Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

O objetivo geral deste procedimento é dissecar e montar embriões de peixe-zebra para uma visualização microscópica ideal da medula espinhal. Isso é realizado primeiramente pela dissecação microscópica e remoção da bola de carvalho. O segundo passo consiste em remover os detritos de carvalho e pipetar os embriões sobre uma lâmina.

Em seguida, o líquido em excesso é cuidadosamente removido com um lenço de papel Kim, seguido pela adição do meio de montagem. O passo final consiste em orientar os embriões sobre a lâmina com uma agulha para embriões, seguido pela aplicação da lamínula. Por fim, utiliza-se microscopia de fluorescência ou de campo claro para mostrar a distribuição dos corpos celulares pós-mitóticos e a trajetória dos axônios em desenvolvimento.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurobiologia, como quais são os mecanismos responsáveis pelo padrão, diferenciação e orientação axonal. Embora este método possa fornecer informações sobre muitos aspectos do desenvolvimento do sistema nervoso, ele também pode ser aplicado a outros tecidos, como o músculo em desenvolvimento. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque é necessária uma dissecação sob microscópio antes do início do experimento.

Prepare um espeto para embrião colando uma ponta de pipeta a uma pipeta usada e, em seguida, colando um fio de pesca à ponta da pipeta. Para iniciar a dissecação do embrião, coloque até 30 embriões de peixe-zebra com 24 horas pós-fertilização em uma placa de Petri de 35 milímetros cheia com PBS.

Sob um microscópio estereoscópico, segure a cabeça de um embrião com um par de pinças enquanto puxa o caroço com um alfinete para insetos. Em seguida, use o bastão para embriões para mover os embriões para uma região da placa de Petri que não tenha muitos resíduos de gema. Depois, aspire os embriões para dentro de uma pipeta de Pasteur de vidro, aspirando o menor volume de líquido possível.

Em seguida, pipete suavemente até 21 embriões sobre uma lâmina. Remova cuidadosamente o excesso de líquido usando um lenço de laboratório, evitando tocar os embriões, e adicione uma gota de meio de montagem sobre os embriões. Em seguida, use o bastão para manipular embriões para posicionar os embriões de lado, em duas a três fileiras.

Agora, adicione uma pequena quantidade de vaselina em cada canto de uma lamínula. Vire a lamínula de modo que o lado com a vaselina fique voltado para baixo e posicione a lamínula sobre os embriões. A vaselina atua prevenindo danos aos embriões causados por compressão excessiva.

Toque suavemente a lamínula em cada canto, se necessário, usando uma pipeta na faixa de 20 a cem microlitros, até que o meio de montagem entre em contato com a lamínula. Adicione mais meio de montagem ao lado da lamínula e permita que o meio adicionado seja absorvido por capilaridade sob a lamínula. Agora, use um lenço de laboratório para limpar completamente a área ao redor da lamínula.

Não aplique pressão sobre a lamínula, pois isso pode danificar os embriões; quando adequadamente limpa, a área deve estar seca e sem vaselina ou meio de montagem. Finalize selando as bordas da lamínula com esmalte. Após o acondicionamento dos embriões de peixe-zebra, vários segmentos HEMI acima da extensão do saco vitelino foram visualizados.

Esta figura mostra a expressão de NK X 6.1 na medula espinhal ventral do embrião de peixe-zebra. O RNAm de NK X 6.1 está distribuído aproximadamente na metade ventral da medula espinhal em 24 horas pós-fertilização. Dentro do domínio de progenitores, as células progenitoras são distinguíveis das células pós-mitóticas devido à presença da placa do assoalho, que se localiza na parte medial da medula espinhal.

Visualizado com óptica DIC. As células individuais são claramente distinguíveis e um limite definido entre células expressantes e não expressantes é evidente. A saída do ciclo celular das células progenitoras é acompanhada por alterações na expressão gênica.

Esta imagem mostra a expressão de robo três em neurônios pós-mitóticos. A família robo de receptores são receptores de orientação axonal cuja expressão permite contagens precisas de neurônios pós-mitóticos. Observe que a placa do assoalho e a zona de progenitores não são evidentes neste plano focal mais lateral.

A microscopia confocal foi utilizada para imagens de imunofluorescência de znp um, que marca os axônios motores conforme mostrado neste embrião montado lateralmente. Os neurônios motores saem da medula espinhal pela região ventral em 24 horas pós-fertilização para inervar a musculatura em desenvolvimento ao redor. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 30 minutos se for executada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de preservar a integridade dos tecidos por meio de uma microdissecação cuidadosa. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar técnicas de microdissecação para remover a gema de embriões de peixe-zebra para montagem e visualização microscópica.