Name: Um ensaio de migração celular quantitativo para murinos progenitores neurais entéricas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T15:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a quantificar a migração de progenitores neurais entéricos murinos usando ensaio ex vivo com fatias intestinais em gel de colágeno e microscopia de fluorescência. Este método auxilia no estudo de fatores de crescimento e biologia do desenvolvimento.

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Agradecemos Denis Flipo para o conselho de processamento e análise de imagem, e David W. Silversides em cujo laboratório a linha de rato Gata4p [5kb]-GFP foi gerada. Pesquisas em laboratório Pilon é financiado pelo CIHR, NSERC, FRQS e FRQNT.

Declaração de Ética Experimentos envolvendo camundongos foram realizadas seguindo Conselho Canadense de diretrizes de cuidados com animais para o cuidado e manipulação de animais utilizados em pesquisas médicas. Protocolos que envolvem a manipulação de animais foram aprovados pelo comitê de ética institucional da Universidade do Quebec em Montreal (Comité Institutionnel de Proteção des Animaux; número de referência 0512-R3-650-0513). 1. Preparação de Colágeno Gel Trabalhar de forma estéril, sob uma capa de cultura de tecidos. <ol><li> Prepare completa 5x DMEM (meio essencial modificado de Eagle), incluindo antibióticos padrão. Dissolve-se 3,37 g de pó de DMEM e 0,925 g de NaHCO3 em 20 ml de água. Esterilizar por passagem através de um filtro de 0,22 um. Adicionar 2,5 ml de solução estéril de 100x de penicilina / estreptomicina e 25 ml de soro fetal bovino inactivado pelo calor estéril. Armazenar a 4 ° C. </li><li> No gelo, misture 800 mLO colagénio de solução I (3,77 mg / ml em 0,02 N de ácido acético, esterilizada por filtração), 600 ul de DMEM completo 5x e 17 ul de NaOH 1 N. Dilui-se com água estéril para um volume final de 3 ml. Incluir fatores de crescimento relevantes na mistura. Normalmente, utilizar o GDNF a 10 ng / ml para estimular a migração NCC entérico. </li><li> Depositar cerca de 480 mL em cada poço de uma única linha de uma placa de 24 poços. Evite bolhas. As restantes linhas pode ser usado para testar os efeitos de outros factores de crescimento sobre a migração das células. </li><li> Deixe o colagénio polimerizam, pelo menos, 1 hora numa incubadora esterilizada, a 37 ° C. </li></ol> 2. Dissecção de Animais 16 <ol><li> Configure acasalamentos e verificar se há plugs vaginais na manhã seguinte. E0.5 Day sendo meio-dia no dia a ficha vaginal for encontrado, isolar a fêmea e esperar 12 dias até E12.5. </li><li> Anestesiar ratos grávida com isoflurano e eutanásia por inalação de CO 2. </li><li> Pulverizar o mouse com etanol 70%. Levante as s abdômenparentes e abrir a cavidade abdominal com uma tesoura de dissecação. </li><li> Remover o útero para uma placa de Petri de vidro cheio com PBS gelado (soro fisiológico tamponado com fosfato). Corte o útero transversalmente entre inchaços deciduum individuais para isolar cada local de implantação do embrião. </li><li> Trabalhar em cada local de implantação separadamente em outra placa de Petri de vidro cheio de PBS gelado. Sob um microscópio de dissecação, utilizar uma pinça fina para remover a camada muscular do útero. </li><li> Abrir o saco vitelino visceral e âmnio para revelar o embrião. Tome cuidado ao cortar os vasos sanguíneos se juntar o embrião para a placenta / visceral saco vitelino, como eles estão interligados com os intestinos em desenvolvimento. </li><li> Cortar a cabeça do embrião no pescoço. </li><li> Insira um fórceps fechadas na cavidade abdominal de um embrião, logo acima do fígado de cor vermelho escuro e deixar a pinça aberta de si mesmo (deixar de aplicar pressão) para fazer uma abertura transversal na cavidade abdominal. Puxe as pinças abertas para baixo em direçãoa extremidade posterior do embrião para abrir completamente o abdómen. </li><li> Pegue o tecido conjuntivo por trás do fígado e puxar as tripas para fora do abdômen, tomando cuidado para não quebrar o intestino (cólon é ligado ao ânus). </li><li> Cortar o cólon para libertar as entranhas do resto do embrião. O corte pode ser feito em qualquer local ao longo do cólon. Reserve a parte da cauda para mais tarde. </li><li> Tease do tecido conjuntivo a partir do ceco, em seguida, o resto dos intestinos. Tenha cuidado para não ferir os intestinos ao fazê-lo. </li><li> Cortar o fígado e estômago (na extremidade rostral do intestino delgado), bem como os mesonefros e cristas genitais, se algum estiver presente. </li><li> Isolar o intestino delgado. Mais uma vez, tome cuidado para não cortar o intestino. A partir de agora, a orientação rosrrocaudal do tecido intestinal pode ser monitorado usando a curvatura acentuada presente na extremidade rostral. Deixar o intestino delgado em PBS à temperatura ambiente durante um tempo tão curto quanto possível, antes de incama (veja o passo 3.3). </li><li> Por fim, registrar o número de somitos cauda para cada embrião para determinar com precisão o estágio de desenvolvimento embrionário. </li></ol> 3. Seccionamento das embrionárias Intestines <ol><li> Antes de prosseguir com a dissecção de embrião, derreter 1,5 g de agarose em 100 ml de PBS (solução salina tamponada com fosfato) e manter a 50 ° C. </li><li> Despeje agarose fundida num molde de incorporação (por exemplo, um sistema fechado de 2 ml tubo de microcentrífuga que foi cortado longitudinalmente para excisar a cerca de 1/4 da parede do tubo). Deixe a agarose arrefecer para cerca de 42-45 ° C, deve ser apenas ligeiramente quente ao toque. </li><li> Incorporar o intestino embrionário pouco antes das solidifica agarose (esta pode ser avaliada com fórceps dicas e irá ocorrer em torno de 36-38 ° C). Segurando o intestino com uma pinça pela extremidade rostral dobrado, puxá-lo muito lentamente através da agarose ao longo do comprimento do molde. Isso ajuda a manter o intestino reto, enquanto os conjuntos de agarose. Solte o temitir assim que começa a resistir a ser movido. Mantenha o controle da orientação rostral-caudal do intestino. </li><li> Coloque o molde no frigorífico 2-3 minutos, para assegurar que a agarose completamente definido. </li><li> Retire a agarose a partir do molde (deslizando-o para fora do tubo Eppendorf abertas). Com uma lâmina, retirar o excesso de agarose em ambas as extremidades, fazendo cortes perpendiculares para o intestino. </li><li> Cole a extremidade rostral do intestino / agarose a bloquear-se na fase de metal de um micrótomo de lâmina vibrante. Aparar o excesso de agarose sobre os lados do bloco de intestino / agarose. </li><li> Monte a fase de metal na câmara de micrótomo vibrando. Se necessário, ajustar o ângulo da fase de modo que o intestino é mais vertical possível (portanto, perpendicular à lâmina). Cobrir as amostras com PBS gelado. Traga a lâmina de micrótomo até alguns milímetros abaixo da superfície do buffer. </li><li> Fazer 200 mM vibratome transversais cortes do intestino caudal-mais pequenos, garantindo que each fatia agarose contém uma seção intestinal completo. </li></ol> 4. Cultura da Intestinal explantes <ol><li> Gentilmente depositar o fatias intestino / agarose recém-cortadas plana para os géis de colágeno, com uma pinça, colocando uma fatia para o meio de cada poço. </li><li> Incubar 3 dias a 37 ° C, em húmido 5% de CO2, para permitir a migração de NCC fora do explante. </li><li> Leve as fatias de intestino / agarose fora do gel de colágeno muito delicadamente com uma pinça. Tome cuidado para não danificar o gel abaixo. </li><li> Evitar tocar directamente o gel de colagénio, durante o tempo de incubação e de lavagem de passos subsequentes, a fim de garantir que o padrão de migração de células não é perturbado. Fixar com 500 mL de 4% PFA (paraformaldeído) (em PBS) por poço 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Substituir o fixador com 500 mL de DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindole) de solução (5 ug / ml em PBS) por poço e incubar 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Lave cada poço 3xcom 500 ul de PBS durante 5 min. </li><li> Fotografar as células fluorescentes (canais GFP e DAPI) incorporados no gel de colágeno dentro de cada poço. </li></ol> 5. Análise de Imagem Fizemos uso extensivo de ImageJ 17 para processar e quantificar as imagens geradas após cultura explante. <ol><li> Comece imaginando um slide micrômetro com a mesma ampliação como as fotografias de células fluorescentes. Meça o comprimento de um mícron de pixels (utilizando a ferramenta linha reta). </li><li> Defina a escala (Analyze / Set Scale, o número de entrada de pixels / micron). </li><li> Para cada fotografia GFP fluorescência, mude o formato de imagem para 8 bits em tons de cinza (Image/Type/8-bit). </li><li> Ajuste a intensidade do sinal (Imagem / Ajustar / Brilho / Contraste). </li><li> Subtrair o ruído de fundo, se necessário (Processo / Subtrair fundo, ajustar o raio de bola rolando). </li><li> Definir um limite para destacar as células e aglomerados de células (Imagem / Ajustar / Threshold), on aplicar um divisor de águas para dividir as touceiras (Processo / Binário / Bacia Hidrográfica). </li><li> Analisar partículas para especificar regiões de interesse (ROI) e gerar estatísticas de número de células (Analisar / Analisar Partículas; tamanho conjunto mínimo de excluir restantes pixels). </li><li> Definir opções de medida para incluir o diâmetro de Feret (Analyze / Definir Medidas). </li><li> Grupo ROIs e medir como um todo para determinar o diâmetro de Feret, uma indicação de difusão celular (Análise / Ferramentas / ROI Gerente / Mais / OU, então Gerente de ROI / Adicionar e ROI Gerente / Measure). </li></ol>

<ol><li>Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+neural+crest%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+genetics+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Genet%22%5BJournal%5D)">The developmental genetics of Hirschsprung's disease.</a> Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).</li>
<li>Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+developmental+disorders+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Development and developmental disorders of the enteric nervous system.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).</li>
<li>Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).</li>
<li>Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+agenesis+and+the+absence+of+enteric+neurons+in+mice+lacking+GDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF.</a> Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).</li>
<li>Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+endothelin-3+with+endothelin-B+receptor+is+essential+for+development+of+epidermal+melanocytes+and+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons.</a> Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).</li>
<li>Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin-3+is+required+for+the+survival-differentiation+of+subsets+of+developing+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons.</a> J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).</li>
<li>Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+is+necessary+for+neural+crest+cell+migration+and+ganglion+formation+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system.</a> Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).</li>
<li>Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+and+DCC+in+the+guidance+of+migrating+neural+crest-derived+cells+in+the+developing+bowel+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas.</a> Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).</li>
<li>Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signals+regulate+multiple+aspects+of+gastrointestinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development.</a> Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).</li>
<li>Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+signaling+by+receptor+tyrosine+kinase+RET+for+the+directed+migration+of+enteric+nervous+system+progenitor+cells+during+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis.</a> Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).</li>
<li>Young, H. M., Hearn, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDNF+Is+a+chemoattractant+for+enteric+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells.</a> Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).</li>
<li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease%2C+associated+syndromes+and+genetics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li>
<li>Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+pre-+and+post-gastrulation+expression+of+Gata4+within+cells+of+the+inner+cell+mass+and+migratory+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells.</a> Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).</li>
<li>Nagy, N., Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-3+regulates+neural+crest+cell+proliferation+and+differentiation+in+the+hindgut+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual</a>. , 3rd ed, CSH Press. Cold Spring Harbor. 209-250 (2003).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Byth, K. F., Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AZD5438%2C+a+potent+oral+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1%2C+2%2C+and+9%2C+leads+to+pharmacodynamic+changes+and+potent+antitumor+effects+in+human+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts.</a> Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nós mostramos como nosso ex vivo explante técnica de cultura pode ser usada para quantificar com precisão entérico potencial de migração NCC na presença de GDNF. Essa quantificação precisa é muito facilitada usando 200 seções vibratome intestino m de espessura em vez de grandes pedaços de tamanho aproximado, como descrito anteriormente 11,12,15. Na verdade, isso nos permite trabalhar com um número razoável de células em um ambiente altamente reprodutível. De nota, a distribuição uniforme de fluorescê...

Células da crista neural (NCC) são um tipo de célula transitória única de vertebrados que forma muitos derivados durante o desenvolvimento do embrião. Esta população de células surge na fronteira da placa neural, ao lado ectoderma não-neural 1. Durante neurulação, curvatura da placa neural NCC lugares ao longo do bordo dorsal do tubo neural formando. NCC então sofrer uma transição epitelial-mesenquimal, segregar e migrar para longe do tubo neural. NCC colonizar várias estruturas embrionárias, incluindo o tracto digestivo onde formam todo o sistema nervoso entérico (ENS), uma rede interligada de gânglios neurais embutido na parede do intestino. Como recentemente revisou de 2,3, muitos genes foram envolvidos no desenvolvimento desta estrutura intrincada. A maior parte do ENS é derivado de uma pequena piscina de NCC proveniente do tubo neural vagal (ou seja, em torno do potencial limite rombencéfalo / medula espinal) 4.Estes progenitores neurais chegar ao intestino anterior em torno do dia embrionário (e) 9,0 em ratos e depois migrar caudalmente dentro do mesênquima intestino até aproximadamente e15.0 para colonizar todo o intestino embrionárias. Um subconjunto menor de células progenitoras neurais cólon também é fornecida por sacral NCC, que invadem o intestino posterior na direcção oposta até ao ceco 4. Ambos vagal e sacral NCC requerem múltiplos migração, proliferação, sobrevivência e-sinais de promoção de diferenciação para garantir a formação completa do ENS. A este respeito, os modelos animais - especialmente ratos geneticamente modificados - têm sido fundamentais para a identificação de vários ligandos extracelulares essenciais: GDNF (factor neurotrófico derivado de células gliais),,, (proteínas morfogenéticas do osso) BMPs neurotrofina-3 endotelina-3, Netrin , assim como Sonic e indiano Hedgehog (Shh e Ihh) 5-10. Destes, o GDNF a sinalização através de RET receptor transmembranar da tirosina quinase (Rearranged durante a transfecção), é reconhecido como the caminho mais crítico para a atração e orientação do NCC e para dentro do intestino embrionário. O GDNF é secretada pelo mesênquima intestino e forma um gradiente rosrrocaudal espaço-temporalmente controlado, que é directamente quimioatratante para entérico NCC, que expressam RET 11,12. Entre outras funções, o ENS regula o movimento no interior do tracto digestivo através da sua interacção com o músculo liso na parede intestinal. Ausência de gânglios neural na região terminal dos resultados intestinais na doença de Hirschsprung: a contração tônica do segmento afetado leva ao bloqueio, a acumulação a montante do material digerido e distensão maciça do intestino e abdômen. Doença de Hirschsprung ocorre cerca de um em 5.000 nascidos vivos. O padrão de migração rostro-caudal de entérico NCC é acreditado para ser o principal fator de contribuição à etiologia da doença de Hirschsprung. O cólon, mais afastada da fonte de migrar NCC e última porção de bowel a ser colonizada, é mais suscetível a defeitos na formação ENS. De acordo com o seu papel crucial na migração NCC entérico, a interrupção da sinalização GDNF / RET é a principal causa genética conhecida da doença de Hirschsprung 13. Para melhor estudar NCC e desenvolvimento ENS, geramos uma linha de camundongo transgênico - chamado Gata4p [5kb]-GFP 14 - em que migratório NCC são rotulados com Proteína Fluorescente Verde (GFP). A seguir, aperfeiçoou um ensaio ex vivo, a migração celular, adaptado a partir de trabalhos publicados por outros grupos 11,12,15, que agora permite a quantificação precisa do potencial de migração entérico NCC na presença de vários factores de crescimento, tais como o GDNF.

<table><tbody><tr><td>Pó DMEM</td><td>Wisent</td><td>219-010-XK</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td>Sistema</td></tr><tr><td>de filtração a vácuo Steriflip de grau biotecnológico (0,22 mícron)</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina, 100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Wisent</td><td>095-150</td> Colágeno I BD de <td>alta qualidade</td></tr><tr><td></td><td>biosciences</td><td>354236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Bioshop</td><td>SHY700</td><td>Diluído a partir de estoque de 10 N e depois filtrado estéril</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Cedarlane</td><td>CLCYT305</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 24-well Plate</td><td>BD biosciences</td><td>353047</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>Fisher Scientific</td><td>089515</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidro</td><td>VWR</td><td>89000-306</td><td>&nbsp;</td></tr>Microscópio de dissecação <tr><td>de grau de cultura de células</td> <td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>M125</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11251-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lâmina cirúrgica de</td><td>grau biotecnológico</td><td>Agarose Bioshop AGA001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Feather</td><td>21</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Caneta de Cola Krazy Instantânea Multiuso Krazy</td><td>Glue</td><td>KG824</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Micrótomo de Lâmina Vibratória HM 650V</td><td>Thermo Scientific</td><td>920110</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela de reagentes e equipamentos específicos.</td></tr></tbody></table>

um ensaio de migração celular quantitativo para murinos progenitores neurais entéricas

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Células da crista neural (NCC) é uma população de células multipotentes transitória e que se origina a partir do tubo neural dorsal e migra extensivamente em todo o embrião de vertebrados em desenvolvimento. Além de proporcionar a glia e os neurónios periféricos, NCC gerar melanócitos, bem como a maior parte do esqueleto crânio-faciais. A migração e diferenciação NCC é controlada por uma combinação da sua origem axial ao longo do tubo neural e sua exposição a estímulos extracelulares regionalmente distintas. Tal contribuição de ligandos extracelulares é especialmente evidente durante a formação do sistema nervoso entérico (ENS), uma rede de complexo interligado de gânglios neurais que controla localmente (entre outras coisas) o movimento do músculo do intestino e motilidade intestinal. A maior parte do ENS é derivado a partir de um pequeno conjunto inicial de NCC que empreender um longo percurso, a fim de colonizar - num rostral para caudal moda - todo o comprimento do intestino prospectivo. Entre as várias vias de sinalização conhecidosinfluenciar colonização NCC entérico, GDNF / sinalização RET é reconhecido como o mais importante. Na verdade, a secreção de espaço-temporalmente controlada do RET ligante GDNF pelo mesênquima intestino é o principal responsável para a atração e orientação de expressar-RET entérico NCC para e dentro do intestino embrionário. Aqui, nós descrevemos um ensaio ex vivo, a migração de células, fazendo uso de uma linha de ratinho transgénico possuindo marcado por fluorescência NCC, que permite a quantificação precisa do potencial de migração entérico NCC na presença de vários factores de crescimento, incluindo o GDNF.

Os seguintes resultados são representativos do que pode ser obtida com a técnica descrita aqui (Figura 1). O uso de factores de crescimento (isto é, de GDNF) estimula a migração dos entérico NCC fora do explante intestinal e no gel de colagénio-expressando GFP (Figura 2). Embora algumas células sair do explante, na ausência de factores de crescimento, estes não são mais marcadas com GFP e representam entrada passiva. É necessário remover a fatia intestinal a partir do gel de co...

Apresenta-se um ensaio de migração de células ex vivo que permite a quantificação precisa do potencial de migração de células de crista neural entérico na presença de vários factores de crescimento.

Um ensaio de migração celular quantitativo para murinos progenitores neurais entéricas

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar o potencial de migração de neuroprogenitores entéricos na presença de diversos fatores de crescimento. Isso é realizado primeiramente dissecando intestinos delgados de embriões de camundongo colonizados por células neurocristais fluorescentes. O segundo passo consiste em utilizar um microtomo vibratório para obter fatias de intestino com 200 mícrons de espessura.Em seguida, essas fatias são incubadas sobre um gel de colágeno contendo fatores de crescimento. O passo final é destacar as fatias para revelar as células migratórias localizadas abaixo. Em última instância, a microscopia de fluorescência é utilizada para mostrar o padrão de células migratórias dentro do gel de colágeno.Este método pode ajudar a responder uma questão fundamental na biologia do desenvolvimento, como proporcionar uma melhor compreensão da interação entre diversas vias de sinalização subjacentes à formação do sistema nervoso periférico. Doze dias após a detecção do tampão vaginal, eutanasiar o camundongo fêmea e remover o útero, colocando-o em uma placa de Petri de vidro contendo gelo. Com PBS frio, cortar o útero transversalmente entre os inchaços individuais

a-quantitative-cell-migration-assay-for-murine-enteric-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós demonstramos que a expressão de receptores de mais de fator de crescimento epidérmico (EGFR) aumenta a motilidade das células-tronco neurais (NSCs) usando um romance agarose gel com base em dispositivo microfluídicos. Esta tecnologia pode ser facilmente adaptável a outros sistemas de células de mamíferos, onde fontes de células são escassos, como células-tronco neurais, ea volta em torno do tempo é crítica.

Avaliar motilidade celular Neural Stem Usando um dispositivo Agarose Gel baseado microfluídicos

Este protocolo descreve um ensaio fatia organotípicas otimizado para o cérebro pós-natal e imagens de alta resolução de lapso de tempo de migração neuroblastos no fluxo migratório rostral.

Um Ensaio Slice organotípicas para High-Resolution Imaging Time Lapse de migração neuronal no cérebro pós-natal

Neste protocolo demonstramos como construir câmaras personalizados que permitem a aplicação de um campo elétrico de corrente contínua para permitir lapso de tempo de imagem do cérebro adulto derivado translocação de células neurais precursor durante galvanotaxis.

Um Ensaio Galvanotaxis para Análise de Precursores Neurais Cinética migração celular em um campo aplicado externamente Corrente Contínua Elétrica

Este vídeo demonstra o ensaio de migração da neuroesfera de células precursoras neurais - um ensaio in vitro para estudar a resposta migratória de células precursoras neurais da neuroesfera - por meio de análise microscópica.

Ensaio de Neuroesfera NPC: Um Ensaio In Vitro para Avaliar a Resposta Migratória de Células Precursoras Neurais da Neuroesfera

Aqui descrevemos uma célula de Schwann (SC) ensaio de migração em que SCs são capazes de desenvolver ao longo dos axônios estendem.

Analisando o desenvolvimento de células de Schwann Murino Junto axônios em crescimento

Migração neuroblastos é um passo crucial na neurogênese pós-natal. O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para investigar o papel dos reguladores de candidatos de migração neuroblastos empregando DNA / RNA pequeno hairpin (shRNA) nucleofection e um ensaio de migração 3D com neuroblastos isolados do roedor pós-natal fluxo migratório rostral.

Nucleofection de roedores Neuroblastos para estudar neuroblasto Migração<em&gt; In vitro</em

O transplante de células-tronco / progenitoras neurais (NPCs) detém grandes promessas em neurologia regenerativa. A administração sistêmica de NPCs se transformou em baixo invasivo e muito eficaz terapeuticamente protocolo eficaz, para entregar as células-tronco no cérebro e na medula espinhal de roedores e primatas não-humanos que sofreram prejuízos inflamatória crônica experimental do sistema nervoso central.

Injeção sistêmica de células-tronco neurais / progenitoras em ratos com EAE crónica

A transição epitelial para mesenquimal (EMT) permite que os cânceres se tornem invasivos. Para investigar a EMT, é descrito um modelo in vitro baseado em células-tronco neurais (NSC) desprovido de soro e enzimas. Este sistema padronizado permite a avaliação quantitativa e qualitativa da migração celular, expressão gênica e proteica. O modelo é adequado para a descoberta de medicamentos.

Um Modelo de enzimas e Cultura de Células-Tronco Neural Serum-livre para EMT Investigation Adequado para Drug Discovery

Desenvolvimento neurológico processos tais como consequência natural do axônio, migração e proliferação são frequentemente perturbadas em doenças neuropsiquiátricas. Assim, apresentamos protocolos para rapidamente e reproducibly avaliar estes processos de desenvolvimento neurológico em NPCs de iPSC-derivado humanos. Estes protocolos permitem também a avaliação dos efeitos da terapêutica e fatores de crescimento relevantes no desenvolvimento do NPC.

Detecção rápida de desenvolvimento neurológico fenótipos nas células precursoras neurais humanas (NPCs)

Apresentamos três simples ensaios in vitro - o ensaio migratório de longa distância, o ensaio de migração de cocultura, e o ensaio de atração de quimioterapia - que avaliam coletivamente as funções das células-tronco humanas derivadas células endoteliais periventriculares e suas interação com interneurônios GABAergic.

Migração, Quimio-Atração e Ensaios de Cocultura para Células Endoteliais derivadas de células-tronco humanas e neurônios gabaergicos

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.

Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário

Aprenda a quantificar a migração de progenitores neurais entéricos murinos usando ensaio ex vivo com fatias intestinais em gel de colágeno e microscopia de fluorescência. Este método auxilia no estudo de fatores de crescimento e biologia do desenvolvimento.

Um ensaio de migração celular quantitativo para murinos progenitores neurais entéricas

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