Name: Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Aprenda a dissecar e montar embriões de zebrafish em lâminas para visualização microscópica da medula espinhal. Este método utiliza microscopia de fluorescência e campo claro para estudar neurobiologia do desenvolvimento.

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Skidmore Faculdade Desenvolvimento Grant financiou a elaboração e publicação deste manuscrito.

1. Montagem Embriões (após a conclusão da técnica de visualização selecionado, como imunocitoquímica, hibridização in situ, etc) <ol><li> Coloque embriões num prato 35 milímetros de Petri cheia com tampão de escolha (Figura 1A). A escolha do tampão baseia-se no procedimento de marcação. Tipicamente, tampões à base de PBS, são adequados. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, e usando uma pinça, fixar a cabeça com um par de pinças, enquanto puxa a gema de distância com o outro par (Figura 1B). Como alternativa, use um pino de inseto em um suporte inseto pin para puxar suavemente a gema. </li><li> Usando o póquer embrião (linha de pesca (0,41 mm de diâmetro) ou colado a um tubo capilar ou uma pipeta de Pasteur) mover os embriões de uma parte da placa de Petri que não tem uma grande quantidade de detritos gema (Figuras 1C-D). </li><li> Com uma pipeta Pasteur de vidro, aspirar os embriões em tão pouco líquido possível, e gSuavemente pipeta-los sobre uma lâmina (Figura 1E). </li><li> Gentilmente pavio fora o excesso de líquido usando um laboratório wipe. Evitar o contacto com os embriões. </li><li> Adicione uma gota de meio de montagem de embriões. No caso de etiquetas fluorescentes, usar um reagente Antifade de escolha. Para sinais colorimétricos, glicerol a 70% pode ser usado como um meio de montagem. </li><li> Usando o pôquer embrião, orientar os embriões em seus lados em linhas (Figura 1F). </li><li> Adicione uma &quot;bagatela&quot; de vaselina ou graxa de vácuo elevado para cada canto de uma lamela (Figura 1G). Isso evita danos de embrião de compressão excessiva. </li><li> Coloque lamela (lado vaselina para baixo) em cima de embriões (Figura 1H). </li><li> Bata suavemente na lamela em cada canto até o meio de montagem (70% de glicerol ou reagente de montagem anti-fade) está tocando a lamela (Figura 1H). </li><li> Se necessário, adicione mais mídia montagem pipetando ao lado do coverslip, usando uma pipeta, no intervalo de 20-200 ml. Ele vai pavio para baixo. </li><li> Usando um laboratório de limpar, completamente limpa ao redor da lamela. Esteja certo de não aplicar pressão sobre a lamela, pois isso irá danificar embriões. Essa área deve ser seco e não tem vaselina ou meios de montagem do mesmo. </li><li> Use unha polonês para selar em torno da borda da lamela (Figura 1I). </li></ol>

<ol><li>Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+Dbx+genes+in+the+zebrafish+spinal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal.</a> Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).</li>
<li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midline+crossing+is+not+required+for+subsequent+pathfinding+decisions+in+commissural+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons.</a> Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).</li>
<li>Ross, A. B. J. Activation of Wnt signaling using Lithium Chloride: Inquiry-Based Undergraduate Laboratory Exercises. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoss%2C+ABJ+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , In Press. (2012).</li>
<li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+patterning+are+mediated+independently+in+the+dorsal+spinal+cord+downstream+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proliferation and patterning are mediated independently in the dorsal spinal cord downstream of canonical Wnt signaling.</a> Dev. Biol. 313 (1), 398-407 (2008).</li>
<li>Gribble, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf3+inhibits+spinal+cord+neurogenesis+by+regulating+sox4a+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression.</a> Development. 136 (5), 781-789 (2009).</li>
<li>England, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Hedgehog+pathway+components+and+retinoic+acid+signalling+in+specifying+zebrafish+ventral+spinal+cord+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons.</a> Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).</li>
<li>Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+roundabout+orthologs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of roundabout orthologs in zebrafish.</a> Mech Dev. (1-2), 101-101 (2001).</li>
<li>Lee, J. S., Ray, R., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+three+zebrafish+roundabout+homologs+suggest+roles+in+axon+guidance+and+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of three zebrafish roundabout homologs suggest roles in axon guidance and cell.</a> 221 (2), 216-230 (2001).</li>
<li>Downes, G. B., Waterbury, J. A., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+labeling+of+identified+zebrafish+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo labeling of identified zebrafish neurons.</a> Genesis. 34 (3), 196-202 (2002).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-regulated+oligodendrocyte+specification+from+radial+glia+in+the+spinal+cord+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Notch-regulated oligodendrocyte specification from radial glia in the spinal cord of zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 237 (8), 2081-2089 (2008).</li>
<li>Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+exposed+to+alcohol+undergo+abnormal+development+of+motor+neurons+and+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).</li>
<li>de Soysa, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macondo+crude+oil+from+the+Deepwater+Horizon+oil+spill+disrupts+specific+developmental+processes+during+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Macondo crude oil from the Deepwater Horizon oil spill disrupts specific developmental processes during zebrafish embryogenesis.</a> BMC Biol. 10 (40), (2012).</li>
<li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).</li>
<li>Deschene, E. R., Barresi, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Targeted+Embryonic+Chimeras%3A+Zebrafish+Gastrula+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (31), (2009).</li>
</ol>

Não existem interesses financeiros concorrentes para qualquer autor.

Montagem lateral de embriões Zebrafish auxiliares de visualização fixa de desenvolvimento da medula espinhal. Através da remoção da gema de bola, a distância de trabalho necessária para a imagem microscópica excepcional é reduzida. Os resultados representativos foram limitados à fase 24 hpf, no entanto, esta técnica pode ser usado tão cedo quanto 18 hpf, embora embriões precoces são mais difíceis de dissecar devido ao tamanho do embrião e a fragilidade do tecido. Esta técnica é também aplicável aos embriões mais velhos do que 24 hpf. Ajudado pela claridade óptica do peixe-zebra embrionário, a capacidade de executar telas genéticos para a frente, a genética reversa e abordagens transgênicas, vários processos de desenvolvimento podem ser investigadas. Isto inclui os índices de mitose de células progenitoras neuronais com marcadores como BrdU e anti-fosfo-histona 04-06 março e padronização através da expressão de marcadores progenitoras neuronais e gliais do pax, NKX, dbx, e oligo families 1,4-6. Reagentes que relatam determinação glial e neuronal (tal como a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e HuC / D) 1,4,5,10 pode ser usado. Subtipo diferenciação neuronal pode ser analisado através da expressão da ilhota, VSX, engrailed e genes gata 1,4-6. E, finalmente, a análise de orientação axónio é possível por meio de anticorpos, tais como anti-tubulina acetilada, 3A10, e ZNP-1 2,11,12. Embora outros sistemas modelo de vertebrados (mouse e galinha) são usados ​​para estudar o desenvolvimento da medula espinhal, apenas o peixe-zebra permite a visualização simultânea de todos os eixos de desenvolvimento do embrião intacto. A limitação óbvia para esta abordagem é que os embriões são fixas, que se opõe a uma imagem ao vivo. De facto, a remoção do (ou dano para) os resultados de gema de morte embrionária rápida, pelo que não é possível reduzir a distância de trabalho em embriões vivos utilizando esta técnica. No entanto, a alta ampliação co espinhalrd imagem em embriões vivos é possível. A fim de preservar a gema durante a imagem ao vivo, os embriões podem ser colocados em lâminas de depressão, que proporcionam um espaço maior entre a amostra e a lamela. Alternativamente, vários 22 milímetros x 22 milímetros lamelas podem ser colados ou deslizamento de um 3 em x 1 em lâminas microscópicas. As lamelas servir como uma &quot;ponte&quot; para a lamela sobrejacente. Se os embriões são mais velhos do que 18 hpf, tricaina é usada para anestesiar os embriões para evitar o movimento. Enquanto uma distância de trabalho de 0,288 milímetros é necessário para embriões deyolked em 24 hpf, quando se trabalha com embriões vivos incorporados em agarose, com gema intacta, uma lente microscópica com uma distância de trabalho de 3,3 mm é suficiente. Alternativamente, culturas de explantes derivados de embriões deyolked pode ser visualizada utilizando uma técnica de imobilização de coágulo de plasma 13. Várias populações de células podem ser observados através da utilização de proteínas fluorescentes codificados geneticamente, tais como a GFP, mCherry, ou o photoconcorante convertíveis Kaede (para citar alguns). Além disso, as células marcadas com fluorescência dentro embriões quiméricos também pode ser visto com esta abordagem 14. A técnica de montagem consistente que é estável durante meses é uma ferramenta fundamental para os biólogos do desenvolvimento e celulares. Esta técnica simples é reprodutível, permitindo uma fácil comparação entre diferentes ensaios experimentais. Além disso, o alinhamento dos embriões em linhas prontamente permitir a identificação de embriões específicos para análise posterior.

A visualização da medula espinal no peixe-zebra é inibida por um número de factores. Devido à espessura de somitos sobrepostas e o local interno da medula espinal, a uma distância consideravelmente longo trabalho é necessário para alta resolução celular. A bola gema (que ainda está presente durante os primeiros estágios de neurogênese) aumenta ainda mais a distância de trabalho necessário, e é facilmente danificado pela pressão de uma lamela. Além disso, os restos de gema danificada proíbe clara visualização do tecido. Embora sejam possíveis cortes transversais no eixo dorso-ventral (DV), eles não são facilmente permitir a visualização simultânea no ântero-posterior (AP) Eixo 1. Para superar esses obstáculos, os embriões são dissecados e montados em lâminas. Este procedimento proporciona vários benefícios. Primeiro, os embriões de peixe-zebra prontamente se deitar com a lateral voltada para cima, o que facilita a visualização do eixo AP. Em segundo lugar, a remoção da gema ball diminui a distância de trabalho necessário, e limita detritos. Em terceiro lugar, este processo de montagem permite tanto fluorescente e a microscopia de campo claro. Em quarto lugar, os embriões montados são estáveis ​​durante meses a 4 ° C, permitindo a visualização exemplar prolongada. Finalmente, a progressão do desenvolvimento ocorre em que segmentos anteriores são mais maduros do que os segmentos posteriores. A fim de assegurar que encenadas hemisegments espinhais combinados são comparados entre os embriões, que recobre tecido somito é utilizado como um guia. Por exemplo, a décima somito mais posterior sobrepõe hemisegmento espinal décimo, o que é equivalente desenvolvente em embriões combinado da fase. Este procedimento de montagem de embriões intactos permite uma fácil identificação de somitos. Usamos genética e genes tecnologias knock-down para estudar os mecanismos de orientação do axônio na medula espinhal em desenvolvimento. Em particular, nós determinamos que robo2, robo3, e DCC são necessários para comissural primária Ascending (COPA) pathfinding axônio. Usando o procedimento de montagem descrito aqui, fomos capazes de examinar o crescimento ventral, cruzamento da linha média, a largura da comissura, dorsal e 2,3 crescimento anterior. Este processo de montagem pode também ser aplicado para DV ou AP padronização da medula espinhal. Temos utilizado este procedimento para determinar os papéis díspares de efetores Wnt a jusante padronização DV da medula espinhal. Usando esta montagem, fomos capazes de obter resolução de marcadores DV no nível da célula única, e determinar mudanças padronização minutos como resultado da alteração da recepção do sinal Wnt 4,5. Este procedimento também permite a montagem para o cálculo do índice mitótico através de anti-phosphohistone 3 ou rotulagem BrdU (proliferação progenitor) diferenciação 5.

<table><tbody><tr><td>Placas de Petri 35 mm x 10 mm</td><td>VWR</td><<td>p>25373-041</td><td></td></tr><tr><td> Dumont Fórceps #3 </td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9839169</td><td></td></tr><tr><td> Vidro de cobertura </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B22X22-1.5</td><td></td></tr><tr><td> Slides </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td> SlowFade Gold </td><td>Fisher Scientific</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold </td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td> Vaseum Jelly </td><td>qualquer supermercado</td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Loop Holders </td><td>VWR</td><td>80094-482</td><td></td></tr><tr><td> Insect Pins </td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td> Nickel Plated Pin Holders </td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12 </td><td></td></tr><tr><td>Olympus Stereomicroscope</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr></tbody></table>

dissecção e montagem lateral de embriões zebrafish: análise de desenvolvimento da medula espinhal

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

A medula espinhal peixe-zebra é um modelo de investigação eficaz para investigação do sistema nervoso por várias razões. Primeiro, genética, transgénicos e de genes abordagens de knockdown pode ser utilizado para examinar os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso. Em segundo lugar, as grandes garras de embriões developmentally sincronizados fornecem grandes amostras experimentais. Em terceiro lugar, a claridade óptica do embrião zebrafish permite aos pesquisadores visualizar progenitor, glial, e as populações neuronais. Apesar de embriões de peixe-zebra são transparentes, espessura da amostra pode impedir a visualização microscópica eficaz. Uma razão para isso é o desenvolvimento conjunto do tecido da medula espinal e somito sobrejacente. Outra razão é a grande bola de gema, que ainda está presente durante os períodos de neurogênese cedo. Neste artigo, demonstramos microdissecção e remoção da gema em embriões fixos, que permite a visualização microscópica do tecido circundante, preservando somito. Nós also demonstrar montagem semipermanente de embriões de peixe-zebra. Isto permite a observação de neurodesenvolvimento nos eixos dorso-ventral e ântero-posterior, uma vez que preserva a tridimensionalidade do tecido.

Quando elucidar os mecanismos subjacentes a vários eventos de desenvolvimento, tais como padrões celular, diferenciação, e a orientação do axónio, é importante ser capaz de visualizar as células dentro do contexto do seu tecido. Defeitos padronização dorsoventral tipicamente apresentam-se como uma mudança ventral ou dorsal no domínio de fatores de transcrição expressão na pax, NKX ou famílias dbx 4. Às vezes, as mudanças podem ser sutis, compreendendo apenas alguns diâmetros celulares 4. Estudo transversal permite que este tipo de análise. No entanto, os reagentes com sinais mais fracos, ou secções transversais que não são perpendiculares ao eixo do AP pode limitar interpretação. Além disso, a análise transversal não facilmente levar em conta se as mudanças persistem no eixo AP, e baseia-se na disponibilidade de um criostato. Essa limitação é contornada por visualizações laterais da medula espinhal. Como pode ser visto na Figura 2B, nkx6.1 ARNm é distributed em aproximadamente a metade ventral da medula espinhal às 24 horas pós-fecundação (hpf), dentro do domínio progenitor. As células progenitoras são distinguíveis das células pós-mitóticas, devido à presença da placa de piso, que se encontra na parte mediana da medula espinal. Visualizado com DIC óptica, as células individuais são claramente distinguíveis, e um limite definido entre expressar e nonexpressing células é evidente. Saída do ciclo de células progenitoras é acompanhada por alterações na expressão de genes. Por exemplo, todos os neurônios pós-mitóticas expressar HuC / D que é detectável com imunocitoquímica 1,5. sondas de mRNA para ilhota, gata, e as famílias VSX rotular neurônios pós-mitóticas específicas de posição consistente e número dentro de cada hemisegmento medula espinhal 6. Além disso, os receptores de orientação do axónio, tais como aqueles na família robo são expressos em populações restritas de neurónios pós-mitóticos (Figura 2C) <sup&gt; 2,7,8. Montagem lateral de embriões permite contagens precisas de neurônios pós-mitóticas. Do mesmo modo, células progenitoras, que continuam a dividir pode ser quantificada com anti-fosfo-histona 3 imunocitoquímica, bem como a rotulagem BrdU. Além disso, a morte celular pode ser avaliada com TUNEL rotulagem 4-6. Aos 24 hpf, os axônios dos neurônios pós-mitóticas seguintes podem ser visualizados com vários métodos, e são distinguíveis no nível da célula única: Dorsal Lateral Ascendente (Dola), comissural primária Ascendente (COPA), comissural Secundária Ascendente (CoSA), Ventral Longitudinal Decrescente (estepe), Kolmer-Agdur (KA), bifurcando comissural / longitudinais (COB / L), circunferencial Crescente (CIA), circunferencial Descendente (CID), e Unipolar comissural Descendente (UCoD), Rohon-Barba (RB), neurônios motores ( M) 9. Os axônios estendem-se desde esses neurônios no dorsal, ventral, anterior e posterior direções. Eles ramo, cruzar a linha média, e sair tanto o dorsale medula espinal ventral. Quando combinado com microscopia confocal a laser, estes comportamentos celulares variadas são evidentes em embriões lateralmente montados, utilizando imunocitoquímica e proteínas fluorescentes geneticamente codificados como GFP 2. Na Figura 2D, ZNP-1 imunocitoquímica foi usado para rotular motoneurons desenvolvimento. Os motoneurónios sair da espinal medula ventral a inervam a musculatura desenvolver circundante. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Dissecção e laterais montagem de embriões de peixe-zebra. (A) Após o processamento para imunofluorescência, hibridização in situ, etc, os embriões são colocados em um prato de 35 milímetros Petri cheia de PBT (PBS com 0,5% de Triton X-100) ou PTW (PBS com 0,1% de Tween-20). A gemabola (YB) é evidente. (B) A gema é removido por fixar a cabeça do embrião seguido de dissecção cuidadosa. (C) Um embrião de póquer (linha de pesca colada a uma pipeta de Pasteur) é usada para separar os embriões e os restos da gema (D). Embriões limpos são pipetadas para uma lâmina de microscópio, (E) e alinhados (F). Gelatina (G) de petróleo é aplicada aos cantos da lamela. (H) A lamela é colocada delicadamente em cima dos embriões em meio de montagem. (I) Nail polonês é usado para selar as bordas da lamela. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html> strong&gt; Figura 2. Análise dos padrões de expressão gênica e axônio pathfinding em (A) Desenho de um embrião de peixe-zebra em 24 hpf lateralmente montado embriões de peixe-zebra.. Em BD, aproximadamente quatro hemisegments acima da extensão saco vitelino são visualizados (área de box). (B) nkx6.1 é expresso na medula espinal ventral, incluindo a placa de piso (FP). (C) robo3 é expresso em neurónios pós-mitóticos (PMN). A zona de placa de piso e progenitor não é evidente neste plano focal mais lateral. Em B, C, a espinal medula é delimitado por um suporte, no lado esquerdo da imagem. (D) confocal microscopia foi utilizado para a imagem ZNP-1 de imunofluorescência, que rotula axónios motores que saem da medula espinal ventral. Em todas as imagens, é anterior à esquerda e dorsal é para cima. A 40X distância de trabalho longa, imersão em água (NA 0,8) lente foi usada (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada.

Processos de desenvolvimento, tais como a proliferação, a modelagem, diferenciação, e a orientação do axónio pode ser facilmente modelada na medula espinal do peixe-zebra. Neste artigo, nós descrevemos um procedimento de montagem para os embriões de peixe-zebra, que otimiza a visualização destes eventos.

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

O objetivo geral deste procedimento é dissecar e montar embriões de peixe-zebra para uma visualização microscópica ideal da medula espinhal. Isso é realizado primeiramente pela dissecação microscópica e remoção da bola de carvalho. O segundo passo consiste em remover os detritos de carvalho e pipetar os embriões sobre uma lâmina.Em seguida, o líquido em excesso é cuidadosamente removido com um lenço de papel Kim, seguido pela adição do meio de montagem. O passo final consiste em orientar os embriões sobre a lâmina com uma agulha para embriões, seguido pela aplicação da lamínula. Por fim, utiliza-se microscopia de fluorescência ou de campo claro para mostrar a distribuição dos corpos celulares pós-mitóticos e a trajetória dos axônios em desenvolvimento.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurobiologia, como quais são os mecanismos responsáveis pelo padrão, diferenciação e orientação axonal. Embora este método possa fornecer informações sobre muitos aspectos do desenvolvimento do sistema nervoso, ele também pode ser aplicado a outros tecidos, como o músculo em desenvolvimento. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque é necessária uma dissecação sob microscópio antes do início do experimento.Prepare um espeto para embrião colando uma ponta de pipeta a uma pipeta usada e, em seguida, colando um fio de pesca à ponta da pipeta. Para iniciar a dissecação do embrião, coloque até 30 embriões de peixe-zebra com 24 horas pós-fertilização em uma placa de Petri de 35 milímetros cheia com PBS.Sob um microscópio estereoscópico, segure a cabeça de um embrião com um par de pinças enquanto puxa o caroço com um alfinete para insetos. Em seguida, use o bastão para embriões para mover os embriões para uma região da placa de Petri que não tenha muitos resíduos de gema. Depois, aspire os embriões para dentro de uma pipeta de Pasteur de vidro, aspirando o menor volume de líquido possível.Em seguida, pipete suavemente até 21 embriões sobre uma lâmina. Remova cuidadosamente o excesso de líquido usando um lenço de laboratório, evitando tocar os embriões, e adicione uma gota de meio de montagem sobre os embriões. Em seguida, use o bastão para manipular embriões para posicionar os embriões de lado, em duas a três fileiras.Agora, adicione uma pequena quantidade de vaselina em cada canto de uma lamínula. Vire a lamínula de modo que o lado com a vaselina fique voltado para baixo e posicione a lamínula sobre os embriões. A vaselina atua prevenindo danos aos embriões causados por compressão excessiva.Toque suavemente a lamínula em cada canto, se necessário, usando uma pipeta na faixa de 20 a cem microlitros, até que o meio de montagem entre em contato com a lamínula. Adicione mais meio de montagem ao lado da lamínula e permita que o meio adicionado seja absorvido por capilaridade sob a lamínula. Agora, use um lenço de laboratório para limpar completamente a área ao redor da lamínula.Não aplique pressão sobre a lamínula, pois isso pode danificar os embriões; quando adequadamente limpa, a área deve estar seca e sem vaselina ou meio de montagem. Finalize selando as bordas da lamínula com esmalte. Após o acondicionamento dos embriões de peixe-zebra, vários segmentos HEMI acima da extensão do saco vitelino foram visualizados.Esta figura mostra a expressão de NK X 6.1 na medula espinhal ventral do embrião de peixe-zebra. O RNAm de NK X 6.1 está distribuído aproximadamente na metade ventral da medula espinhal em 24 horas pós-fertilização. Dentro do domínio de progenitores, as células progenitoras são distinguíveis das células pós-mitóticas devido à presença da placa do assoalho, que se localiza na parte medial da medula espinhal.Visualizado com óptica DIC. As células individuais são claramente distinguíveis e um limite definido entre células expressantes e não expressantes é evidente. A saída do ciclo celular das células progenitoras é acompanhada por alterações na expressão gênica.Esta imagem mostra a expressão de robo três em neurônios pós-mitóticos. A família robo de receptores são receptores de orientação axonal cuja expressão permite contagens precisas de neurônios pós-mitóticos. Observe que a placa do assoalho e a zona de progenitores não são evidentes neste plano focal mais lateral.A microscopia confocal foi utilizada para imagens de imunofluorescência de znp um, que marca os axônios motores conforme mostrado neste embrião montado lateralmente. Os neurônios motores saem da medula espinhal pela região ventral em 24 horas pós-fertilização para inervar a musculatura em desenvolvimento ao redor. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 30 minutos se for executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de preservar a integridade dos tecidos por meio de uma microdissecação cuidadosa. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar técnicas de microdissecação para remover a gema de embriões de peixe-zebra para montagem e visualização microscópica.

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JoVE Journal

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Neurociência

Neste vídeo, demonstramos um método pelo qual para analisar o cérebro em desenvolvimento em embriões vertebrados zebrafish viver em resolução única célula por microscopia confocal. Isso inclui o método pelo qual injetamos o embrião do zebrafish de uma única célula e, posteriormente, montar e imagem do cérebro em desenvolvimento.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

Após transecção espinhal, adulto zebrafish tem recuperação funcional por seis semanas após a lesão. Para tirar proveito da transparência larval e recuperação mais rápida, apresentamos um método para seccionar a medula espinhal larval. Após transecção, observamos recuperação sensorial começando em 2 dias após a lesão, e movimento C-curva por 3 dias após a lesão.

Transecção medular nos larval Zebrafish

O embrião de peixe-zebra é um excelente modelo para investigação em biologia do desenvolvimento. Durante a embriogênese, peixe-zebra desenvolver com uma massa de gema, que apresenta desafios tridimensionais para observação de amostras e análise. Este protocolo descreve como criar bidimensionais planas montagem preparações de toda montagem in situ (desejo) manchadas espécimes embrião de peixe-zebra.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

O método descrito aqui permite a análise de lapso de tempo de desenvolvimento de órgãos em embriões de peixe-zebra, usando um microscópio de dissecação de fluorescência capazes de realizar seccionamento óptico e estratégias simples de reajuste para corrigir desvio focal e planar.

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

Aqui, apresentamos um método de montagem versátil que permite a imagem de lapso de tempo de longo prazo do desenvolvimento posterior do corpo de embriões vivos de peixe-zebra sem perturbar o desenvolvimento normal.

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Este manuscrito descreve métodos para registos electrofisiolicos de neurónios espinais de embriões de peixe-zebra e larvas. A preparação mantém neurónios in situ e muitas vezes envolve a dissecção mínima. Estes métodos permitem o estudo electrofisiológico de uma variedade de neurónios espinais, a partir da aquisição inicial excitabilidade eléctrica através dos primeiros estádios larvares.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

Aqui, apresentamos uma série padronizada de protocolos para observar o sulco superior e ocular, uma estrutura recentemente identificada, conservado evolutivamente no olho vertebrado. Usando zebrafish larvas, demonstraremos técnicas necessárias para identificar os fatores que contribuem para a formação e o fechamento do sulco superior ocular.

Visualização do sulco Superior Ocular durante a embriogênese Danio rerio

Aqui, nós descrevemos um método para reduzir o tamanho de embriões do zebrafish sem interromper processos desenvolventes normais. Esta técnica permite o estudo da escala do teste padrão e do robustez desenvolvente de encontro à mudança do tamanho.

Redução cirúrgica do tamanho do zebrafish para o estudo da escala padrão embrionária

Este artigo descreve um método para montar embriões frágeis do zebrafish para a microscopia confocal prolongada do tempo-lapso. Este método de baixo custo é fácil de executar usando pratos regulares de microscopia com fundo de vidro para imagens em qualquer microscópio invertido. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações.

Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Aqui, apresentamos o protocolo para a cultura tecidual 3D do eixo corporal posterior do zebrafish, possibilitando o estudo ao vivo da segmentação de vertebrados. Este modelo de explant fornece controle sobre o alongamento do eixo, alteração de fontes de morfógeno e imagem viva de nível de tecido de resolução subcelular.

Uma cultura de explanta de cauda 3D para estudar segmentação de vertebrados em zebrafish

Aqui, apresentamos um método para alinhar e criosseccionar várias amostras de larvas de peixe-zebra (Danio rerio) e coletá-las em uma única lâmina para análise transcriptômica espacial.

Arranjo Espacialmente Compacto de Seções de Larvas de Peixe-Zebra para Análise Transcriptômica Espacial

Aprenda a dissecar e montar embriões de zebrafish em lâminas para visualização microscópica da medula espinhal. Este método utiliza microscopia de fluorescência e campo claro para estudar neurobiologia do desenvolvimento.

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

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