Um método rápido e eficiente para avaliar a patogenicidade dos maydis ustilago nas linhas de milho e teosinte
January 3rd, 2014
Descreve-se o uso de um método de injeção de agulha para inocular plantas de milho e teosinto com o pato patogênico biotrófico Ustilago maydis. O método de inoculação da injeção de agulha facilita a entrega controlada do patógeno fúngico entre as folhas da planta onde o patógeno entra na planta através da formação de appresoria. Este método é altamente eficiente, permitindo inoculações reprodutíveis com u. maydis.
O objetivo geral deste procedimento é inocular por meio de injeção de agulha, uma cultura de suspensão de células USTA Lago maus e realizar uma triagem de reação de resistência a doenças de linhas cruzadas de labirinto tete e labirinto teosinto cruzado. Isso é feito selecionando primeiro as linhagens de plantas para inoculação e triagem. Em seguida, são plantadas as sementes para experimentos experimentais e de inoculação por injeção de agulha de controle.
10 dias depois, a suspensão celular feita em U é injetada no caule de cada planta. Finalmente, as reações de resistência das plantas experimentais e controle são comparadas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram uma inoculação bem-sucedida por injeção de agulha através da visualização do fenótipo da planta inoculada com você. Mais.
A principal vantagem dessa técnica é que ela entrega o patógeno diretamente entre as folhas. Isso elimina o problema de penetração do patógeno. Para iniciar linhas de plantas selecionadas para inoculação e triagem, conforme mostrado aqui, duas linhas de labirinto, cinco linhas de teosinto e 40 linhas cruzadas de teosinto de labirinto com resistência não caracterizada a U Mais foram usadas para este estudo para experimentos experimentais e de inoculação de injeção de agulha de controle.
Plante quatro sementes de cada linha de planta em pequenos planos, empurrando as sementes cerca de meia polegada no solo com um dedo e cobrindo-as levemente com terra. Em seguida, coloque as plantas em uma câmara de crescimento e regue as sementes até ficarem encharcadas, garantindo que permaneçam sob o solo após a rega. Cultive as plantas com ambientes diurnos e noturnos de 28 e 20 graus Celsius e ciclos de luz e escuridão de 14 e 10 horas, respectivamente.
E aproximadamente 500 micromolares por metro quadrado por segundo de radiação fotossinteticamente ativa no topo do dossel. Mantenha a umidade relativa durante o dia e a noite em aproximadamente 70% e 90%, respectivamente, e mantenha todas as plantas na mesma câmara de crescimento para manter um ambiente de crescimento congruente em todo o experimento. Oito dias após o plantio das sementes, use um laço estéril para listrar o huis de um estoque de glicerol congelado em ágar dextrose de batata ou placas de PDA, incubar a 30 graus Celsius por dois dias e monitorá-lo regularmente para garantir que esteja crescendo bem sob uma capa de fluxo laminar.
Use um palito estéril para selecionar uma única colônia para cada cepa e coloque-os em tubos de três mililitros de caldo PD. Incubar as culturas a 30 graus Celsius e 200 RPM por dois dias, verificando periodicamente o crescimento. Em seguida, meça o OD 600 das culturas para garantir que elas tenham sido cultivadas até um OD de 1,0.
Com água, levar as culturas a uma concentração final de 1 milhão de células por mililitro num volume final de 30 mililitros. Esta concentração de suspensão de células patogênicas resulta consistentemente em boa infecção das plantas. Então, antes da inoculação, misture volumes iguais dos dois que você fez como cepas.
Antes de encher uma seringa de três mililitros com a suspensão celular, encha a seringa de controle com água para injetar com o mínimo de danos à planta. O tecido anexa agulha hipodérmica de ponto zero de 457 milímetros por 1,3 centímetro à extremidade de cada seringa. Remova as plantas da câmara de crescimento e injete em um ângulo de 90 graus logo acima da linha do solo.
Insira cuidadosamente a agulha do U maus no caule de uma planta experimental até que esteja no meio do caule. Injete aproximadamente 100 microlitros da suspensão celular. Ele empurrará o caule e ficará visível à medida que se move para o turbilhão da planta.
Continue injetando plantas experimentais adicionais até que as seringas se esvaziem. Em seguida, encha-o com água para limpar a agulha de qualquer tecido vegetal e reabasteça a seringa até que todas as plantas sejam injetadas. Use a seringa de água para injetar as plantas de controle de maneira semelhante.
Quando as injeções estiverem completas. Coloque as plantas de volta na câmara de crescimento diariamente. Regue apenas o solo e verifique o desenvolvimento de patógenos e as reações de resistência das plantas.
Usando uma classificação de reação de resistência de um a cinco, dimensione, pontue e registre as reações de resistência para cada planta 7, 10, 14 e 21 dias após a inoculação ou DPI. Os valores numéricos na escala de classificação aumentam com o aumento da gravidade da doença. Por exemplo, A1C uma reação de resistência A ou duas indica resistência.
Uma reação de três, quatro ou cinco resistências indica suscetibilidade. Compare as reações de resistência das plantas experimentais e de controle e selecione plantas experimentais com classificação de reação de resistência A1C um, a ou dois. Essas plantas são consideradas resistentes à matis.
Neste experimento, a maioria das plantas inoculadas com húmus foi suscetível à infecção. As plantas apresentaram desenvolvimento severo da doença demonstrado pela formação de caule e galha basal com esporos de telio preto. Várias plantas morreram após a inoculação devido à severidade da doença.
Em contraste, as plantas controle estavam muito limpas e não apresentaram desenvolvimento de patógenos em nenhuma parte da planta, indicando que o desenvolvimento de patógenos nas plantas experimentais foi devido à inoculação por injeção de agulha com U Mais. Foram identificadas três linhas de agressão cruzada de teosinto resistentes a U Mais, e uma inoculação bem-sucedida foi verificada por esclerose menor, ciano em produção, ou menor formação de galhas foliares. Essa técnica pode ser feita de maneira altamente eficiente com reprodutibilidade. Isso ajuda na inoculação e fenotipagem de um grande número de plantas.
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Visão geral
Este artigo descreve um método de injeção com agulha para inoculação de plantas de milho e teosinte com o patógeno biotrófico Ustilago maydis. Esta técnica permite a entrega controlada do patógeno, facilitando sua entrada na planta através da formação de apressórios.
Principais componentes do estudo
Área da ciência
- Patologia vegetal
- Interações planta-microbio
- Técnicas de inoculação fúngica
Fundo
- Ustilago maydis é um patógeno biotrófico que afeta o milho.
- Métodos eficazes de inoculação são cruciais para estudar a resistência das plantas a doenças.
- A injeção com agulha fornece um método preciso para a entrega do patógeno.
- Compreender as respostas das plantas aos patógenos pode informar estratégias de melhoramento genético.
Objetivo do estudo
- Desenvolver um método de inoculação confiável para Ustilago maydis.
- Triar linhagens de milho e teosinte quanto à resistência a doenças.
- Comparar as reações de resistência entre plantas experimentais e controle.
Métodos utilizados
- Seleção de linhagens de plantas para inoculação e triagem.
- Plantio de sementes para grupos experimentais e controle.
- Injeção de suspensão celular de Ustilago maydis no caule de cada planta.
- Comparação das reações de resistência de plantas inoculadas e de controle.
Principais resultados
- O método de injeção com agulha permite inoculações reprodutíveis.
- A fenotipagem visual revela resultados de inoculação bem-sucedidos.
- As reações de resistência podem ser avaliadas efetivamente entre diferentes linhagens de plantas.
- Este método melhora a compreensão das interações planta-patógeno.
Conclusões
- O método de injeção com agulha é eficiente para estudar Ustilago maydis.
- Fornece um ambiente controlado para avaliação da resistência das plantas.
- Os resultados contribuem para a compreensão mais ampla da resistência a doenças no milho.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
Accurate pathogenicity assessment is critical for identifying disease-resistant crop lines in agricultural biotechnology. This needle injection method enables reproducible delivery of Ustilago maydis, supporting target validation in plant-pathogen interaction studies. The approach facilitates phenotypic screening and mechanistic de-risking for breeding programs focused on biotrophic pathogen resistance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host-pathogen interactions through controlled pathogen delivery.
- Operational Value: Provides standardized inoculation for consistent resistance reaction scoring.
- Predictive Value: Supports identification of resistant lines for downstream breeding and trait validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative resistance reaction ratings (1-5 scale) for phenotypic screening.
- Operational Value: Ensures reproducible pathogen delivery between plant leaves, reducing variability.
- Scalability: Compatible with high-throughput inoculation of large plant populations (e.g., 700 plants).
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links resistance phenotypes to genetic introgression lines for breeding applications.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables selection of resistant teosinte and maize-teosinte lines for trait stacking.
- Mechanistic De-risking: Clarifies susceptibility vs. resistance phenotypes via visual symptom scoring.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of resistance mechanisms in plant lines prior to lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating pathogen delivery as an independent variable.
- Screening: Delivers standardized inoculum for assay-ready biological systems.
- Analytics: Provides ordinal resistance scores (DPI 7,10,14,21) for quantitative trait correlation.
- Translational Research: Connects resistance reactions to genetic backgrounds in introgression lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating multiple pathogen strains across germplasm panels.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in pathogenicity assays through direct stem injection.
- Operational Value: Eliminates pathogen penetration barriers, improving infection consistency.
- Strategic Value: Increases confidence in resistance calls by comparing experimental vs. control phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of resistant lines for breeding pipeline advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aseptic fungal culture preparation and plant handling.
- Dependent on sterile syringe and needle instrumentation for precise inoculation.
- Necessitates growth chamber standardization for reproducible environmental conditions.
- Involves adaptation considerations for different plant developmental stages and genotypes.
- Limited to stem injection applicability; not suitable for foliar or root-specific pathogenicity assays.
