Name: Isolamento de tecido adiposo de células imunes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Aprenda a isolar células imunes de tecido adiposo usando digestão com colagenase e centrifugação diferencial. Este método permite quantificar macrófagos e linfócitos T por citometria de fluxo para estudos em imunometabolismo.

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JSO é apoiado por um NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da American Diabetes Association (7-10-MI-05), e AHH é apoiado por um Heart Association Award americano Investigator Fundada (12EIA8270000). Experimentos de citometria de fluxo foram realizadas no VMC Citometria de Fluxo de Recursos Compartilhados. O VMC Citometria de Fluxo de recursos partilhada é apoiado pelo Digestive Disease Research Center Vanderbilt (DK058404).

1. Reagentes e Suprimentos Antes de se iniciar este protocolo experimental, preparar os seguintes reagentes: <ol><li> 70% de etanol </li><li> PBS 1X </li><li> 1X DPBS (sem Ca e Mg), suplementado com 0,5% de BSA </li><li> FACS buffer: 1X DPBS (sem Ca e Mg), EDTA 2 mM, e 1% de FCS </li><li> ACK tampão: 150 mM de NH4Cl, 10 mM KHCO 3, e 0,1 mM Na 2 EDTA em água </li></ol> 2. A colheita e preparação do tecido adiposo <ol><li> Eutanásia camundongos de acordo com os procedimentos aprovados pela IACUC específicos de cada instituição. </li><li> Molhe cuidadosamente a pele com álcool 70%. </li><li> Faça uma incisão no nível do processo xifóide (parte inferior do esterno) e abrir a cavidade torácica para expor o coração, tomando cuidado para não cortar os vasos sanguíneos principais. </li></ol> Nota: Neste ponto, é também útil a deixar intacto o diafragma tanto quantoe possível cortar um entalhe para fora do lado direito da caixa torácica para permitir que o sangue e perfusato a fluir para fora da cavidade torácica. <ol start="4"><li> Prenda o átrio direito para permitir que o sangue e perfusato para escapar do sistema circulatório. </li></ol> Nota: Quando se trata de ratos obesos, o excesso de pericárdio EM podem precisar de ser removidas para permitir o acesso ao coração. <ol start="5"><li> Segure o coração com uma pinça e coloque delicadamente uma agulha no ventrículo esquerdo através do ápice. Lentamente perfundir o mouse com 15 ml estéril PBS. </li></ol> Nota: reduzir a taxa de perfusão se os pulmões começam a encher e expandir. <ol start="6"><li> Abra a cavidade peritoneal e remover as bolsas de gordura perigonadal usando o cuidado de evitar qualquer tecido gonadal. </li><li> Coloque bolsas de gordura em um barco pesar no gelo contendo 2 ml de 1X DPBS (sem Mg ou Ca), suplementado com 0,5% BSA, e picar a AT em pedaços finos. </li></ol>Nota: Limite a quantidade de AT por pesar barco a 1,2 g. Se a quantidade de AT superior a 1,2 g, dividi-lo uniformemente entre dois pesam barcos. <ol start="8"><li> Manter as amostras em gelo e preparar 3 ml de solução de colagenase por digest EM amostra consistindo de 1X DPBS, suplementado com 0,5% de BSA, 10 mM de CaCl2, e 4 mg / mL de colagenase tipo II. </li></ol> 3. A digestão de colagenase <ol><li> Transferir AT a 50 ml por tubos cónicos vertendo o homogeneizado e enxaguar o barco pesar com 1 ml de DPBS (0,5% de BSA) e 3 ml de solução de digestão de colagenase II. </li><li> Incubar a homogeneizado num agitador rotativo (200 rpm) a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Adicionar 10 ml DPBS (0,5% BSA) para tubos cônicos e colocar no gelo. </li><li> Tritura-se homogeneizado de numerosas vezes usando uma pipeta de 10 ml serológica, as suspensões de células e passar através de um filtro de 100 um para um novo tubo de 50 ml. </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 500 xg durante 10 min a 4 &amp; dpor exemplo; C. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células SVF em 3 ml de tampão de lise ACK para eritrócitos contaminantes. </li><li> Adicionar 12 ml de tampão de FACS e suspensão de células de centrifugação a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células SVF em tampão de FACS. </li></ol> Nota: É o tamanho do agregado de células como um guia de quanto tampão FACS para ressuspender pol Se o pellet celular cobre a parte inferior do tubo de 50 mL cónico, utilize 0,5-1 mL de tampão de FACS, caso contrário, ressuspender em 0,25-0,5 ml. <ol start="9"><li> Coloque as amostras em gelo e preparar a aliquotas de diluição de 1:10 de cada amostra para a contagem de células por mistura de 40 ul de tampão de FACS, solução de azul de tripano ul 50 (0,2%), e 10 ul de suspensão de células. </li><li> Contagem de células viáveis ​​com base na exclusão de azul de tripano e dilui-se suspensões de células a uma concentração final de 5-10 x 10 6 células / ml. </li></ol> 4. A coloração de antígenos de superfície celular <ol&gt; <li> Adicionar CD16/CD32 anti-murganho de anticorpos (bloco de Fc) para uma concentração final de 0,5-1 μg/10 6 células, e incubar em gelo durante 10 min. </li><li> Amostras de transferência (≥ 10 6 células) para 12 x mm de poliestireno tubos de fundo redondo 75. Prepare tubos separados se analisar caixas eletrônicos e células T, e combinar células extra para preparar um número suficiente de tubos para acomodar a compensação necessária e fluorescência modificada menos um (FMO) controles. </li></ol> Observação: Como um exemplo, quando a quantificação da proporção das ATMs baseado em F4/80 e CD11b, a seguinte compensação e controlos FMO terá de ser preparado - Não corado (células) - DAPI ou iodeto de propídio (PI), mancha única (células; não adicionar corante de viabilidade até que o passo 5.1) - F4/80 APC (células ou contas de compensação) única mancha - CD11b FITC células individuais da mancha (oucontas de compensação) - FMO 1 (células): + CD11b FITC corante de viabilidade de IgG2a de rato de controlo de isotipo κ APC + (adicionado no passo 5.1) - FMO 2 (células): F4/80 APC + κ IgG2b de rato de controlo de isotipo FITC corante de viabilidade + (adicionado no passo 5.1) <ol start="3"><li> Adicionar anticorpos primários fluoróforos e / ou controlos de isotipo para a concentração apropriada (ver Tabela de reagentes e materiais). </li><li> Proteger as amostras da luz e incubar a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Adicionar 2 ml de tampão de FACS e suspensão de células de centrifugação a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células SVF em 2 mL de tampão de FACS. </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 500 xg por 5 min a 4 ° C, e ressuspender o sedimento de células em SVF ≥ 400 ul de tampão de FACS. </li><li> Transferir amostras de 12 x mm de poliestireno tubos de fundo redondo de 75 equipado com um filtro de células 35 mM tubo tops.</li><li> Ao abrigo da luz, e as amostras de armazenar a 4 ° C até à análise por FACS. </li></ol> Nota: Para resultados óptimos as células devem ser analisados ​​immeadiately, no entanto, a análise de FACS com este protocolo foi realizado com sucesso em células marcadas armazenados em tampão de FACS durante 1-2 horas a 4 ° C. Se as células devem ser fixados para aumentar o tempo de armazenamento, as células marcadas podem ser fixadas com paraformaldeído a 2% a 4 ° C durante 24 horas antes da análise de FACS. Anticorpo empresas sugerem que as células marcadas podem ser armazenados durante até uma semana, no entanto, isto não foi testado no contexto do presente processo. 5. Análise FACS <ol><li> Antes da análise por FACS, adicionar corante de viabilidade para as amostras e controlos apropriados para permitir a discriminação de células vivas / mortas. </li></ol> Observação: Vários corantes de viabilidade estão disponíveis comercialmente, mas DAPI e PI são recomendados, dependendo da excitação / emissão profiles dos anticorpos conjugados com fluoróforo utilizado. DAPI e iodeto de propídio são adicionados a cada amostra a uma concentração final de 0,2 mg / ml. <ol start="2"><li> Usar uma amostra de controlo negativo não corado, de preferência, células isoladas a partir do mesmo tecido, como as amostras experimentais, para ajustar de dispersão lateral (SSC) e de dispersão frontal (FSC), de modo a que a população de células (s) de interesse são em escala. </li></ol> Nota: Para a análise de EM células SVF, recomenda-se que SSC ser apresentado numa escala logarítmica vs FSC em uma escala linear. A utilização de uma escala logarítmica para SSC é especialmente importante para a análise dos ATM, que são frequentemente muito grandes e granulares. <ol start="3"><li> Desenhar um portão de dispersão de luz inicial com base no tipo de célula (s) a ser analisado, e ajustar o tubo fotomultiplicador (PMT), o ganho de modo que as células não coradas estão na extrema esquerda de um histograma de parâmetro único (aproximadamente centrada em 10 de 2) para os canais apropriados. &lt;/ Li&gt; </ol> Nota: É recomendado que os linfócitos e macrófagos (ou outras células mielóides) ser analisada separadamente, devido a diferenças na autofluorescência. <ol start="4"><li> Use os controles manchadas individuais ou anticorpo de captura contas de compensação para realizar a compensação multi-color. </li></ol> Nota: Recomenda-se a utilização de contas de compensação, no entanto, a compatibilidade de cada anticorpo deve ser assegurada. Por exemplo, contas de compensação não pode reação cruzada com anticorpos de coelho, caso em que células isoladas são necessários para obter um controle da mancha único apropriado. <ol start="5"><li> Definir portões experimentais baseados em controles FMO modificados. </li><li> Definir o citómetro de fluxo para recolher o número apropriado de acontecimentos com base na prevalência da população de interesse e gravar dados experimentais. </li><li> Arquivos de dados de exportação FCS para análise offline. Existem vários programas disponíveis para cytometr fluxoanálise de dados y. Recomendamos Cytobank, uma plataforma baseada na web que permite investigatores para armazenar e analisar os dados e gerar dados a partir de qualquer computador com acesso à internet 18. Além disso, Cytobank oferece a capacidade de tornar acessíveis dados públicos ou restringir o acesso aos colaboradores. </li></ol>

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Não temos nada a divulgar.

O interesse crescente no papel do sistema imunológico nas consequências metabólicas da obesidade levou à utilização generalizada de citometria de fluxo para caracterizar as células imunes do TA. Embora o protocolo exacto irá variar entre laboratórios com base na sua experiência e equipamentos disponíveis, os passos críticos incluem digestão com colagenase, a centrifugação diferencial, e o antigénio da superfície da célula de rotulagem. O objetivo do presente artigo é fornecer um protocolo detalhado e guia prático para o...

Historicamente, o tecido adiposo (TA) tem sido visto como um órgão inerte de armazenamento de lípidos, a qual expande e contrai em resposta ao equilíbrio de energia. Agora entendemos que a AT representa um órgão endócrino dinâmico que secreta ativamente uma série de hormônios que influenciam diretamente no comportamento alimentar e homeostase da glicose sistêmica. Além disso, durante a última década tem havido uma apreciação crescente para as numerosas populações de células do sistema imunológico que residem na fracção vascular do estroma EM (SVF), bem como a sua contribuição para a AT homeostase. A capacidade para separar o EM adipócito e SVF utilizando uma digest de colagenase seguido de centrifugação diferencial foi descrita pela primeira vez em 1964 por Rodbell 1. Colagenase II é mais frequentemente usado para a separação dos adipócitos e SVF devido à manutenção de receptores de insulina adipócitos 1. Logo no início, fracionamento enzimática da AT foi utilizada principalmente para estudar Adipocyte metabolismo e para isolar pré-adipócitos. Mais recentemente, essa técnica, combinada com a ampla disponibilidade de cytometers fluxo eo número cada vez maior de anticorpos a fluoróforos, disponíveis comercialmente, tem facilitado a caracterização da AT células do sistema imunológico. Embora a presença de células imunes em inflamada no tinha sido descrita anteriormente 2, os papéis seminais de Weisberg et al. e Xu et al. publicado em 2003, foram os primeiros a documentar o acúmulo de AT macrófagos (ATMs) em obesidade, que secretam citocinas inflamatórias e correlacionar com a resistência à insulina AT específica e sistêmica 3,4. Estas observações serviu como a base de um novo campo de investigação recentemente inventado, &quot;immunometabolism&quot; 5, e foram acompanhados por estudos que implicam diferentes populações de células imunitárias, incluindo as células dendríticas, 6 7, mastócitos, células T 8 -10, as células B, células NK 11 12 13, eosinófilos e neutrófilos 14,15 no desenvolvimento da resistência à insulina associada a obesidade. O objetivo deste artigo é a de proporcionar uma descrição pormenorizada da técnica de digestão de colagenase usada para isolar células da EM SVF e caracterizar ATMs e AT células T através de citometria de fluxo. Este protocolo foi otimizado para mouse AT, no entanto, os telespectadores podem se beneficiar da leitura de um excelente artigo que fornece muitos detalhes sobre a otimização da técnica para o ser humano aos 16 anos. O público-alvo deste artigo inclui investigadores com pouca experiência de trabalho com o mouse AT e realizando citometria de fluxo. Várias considerações práticas para equilibrar o rendimento ea viabilidade celular com o tempo e os recursos são apresentados, bem como os controles de citometria de fluxo ideais para a caracterização de populações de células imunes. Além do nosso protocolo, os leitores são remetidoed com um artigo recente da Jove Basu et al. uma excelente discussão de alguns dos aspectos técnicos da citometria de fluxo para incluir controles e compensações 17 adequadas.

<table><tbody><tr><td>DPBS (sem Ca ou Mg) 10 x 500 ml</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>colagenase</td><td>Sigma</td><td>C6885-5G</td><td></td></tr><tr><td>solução de iodeto de propídio</td><td>Sigma</td><td>P4864-10 ml</td><td></td></tr><tr><td>pilha estável 20 microlitros</td><td>Rainin</td><td>Pontas de filtro SS-L10</td><td></td></tr> de 20 microlitros <tr><td>Pontas de filtro de 250 microlitros de pilha estável</td><td>Rainin</td><td>SRL10F</td> Pontas de 1000 microlitros Rainin SS-L250 <td></td></tr><tr><td>Pontas de filtro de 1000 microlitros</td><td>Rainin</td><td>GPS-L1000</td><td></td></tr> Pontas de filtro de <tr><td></td><td></td><td></td> 250 microlitros Rainin SR-L200F FC Block <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>filtros fisher 100mn</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>prato de pesagem média</td><td>Fisherbrand</td><td>02-202B</td><td></td></tr><tr><td>folha de alumínio</td><td>Fisherbrand</td><td>1213100</td><td></td></tr><tr><td>tesoura de picar</td><td>Fisherbrand</td><td>089531B</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>tubos FACS com filtro superior BD</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>estojo de pipeta de 10 ml 200</td><td>BD Falcon</td><td>1367520</td><td></td></tr><tr><td>tubos de fundo redondo</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 5 ml</td><td>BD Falcon</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>V Placas inferiores</td><td>Costar</td><td>07-200-107</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de bulbo de transferência</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-711-22</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>11 676 071</td><td></td></tr><tr><td>Tapete adesivo</td><td>Thermo Scientific</td><td>1368750</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de cultura de células</td><td>Sorvall</td><td>75253839</td><td></td></tr><tr><td>Adaptadores</td><td>Sorvall</td><td>75003723</td><td></td></tr><tr><td>Rato anti-rato CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Concentração: 0,5 - 1 &mu; g/ 106</td></tr><tr><td>células Rato anti-rato F4/80</td><td>eBioscience</td><td>17-4801</td><td>Conjugado de fluoróforo: APC Concentração: 0,2 &mu; g/ 106 células Número de catálogo de controle de isotipo: 17-4321</td></tr><tr><td>Rato anti-rato CD11b</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>Conjugado de fluoróforo: FITC Concentração: 0,5 &mu; g/ 106 células Número de catálogo de controle de isotipo: 11/1/4031</td></tr><tr><td>Hamster armênio anti-camundongo CD11c</td><td>eBioscience</td><td>12-0114</td><td>Conjugado de fluoróforo: PE Concentração: 0,8 &mu; g/ 106 células Número de catálogo de controle de isotipo: Dec-88</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse MGL1/2</td><td>R& D Systems</td><td>FAB4297P</td><td>Conjugado de fluoróforo: PE Concentração: 0,1 &mu; g/ 106 células Número de catálogo de controle de isotipo: IC108P</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato CD206</td><td>R& D Systems</td><td>FAB2535P</td><td>Conjugado de fluoróforo: PE Concentração: 0,1 &mu; g/ 106 células Número de catálogo de controle de isotipo: IC108P</td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CCR2</td><td>R& D Systems</td><td>FAB5538P</td><td>Conjugado de fluoróforo: PE Concentração: 0,1 &mu; g/ 106 células Número de catálogo do controle de isotipo: IC013P</td></tr><tr><td>Hamster armênio anti-rato TCR&#946;</td><td>BD Biosciences</td><td>553174</td><td>Conjugado de fluoróforo: APC Concentração: 0,2 &mu; g/ 106 células Número de catálogo de controle de isotipo: 553956</td></tr><tr><td>Rato anti-camundongo CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>552877</td><td>Conjugado de fluoróforo: PE-Cy7 Concentração: 0,8 &mu; g/ 106 células Número de catálogo de controle de isotipo: 552784</td></tr><tr><td>Rato anti-camundongo CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>557956</td><td>Conjugado de fluoróforo: Alexa Fluor 700 Concentração: 0,2 &mu; g/ 106 células Número de catálogo do controle do isotipo: 557963</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1. Lista de Materiais e Reagentes.</td></tr></tbody></table>

isolamento de tecido adiposo de células imunes

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

A descoberta de aumento de infiltração de macrófagos no tecido adiposo (TA) de roedores obesos e humanos conduziu a um interesse em intensificação da contribuição de células imunes à resistência à insulina local e sistémica. O isolamento e quantificação de populações de células imunitárias diferentes nos magros e obesos AT é agora uma técnica vulgarmente utilizada em laboratórios immunometabolism; Ainda extremo cuidado deve ser feita tanto no isolamento das células vasculares do estroma e na análise de citometria de fluxo, de modo que os dados obtidos são fiáveis ​​e podem ser interpretados . Neste vídeo demonstramos como picar, digerir, e isolar a fração de células enriquecido estroma vascular imunológico. Posteriormente, vamos mostrar como anticorpos rótulo macrófagos e linfócitos T e como fazer corretamente portão los em experimentos de citometria de fluxo. Representante de citometria de fluxo de parcelas provenientes de gordura alimentados com ratos obesos alimentados com gordura de baixa magra e alta são fornecidos. Um elemento crítico da presente análise é o uso de anticorpos que fazemnão fluorescência nos canais onde a AT macrófagos são naturalmente autofluorescent, bem como o uso de controles de compensação adequados.

A colagenase seguido de digestão de EM por centrifugação diferencial foi usado para isolar o SVF de almofadas de gordura epididimal de ratos C57BL/6J machos alimentados com baixo teor de gordura (10% kcal de gordura) ou rica em gorduras (60% kcal de gordura), dieta (LFD e HFD , respectivamente) durante 16 semanas. Células do SVF foram então marcadas com anticorpos primários fluoróforos para quantificar a percentagem de ATMs viável (Figura 1) e AT células T (Figura 2) através de análise ...

O tecido adiposo (TA) é um site de ativação imune celular intensa e interação. Quase todas as células do sistema imune estão presentes em AT e as suas proporções são alteradas pela obesidade. Isolamento adequado, quantificação e caracterização de populações de células imunes são fundamentais para a compreensão do seu papel na doença immunometabolic.

Isolamento de tecido adiposo de células imunes

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar as células imunes do tecido adiposo. Isso é feito removendo primeiro as almofadas de gordura epidérmica. Na segunda etapa, o tecido adiposo é digerido com colagenase.Em seguida, a fração da vasculatura estromal do tecido adiposo é isolada por centrifugação diferencial. Na etapa final, as células imunes do tecido adiposo são marcadas com anticorpos primários conjugados com flúor quatro. Em última análise, a proporção de macrófagos viáveis e células T que residem no tecido adiposo pode ser quantificada por citometria de fluxo.Olá, sou Alyssa Hasty. Hoje mostraremos como isolar e quantificar células imunes do tecido adiposo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do imunometabolismo, como como as populações de células imunes no tecido adiposo mudam após a manipulação genética farmacológica ou nutricional.Demonstrando o procedimento hoje estarão Arian Kennedy e Jeb, ou bolsistas de pós-doutorado em meu laboratório. Depois de molhar bem o pelo do animal sacrificado com etanol a 70%, faça uma incisão ao nível do processo xifóide e abra a cavidade torácica para expor o coração, tomando cuidado para não cortar nenhum vaso sanguíneo importante. Em seguida, corte o átrio direito para permitir que o sangue e o perfu oito saiam do sistema circulatório.Em seguida, use uma pinça para segurar o coração e insira suavemente uma agulha através do ápice no ventrículo esquerdo. Agora, lentamente, perfunda o mouse com 15 mililitros de PBS estéril. Em seguida, abra a cavidade peritoneal e remova as almofadas de gordura gonadal com cuidado para evitar qualquer tecido gonadal.Coloque as almofadas de gordura em um barco de soro de leite no gelo contendo dois mililitros de DPBS livre de magnésio e cálcio suplementado com 0,5% BSA e, em seguida, pique o tecido adiposo em pedaços finos. É assim que a gordura deve ficar após a conclusão da picagem. Agora despeje o homogeneizado de tecido adiposo picado em um tubo cônico de 15 mililitros.Enxágue o webo com um mililitro de DPBS suplementado com BSA e despeje a lavagem no tubo cônico. Em seguida, enxágue o barco WHE com três mililitros de solução de colagenase e despeje a lavagem no tubo. Incube o homogêneo em um agitador rotacional por 20 minutos a 200 RPM e 37 graus Celsius.Em seguida, adicione 10 mililitros de DPBS suplementado com BSA ao homogenato usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros. Em seguida, itere o homogeneizado digerido várias vezes e coloque o tubo no gelo. Passe a suspensão celular através de um filtro de 100 micrômetros para um novo tubo cônico de 50 mililitros.Depois de girar as células, decantar o snat e, em seguida, piolhos os eritrócitos contaminantes dentro do pellet de células da fração vascular estromal. Com três mililitros de um tampão CK. Adicione rapidamente o buffer de fax para neutralizar o buffer A CK.Após a lavagem e a repressão da peletização, as células ressuspendem o pellet no tampão de fax. Em seguida, conte as células viáveis por exclusão de azul triano e dilua ainda mais a suspensão celular até uma concentração final de cinco a 10 vezes 10 elevado a seis células por mililitro. Comece a coloração incubando as células com anticorpo bloqueador de CD 16 e CD 32 FC anti-US até uma concentração final de 0,5 a um micrograma por 10 nas seis células por 10 minutos no gelo.Em seguida, divida as células em maior ou igual a 10 elevado às seis alíquotas e transfira as alíquotas para tubos de fundo redondos de poliestireno de 12 por 75 milímetros. Combine quaisquer células extras em um número adequado de tubos para acomodar a compensação necessária e a fluorescência modificada menos um controle. Em seguida, adicione anticorpos primários conjugados com flúor quatro e controles de isotipo aos tubos apropriados nas concentrações apropriadas.Depois de incubar as amostras no escuro a quatro graus Celsius por 30 minutos, lave as amostras duas vezes em dois mililitros de tampão de fax Resus suspendendo os pellets em maior ou igual a 400 microlitros de tampão de fax Após a segunda lavagem, transfira as amostras para novos tubos de fundo redondo de poliestireno de 12 por 75 milímetros equipados com topos de tubo de filtro de célula de 35 micrômetros. Imediatamente antes da análise, adicione uma matriz de viabilidade para discriminação de células mortas vivas às amostras apropriadas. Em seguida, use um controle negativo não corado para ajustar a dispersão lateral em uma escala logarítmica e a dispersão direta em uma escala linear.Em seguida, desenhe uma porta de dispersão de luz inicial com base no tipo de célula que está sendo analisada e ajuste o ganho do tubo fotomultiplicador para que as células não coradas fiquem na extremidade esquerda de um histograma de parâmetro único aproximadamente centralizado na tendência das duas marcas para os canais apropriados. Usando contas de compensação de captura de anticorpos, execute a compensação multicolorida e, em seguida, defina as portas experimentais com base na fluorescência modificada previamente preparada menos um controles. Finalmente, colete o número apropriado de eventos com base na prevalência da população de interesse e registre os dados experimentais.Nesta primeira série de gráficos de densidade, as células da fração vascular estromal isoladas do tecido adiposo epidérmico urinário foram coradas para F quatro 80 e CD 11 B para a identificação de macrófagos de tecido adiposo. Esses três primeiros painéis demonstram a estratégia inicial de gating, incluindo a discriminação de dupletos de dispersão de luz e portas de viabilidade. Nestes próximos dois painéis, a fluorescência modificada representativa menos um controles usados para definir as portas experimentais pode ser observada.Neste exemplo, os anticorpos F quatro 80 e CD 11 B foram substituídos por controles de isotipo apropriados para levar em conta a autofluorescência e a ligação não específica. As portas do quadrante foram então desenhadas para identificar os quatro macrófagos de tecido adiposo positivos para F quatro 80 CD 11 B. A proporção de F quatro macrófagos de tecido adiposo positivos para CD 80 positivos 11 B isolados de camundongos alimentados com baixo e alto teor de gordura poderia então ser comparada conforme ilustrado nesses gráficos de densidade representativos.Nesta próxima série de painéis, a porta de dispersão de luz inicial foi restrita à população de linfócitos, a fim de evitar a inclusão de células mieloides autofluorescentes. Nestes dois últimos pares de painéis, é mostrado o gating representativo para células T do tecido adiposo CD quatro positivas e CD oito positivas. Os linfócitos viáveis do tecido adiposo foram inicialmente bloqueados para TCR R beta tcr.As células T do tecido adiposo beta positivo R foram então bloqueadas para a expressão de CD quatro e CD oito. A proporção de células T beta positivas para TCR e de células T CD quatro positivas e oito positivas isoladas do tecido adiposo de camundongos alimentados com alto e baixo teor de gordura pôde então ser comparada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar as células imunológicas do tecido adiposo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células-tronco derivadas do tecido adiposo do arco periaórtico murino marcadas com fluorescência (ADSCs) do tecido adiposo do arco periaórtico murino. Após o isolamento, os NCADSCs são detectados, classificados usando classificação de células ativadas por fluorescência e, posteriormente, cultivados em uma placa, promovendo a proliferação celular.

Isolando células-tronco derivadas de tecido adiposo do tecido adiposo periaórtico murino

Em 2001, pesquisadores da UCLA descreveu o isolamento de uma população de células-tronco adultas, chamadas células-tronco derivadas de tecido adiposo ou ASC, a partir de tecido adiposo. Este artigo descreve o isolamento de ASC de lipoaspirates usando, um protocolo de digestão enzimática manual utilizando colagenase.

Isolamento manual de células-tronco adiposo-derivadas de Lipoaspirates Humanos

Devido à conexão drástica e negativa entre a obesidade e outras comorbidades, a investigação sobre o papel adiposo desempenha na doença e na saúde global é garantido. Apresenta-se um protocolo para o isolamento e a excisão de depósitos adiposos que permitam o estudo de tecido adiposo usando in situ e in vitro.

Localização, identificação e excisão de Depots Murino adiposo

Apresentamos as técnicas necessárias para isolar a fração vascular estromal (SVF) de depósitos de tecido adiposo inguinal (subcutâneo) e perigonadal (visceral) de camundongos para avaliar sua expressão gênica e atividade colagenolítica. Este método inclui o enriquecimento de células-tronco derivadas de alto teor adiposo (ASCs) Sca1 usando separação celular imunomagnética.

A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica<sup&gt; alta</sup&gt; células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASC)

Esta publicação descreve um protocolo para o isolamento de núcleos de adipócitos maduros, purificação por classificação ativada por fluorescência e transcrição de nível unicelular.

Isolamento dos núcleos tecilódico adiposos para aplicações genômicas unicelulares

Este protocolo descreve a abordagem técnica para isolar subpopulações de células estromais adipogênicas e fibroinflamatórias de depósitos de tecido adiposo branco intra-abdominal murino (WAT) por classificação de células ativadas por fluorescência ou separação de esferas imunomagnéticas.

Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos

Apresentamos um método simples para isolar células progenitoras adiposas altamente viáveis de almofadas de gordura epidímica do rato usando a triagem celular ativada por fluorescência.

Preparação de células progenitoras adiposas adiposas de tecidos adiposos epidímicos do rato

Este protocolo fornece um método eficiente de digestão de colagenase para isolamento de adipócitos viáveis e células da fração vascular estromal-SVF da gordura visceral humana em um único processo, incluindo metodologia para obtenção de RNA de alta qualidade a partir de adipócitos e fenotipificação de macrófagos SVF através da coloração de múltiplos marcadores ligados à membrana para análise por citometria de fluxo.

Isolamento de Adipócitos Viáveis e Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Visceral Humano Adequado para Análise de RNA e Fenotipagem de Macrófagos

Este protocolo descreve o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de um dissociador tecidual para digestão da colagenase reduz a variação experimental e aumenta a reprodutibilidade.

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

Aqui, apresentamos um método padrão para isolar eficientemente células-tronco e adipócitos derivados do adiposo, caracterizado por redução de &gt;90% no tempo de processamento, alta viabilidade celular e ampla compatibilidade.

Isolamento Eficiente de Células-Tronco e Adipócitos Derivados do Adiposo a partir do Tecido Adiposo Suíno

Aprenda a isolar células imunes de tecido adiposo usando digestão com colagenase e centrifugação diferencial. Este método permite quantificar macrófagos e linfócitos T por citometria de fluxo para estudos em imunometabolismo.

Isolamento de tecido adiposo de células imunes

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