Um ensaio de migração celular quantitativo para murinos progenitores neurais entéricas

O objetivo geral deste procedimento é quantificar o potencial de migração de neuroprogenitores entéricos na presença de vários fatores de crescimento. Isso é feito dissecando primeiro o intestino delgado embrionário de camundongo povoado por células neurocrostas fluorescentes. O segundo passo é usar um micrótomo vibratório para fazer fatias de intestinos de 200 mícrons de espessura.

Em seguida, essas fatias são incubadas em cima de um gel de colágeno contendo fatores de crescimento. A etapa final é descascar as fatias para revelar as células migratórias por baixo. Em última análise, a microscopia de fluorescência é usada para mostrar o padrão de migração de células dentro do gel de colágeno.

Este método pode ajudar a responder a uma questão-chave na biologia do desenvolvimento, como fornecer uma melhor compreensão da interação entre várias vias de sinalização subjacentes à formação do sistema nervoso periférico. 12 dias após a descoberta de um tampão vaginal, eutanasiar a rata e remover o útero, colocar o útero em uma placa de Petri de vidro cheia de gelo. O PBS frio cortou o útero transversalmente entre inchaços individuais do deum para isolar cada local de implantação do embrião sob um microscópio de dissecação, use uma pinça fina para remover a camada muscular do útero.

Abra o saco vitelino visceral e o âmnio para revelar o embrião. Tome cuidado ao cortar os vasos sanguíneos, unindo o embrião ao saco vitelino, pois eles estão entrelaçados com os intestinos em desenvolvimento. Em seguida, insira uma pinça fechada na cavidade abdominal logo acima do fígado de cor vermelha escura e deixe-a abrir.

Isso cria uma abertura transversal na cavidade do abdômen. Puxe a pinça aberta para baixo em direção à extremidade posterior do embrião para abrir o abdômen completamente. Depois de aberto, pegue o tecido conjuntivo atrás do fígado e puxe as entranhas para fora.

Tomando cuidado para não quebrar os intestinos. Corte o cólon em qualquer local para libertar as entranhas do resto do embrião. Reserve a parte da cauda para mais tarde.

Retire o tecido conjuntivo do ceco e, em seguida, os intestinos, trabalhando com cuidado para não enrolá-los na extremidade rostral do intestino delgado. Corte o fígado e o estômago, bem como as cristas meso, nephros e genitais, se presentes. Finalmente, isole o intestino delgado cortando o ceco e o cólon, bem como o tecido conjuntivo restante.

Como antes, tome cuidado para não cortar o intestino. Deixe o intestino delgado em PBS em temperatura ambiente pelo menor tempo possível antes de incorporar. Depois de cortar o embrião no pescoço, registre o número de somitos da cauda para determinar com precisão o estágio de desenvolvimento embrionário.

Antes de prosseguir com as dissecções de embriões, derreta 1,5 gramas de agros em 100 mililitros de PBS e mantenha a 50 graus Celsius. Prepare o molde de incorporação cortando um tubo de microcentrífuga de dois mililitros longitudinalmente para extirpar cerca de um quarto da parede do tubo. Despeje os agros derretidos no molde e deixe esfriar até que esteja apenas ligeiramente quente ao toque.

Quando estiver pronto, segure o intestino com uma pinça pela extremidade rostral dobrada e puxe-o muito lentamente através dos agros, ao longo do comprimento do molde. Isso ajuda a manter o intestino reto enquanto os conjuntos agrícolas liberam o tecido assim que ele começa a resistir a ser movido e acompanham a orientação do mimo rostral do intestino. Em seguida, coloque o molde na geladeira por dois a três minutos para endurecer completamente.

Depois de endurecido, retire os agros do molde e apare o excesso de agros nas duas pontas, fazendo cortes perpendiculares ao intestino. Cole a extremidade rostral do bloco agros no estágio de metal de um micrótomo e apare o excesso de aros em todos os lados. Em seguida, monte o metal stage na câmara vibratória do micrótomo.

Se necessário, ajuste o ângulo do estágio para que o intestino fique o mais vertical possível. Cubra a amostra com PBS gelado antes de trazer a lâmina de microtom para alguns milímetros abaixo da superfície do tampão. Quando estiver pronto, faça cortes transversais de 200 mícrons do mimo na maioria do intestino delgado.

Garantir que cada fatia agrícola contenha uma seção intestinal completa. Deposite suavemente as fatias recém-cortadas em um gel de colágeno previamente preparado. Colocando uma fatia no meio de cada poço para permitir a migração das células da crista neuro para fora das berinjelas, incube as fatias por três dias.

Após este tempo, retire as fatias do gel de colágeno suavemente com uma pinça, tomando cuidado para não danificar o gel abaixo. Para garantir que o padrão de migração celular não seja perturbado, é importante evitar tocar diretamente no gel de colágeno durante as etapas subsequentes de incubação e lavagem. Primeiro, fixe as células com 500 microlitros de 4% de PFA por poço por uma hora em temperatura ambiente.

Em seguida, substitua o fixador por 500 microlitros de solução DPI por poço e incube por 10 minutos. À temperatura ambiente, remova cuidadosamente a solução de DPI e lave cada poço três vezes com 500 microlitros de PBS por cinco minutos. Por fim, fotografe as células fluorescentes embutidas no gel de colágeno dentro de cada poço.

Neste exemplo, fatores de crescimento foram usados para estimular a migração de células neurocrostas entéricas que expressam GFP. A linha pontilhada representa o tamanho e a localização aproximados do explan. Antes de ser retirado do gel, o número e a disseminação das células que expressam GFP migrando para fora do explane intestinal foram significativamente maiores em condições tratadas versus não tratadas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar o potencial de migração de progenitores neurais entéricos incubando fatias intestinais sobre um gel de colágeno contendo fatores de crescimento.