéticos e colocá-los em locais diferentes, mesmo distantes na árvore dendrítica. Deste modo, a integração de eventos excitatórios, incluindo aqueles a partir de diferentes vias, pode ser investigada. Também é possível utilizar um glutamato e uma pipeta cheia iontoforético GABA ao mesmo tempo. Deste modo, o efeito da inibição GABAérgica em locais diferentes em relação à entrada de excitação (no caminho, a inibição fora do caminho) pode ser estudada. Além disso, o impacto da inibição por interneurónios objectivo domínios neuronais específicos, como os dendritos distais, soma ou axónios 14, pode ser investigado utilizando iontoforese GABA. Em neurônios cultivados, micro-iontoforese rápida oferece a oportunidade de investigate distribuição sinapse único e os aspectos elementares da comunicação sináptica em neurônios em muito mais detalhe 10,11. Neste artigo, demonstram em pormenor a forma de estabelecer iontoforese glutamato e GABA para uso em fatias cerebrais agudas, que permite a investigação de integração sináptica de entradas excitatórios e inibitórios na dependência da localização de entrada, as forças de entrada e de temporização, sozinho ou em interacção. Vamos apontar as vantagens e limitações dessa técnica e como solucionar problemas com sucesso.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><forte>Material</forte></td></tr><tr><td>Microscópio de varredura a laser de dois fótons (TRIM Scope II) e Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin)</td><td>LaVision Biotec, Bielefeld, Alemanha</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio de varredura a laser de dois fótons Ultima IV</td><td>Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, EUA&</td><td></td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Ti:Safira laser ultra-rápido pulsado</td><td>Chameleon Ultra II, Coherent</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Objetiva 60X, NA 0.9</td><td>Olympus</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio vertical Zeiss Axioskop 2 FS</td><td>TILLPhotonics, Gr&auml; felfing, Alemanha</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Monocromador</td><td>TILLPhotonics, Gr&auml; felfing, Alemanha</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de micro-iontoforese MVCS-02</td><td>NPI Electronics, Tamm, Alemanha</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Extrator de Sutter P-97</td><td>Sutter Instrument Company, Novato, CA&</td><td></td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Filamentos de vidro (150 GB F 8P)</td><td>Produtos Científicos, Hofheim, Alemanha</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><forte>Reagente</forte></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 hidrazida</td><td>Sondas Moleculares life technologies</td><td>A-10436</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sondas Moleculares</td> <td>Alexa Fluor 594</td> life technologies <td>A-10438</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6297</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>K-Gluconato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES-ácido</td><td>Sigma</td><td>Aldrich H4034</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfocreatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7936</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido glutâmico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8415</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5835</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.09137.1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>1.09108.1000</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

rápido micro-iontoforese de glutamato e gaba: uma ferramenta útil para investigar integração synaptic

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Um dos interesses fundamentais da neurociência é compreender a integração dos insumos excitatórios e inibitórios ao longo da estrutura muito complexa da árvore dendrítica, que eventualmente leva à produção neuronal de potenciais de ação no axônio. A influência de diversos parâmetros espaciais e temporais da entrada sináptica específica na saída neuronal está atualmente sob investigação, por exemplo, a atenuação dependente da distância das entradas dendríticas, a interação local-dependente de insumos espacialmente segregadas, a influência da inibição GABAergig na integração excitatório, linear e modos de integração não-lineares, e muitos mais. Com o rápido micro-iontoforese de glutamato e GABA é possível investigar precisamente a integração temporal e espacial da excitação glutamatérgica e inibição GABAérgica. Requisitos técnicos críticos são ou uma lâmpada fluorescente triggered, diodo emissor de luz (LED), ou dois fótons scanning microscópio para visualizar ramificações dendríticas sem introduzir significativa da foto-dano do tecido. Além disso, é muito importante ter um amplificador de micro-iontoforese que permite a compensação de capacitância rápido de pipetas de alta resistência. Outro ponto crucial é que nenhum transmissor é involuntariamente divulgado pela pipeta durante o experimento. Uma vez estabelecida, esta técnica vai fazer sinais fiáveis ​​e reproduzíveis com um elevado neurotransmissor e especificidade de localização. Comparado ao glutamato e GABA uncaging, iontoforese rápida permite a utilização de ambos os transmissores, ao mesmo tempo mas em locais distantes, sem limitação para o campo de visão. Há também vantagens em comparação à estimulação elétrica focal de axônios: com micro-iontoforese a localização do local de entrada é definitivamente conhecido e é certo que só o neurotransmissor de interesse é liberada. No entanto, tem de ser considerado que, com micro-iontoforese apenas opostsynapse é ativado e os aspectos pré-sinápticos de liberação de neurotransmissores não são resolvidos. Neste artigo, vamos demonstrar como configurar o micro-iontoforese em experimentos fatia do cérebro.

Uma abordagem simples para determinar a distribuição espacial da iontoforese é para retrair a pipeta iontoforético gradual do dendrito, mantendo constante o glutamato ejectado. Descobrimos que a extensão espacial de um micro-estimulação iontoforético tinha um diâmetro de cerca de 12 mM (Figura 1, que mostra o raio). Como profundamente no tecido a iontoforese pode ser utilizada dependerá da rigidez da pipeta. No entanto, as pipetas iontoforéticos necessários para as experiências em fatias (Figura...

Neste artigo, apresentamos rápido micro-iontoforese de neurotransmissores como uma técnica para investigar a integração de sinais de pós-sinápticos com alta precisão espacial e temporal.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

O objetivo geral deste procedimento é compreender a integração de entradas ao longo da estrutura altamente complexa da árvore dendrítica neuronal, o que, por fim, leva à saída neuronal de potenciais de ação no axônio. Isso é realizado primeiramente puxando as pipetas iônforas apropriadas. O segundo passo consiste em testar as pipetas iônforas e compensar corretamente sua capacitância.Em seguida, estabeleça a configuração de célula inteira. O passo final é aproximar-se do dendrito e evocar potenciais pós-sinápticos na célula registrada. Em última instância, a microiontoforese rápida permite investigar a integração de múltiplas entradas, que também podem pertencer a diferentes sistemas de neurotransmissores.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo das neurociências, como a forma como as entradas inibitórias e excitatórias são integradas e sob quais condições isso pode levar à saída neuronal. Inicie este procedimento puxando pipetas com pontas muito finas para a iontoforese controlada de neurotransmissores.Com um puxador de pipetas horizontal ou vertical, podem-se obter pontas finas e pequenas por meio de várias etapas de puxamento. No entanto, a ponta ainda

fast-micro-iontophoresis-glutamate-gaba-useful-tool-to-investigate

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Neuroscience

Neurociência

A preparação de fatias cerebrais agudas de isolado hipocampo, assim como as gravações simultâneas electrofisiológicas de astrócitos e neurónios...

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Este vídeo demonstra a avaliação da liberação e depuração de glutamato em sinapses corticoestriatais únicas em uma fatia de cérebro de camundongo. A estimulação elétrica facilita a liberação de glutamato na sinapse. O glutamato liberado altera a fluorescência da proteína sensora, que decai com o tempo, indicando eficiência de liberação e depuração.

Analisando a liberação e depuração de glutamato em uma única sinapse de neurônio em uma fatia de cérebro de camundongo

Neste vídeo, um Multielectrode Array (MEA) revestido com glutamato oxidase é implantado no tecido cerebral de um ratinho anestesiado. A solução de glutamato é injetada no espaço extracelular onde o MEA detecta os níveis de glutamato, permitindo o monitoramento em tempo real da captação de glutamato pelos astrócitos.

Monitoramento de glutamato in vivo em tempo real usando uma matriz de microeletrodos revestidos com enzimas

Nós descrevemos um método analítico para estimar o tempo de vida de glutamato em membranas astrocitários de registros eletrofisiológicos de correntes transportador de glutamato em astrócitos.

Derivando o Curso momento do desembaraço glutamato com uma Análise de Deconvolução das correntes Transporter astrocitárias

Descreve-se a combinação de UV induzida por foto-ativação focal de compostos neuro-ativa com célula inteira patch-clamp e multi-fotão imagem de transientes de cálcio intracelular em dendritos e espinhas dos neurônios do hipocampo em fatias de tecido agudas do cérebro do rato.

Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1

Demonstramos a fabricação, calibração e propriedades de dois tipos de microeletrodos seletivos de íons (de cano duplo e concêntricos) para medição de concentrações de íons no tecido cerebral. Estes são então usados na preparação da fatia do hipocampo de camundongos para mostrar que a atividade excitatória altera as concentrações extracelulares de potássio e sódio.

Microeletrodos de cano duplo e concêntricos para a medição de Extracelular Ion Signals no tecido cerebral

Este artigo ilustra como a expressão de receptores de neurotransmissores pode ser quantificada e o padrão analisado em sinapses com elementos pré e pós-sinápticos identificados usando uma combinação de transdução viral de ferramentas optogenéticas e a técnica de imunomarcação de réplica de fratura por congelamento.

Combinado optogenética e Freeze-fratura Replica imunomarcação para examinar Arranjo específicos de entrada de glutamato receptores no mouse Amygdala

Apresentamos métodos para a construção de eletrodos para registrar simultaneamente a atividade neural extracelular e liberar múltiplas substâncias neuroativas nas proximidades dos locais de registro em camundongos acordados. Esta técnica permite a análise detalhada de entradas sinápticas locais putativas para o neurônio de interesse.

Extracelular Gravação de Neuronal Atividade Combinado com Microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em Ratos Awake

O desafio da pesquisa da epilepsia é desenvolver tratamentos novos para os pacientes onde a terapia clássica é inadequada. Usando um protocolo novo — com a ajuda de um sistema implantáveis da entrega da droga — nós podemos controlar apreensões em ratos anestesiados pela entrega electrophoretic de GABA no foco epileptic.

A entrega electrophoretic do ácido γ-aminobutyric (GABA) no foco epileptic impede apreensões nos ratos

Apresentamos um protocolo para avaliar o equilíbrio entre liberação de glutamato e liberação em sinapses glutamatergicas corticostriatais únicas em fatias agudas de camundongos adultos. Este protocolo usa o sensor fluorescente iGluu para detecção de glutamato, uma câmera sCMOS para aquisição de sinal e um dispositivo para iluminação a laser focal.

Indicadores únicos de sinapse de liberação de glutamato e absorção em fatias cerebrais agudas de ratos normais e huntington

O protocolo demonstra que, realizando microtransplante de membranas sinápticas em oócitos Xenopus laevis , é possível registrar respostas consistentes e confiáveis de receptores de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropônico e receptores de ácido γ-aminobutírico.

Microtransplantação de Membranas Sinápticas para Reativar Receptores Sínpticos Humanos para Estudos Funcionais

Aprenda micro-iontoforese rápida de glutamato e GABA para investigar a integração de sinais pós-sinápticos em neurônios. Esta técnica de eletrofisiologia permite estudar com precisão como entradas excitatórias e inibitórias são processadas.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

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