Detectando somáticas Genéticos Alterações em amostras de tumor por Exon Captura e Seqüenciamento Massively Parallel

O objetivo geral deste procedimento é identificar mutações somáticas em genes associados ao câncer de células do tecido tumoral usando bibliotecas de DNA multiplexadas com código de barras, seguidas de sequenciamento massivamente paralelo. Isso é feito primeiro ligando adaptadores de sequenciamento com código de barras a fragmentos de DNA isolados de tumores preservados. A segunda etapa do procedimento é a hibridização com oligonucleotídeos biotinilados personalizados, complementares a todos os éxons de revestimento de proteínas de 279 oncogenes e genes supressores de tumor.

A terceira etapa é executar o sequenciamento paralelo massivo dos pools com código de barras das bibliotecas capturadas. A etapa final é pesquisar os dados da sequência em busca de alterações associadas ao câncer para os 279 genes-alvo. Este procedimento pode revelar mutações de sequência, pequenas inserções, pequenas deleções, alterações no número de cópias e alterações estruturais selecionadas.

Portanto, as principais vantagens dessa técnica em relação aos métodos existentes são que ela permite investigar éxons inteiros para mutações comuns e raras, bem como identificar alterações genômicas adicionais, como perdas e ganhos no número de cópias, e obter maior sensibilidade em amostras heterogêneas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da genômica do câncer, como quais são as principais mutações em vários tipos de câncer, e essas mutações em amostras clínicas se correlacionam com resultados ou resposta a terapias direcionadas? As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico e tratamento do câncer, porque as mutações podem ser identificadas prospectivamente e usadas para ajudar a orientar os pacientes para terapias e ensaios clínicos apropriados.

A demonstração visual deste método é crítica, pois uma etapa de limpeza da abelha é difícil de aprender devido a uma técnica de cuidado necessária ao lavar e iludir o DNA das contas Prepare a mistura mestre de reparo final. Misture os volumes apropriados para obter 50 microlitros por amostra. Alíquota dos 50 microlitros de cada DNA puro em poços separados de uma placa de seis poços de identificação.

Em seguida, adicione 50 microlitros da mistura mestre de reparo final preparada a cada reação e incube a placa em um termociclador por 30 minutos a 20 graus Celsius para limpar a reação. Primeiro, adicione 200 microlitros de grânulos AMP pure XP a cada amostra e pipete suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes usando um pipetador multicanal. Em seguida, incube a placa em temperatura ambiente por 15 minutos.

Em seguida, mova as placas para o suporte magnético e deixe-as limpar por 15 minutos em temperatura ambiente. Depois de limpo, remova e descarte cuidadosamente a maior parte do sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar as contas. Algum líquido pode permanecer nos poços.

Em seguida, adicione suavemente 200 microlitros de etanol a 80% recém-preparado a cada amostra e incube a placa em temperatura ambiente por 30 segundos. Pipetar cuidadosamente o etanol e repetir a lavagem mais uma vez. Em seguida, deixe o prato secar em temperatura ambiente até que todo o álcool escape.

Agora ressuspenda as contas secas em 44,5 microlitros de água estéril. Flua suavemente cada amostra através da pipeta 10 vezes com a última ejeção. Enxágue todas as contas presas na lateral do poço.

Agora incube as esferas suspensas de água em temperatura ambiente por dois minutos e, em seguida, mova-as para o suporte magnético por cinco minutos até que os poços estejam limpos. Por fim, transfira suavemente 42 microlitros do sobrenadante transparente em cada poço, que contém a amostra para um novo poço. As amostras agora podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius por até uma semana.

Comece preparando a mistura mestre de rejeitos D em um tubo de microcentrífuga estéril. Adicione oito microlitros da mistura mestre de rejeitos DA preparada a cada poço de DNA reparado final. Em seguida, incube a placa em um termociclador por 30 minutos a 37 graus Celsius para limpar a reação.

Use o mesmo processo descrito na seção anterior com o dobro do volume e termine suspendendo as esferas em 33,75 microlitros de água estéril. Nesse ponto, as amostras podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius por até uma semana. Para continuar prepare uma mistura mestre de ligadura para 15 microlitros por reação.

Adicione 15 microlitros da mistura principal de ligação a cada poço contendo o DNA da cauda D. Em seguida, adicione 1,25 microlitros dos 25 micromolares apropriados. Próximo adaptador de código de barras flexível.

Para cada um, bem, cada amostra deve receber um adaptador de código de barras separado. Assim que os adaptadores estiverem carregados, incube a placa por 15 minutos a 20 graus Celsius. Agora usando 50 microlitros de contas, execute uma limpeza de ligadura pós-adaptador e ressuspenda a amostra em água estéril para 50 microlitros.

Em seguida, faça o processo de limpeza uma segunda vez, terminando com 23 microlitros de água. Nesse ponto, as amostras podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius por até uma semana. O próximo passo é amplificar cada amostra da biblioteca, que é detalhada no protocolo de texto sobre degelo no gelo, os bloqueadores de oligonucleotídeos universais e de índice, a biblioteca fácil CCAP e os componentes de captura de geração ágil, que incluem o buffer de hibridização de dois X da TNA e o componente de hibridização.

A. Agora prepare um pool milimolar de bloqueadores de oligonucleotídeos de índice correspondentes às sequências específicas de adaptadores com código de barras usadas na preparação da biblioteca. Combine um microlitro de cada bloqueador e vórtice-os juntos por 10 segundos Em um novo tubo de 1,5 mililitro, prepare a mistura de captura que consiste em cinco microlitros de conte A a um miligrama por mililitro, dois microlitros de bloqueador universal e dois microlitros do pool de bloqueadores. Agrupe 24 bibliotecas com código de barras em uma única reação.

Adicione um total de um a três microgramas de biblioteca de sequências com código de barras agrupado à mistura de captura. Faça 15 a 20 furos na tampa usando um aspirador de velocidade de agulha de calibre 20 ou menor a mistura em um concentrador de vácuo de DNA a 60 graus Celsius até que esteja completamente seco. Em seguida, reidrate a mistura no tampão de hibridização e no componente de hibridização A.Cubra os orifícios na tampa com fita adesiva e vortex a amostra por 10 segundos.

Em seguida, centrifugue a mistura na velocidade máxima por 10 segundos. Agora, incube brevemente a mistura a 95 graus Celsius para desnaturar o DNA. Em seguida, 10 segundos de centrifugação na velocidade máxima à temperatura ambiente em um tubo de tira de PCR de 0,2 mililitro, misture 2,25 microlitros de sondas de captura de biblioteca fácil ccap para o mesmo volume de água livre de nuclease estéril.

Em seguida, na reação da centrífuga, misture com o tubo e flua suavemente o volume total através de uma ponta de pipeta 10 vezes. Agora incube o tubo de 0,2 mililitro em um termociclador a 47 graus Celsius por 48 a 96 horas. Mantenha a temperatura da tampa do termociclador em 57 graus Celsius para evitar a evaporação e estabilizar a temperatura de reação dias depois.

Use as etapas para lavagem e recuperação do DNA capturado. Em seguida, use um protocolo de geração ágil Roche modificado para amplificar o acabamento do DNA capturado, quantificando o DNA capturado amplificado usando o ensaio de alta sensibilidade qubit. Um conjunto de 24 bibliotecas de sequências com código de barras que continha 12 pares normais de tumores foi capturado usando sondas de 279 genes de câncer e sequenciado como dois por 75.

As leituras de pares de bases em uma única pista de um tumor de células de fluxo HighSeq 2000 e as bibliotecas normais foram agrupadas em uma proporção de dois para um. A imagem IGV mostra especificidade da cobertura de sequência em éxons de EGFR em um câncer de pulmão, barras cinzas representam leituras de sequência únicas. A mutação heterozigótica T dois G à direita estava presente em 24% das leituras, indicando que é uma substituição somática de aminoácidos L 8 58 R.

Nenhuma das leituras de tecido pulmonar normal mostrou essa mutação TTA G, alguns indels em um tumor de câncer colorretal, par normal mostraram uma inserção somática de frameshift em um PC ou uma deleção somática de sete pares de bases. No TP 53, alterações no número de cópias também foram observadas entre pares normais de tumores. Cada ponto de dados representa um único éxon de 279 genes-alvo.

Os ganhos e perdas do número de cópias são inferidos a partir de aumentos e diminuições na sequência do tumor Cobertura Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em seis horas e meia para a preparação da biblioteca de compartilhamento e 48 a 96 horas para hibridização de captura, se executada corretamente. Embora seja extremamente importante ter cuidado com os contaminantes durante a preparação da biblioteca, pois pode confundir a análise de dados Após este procedimento, outros métodos como sequenciamento de Sanger e análise de fragmentos podem ser realizados para responder a perguntas como: como faço para validar uma alteração questionável? Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar bibliotecas de DNA com código de barras e executar a captura do Exxon nessas bibliotecas agrupadas.