Um método rápido e eficiente para avaliar a patogenicidade dos maydis ustilago nas linhas de milho e teosinte
3 de janeiro de 2014
Descreve-se o uso de um método de injeção de agulha para inocular plantas de milho e teosinto com o pato patogênico biotrófico Ustilago maydis. O método de inoculação da injeção de agulha facilita a entrega controlada do patógeno fúngico entre as folhas da planta onde o patógeno entra na planta através da formação de appresoria. Este método é altamente eficiente, permitindo inoculações reprodutíveis com u. maydis.
O objetivo geral deste procedimento é inocular por meio de injeção de agulha, uma cultura de suspensão de células USTA Lago maus e realizar uma triagem de reação de resistência a doenças de linhas cruzadas de labirinto tete e labirinto teosinto cruzado. Isso é feito selecionando primeiro as linhagens de plantas para inoculação e triagem. Em seguida, são plantadas as sementes para experimentos experimentais e de inoculação por injeção de agulha de controle.
10 dias depois, a suspensão celular feita em U é injetada no caule de cada planta. Finalmente, as reações de resistência das plantas experimentais e controle são comparadas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram uma inoculação bem-sucedida por injeção de agulha através da visualização do fenótipo da planta inoculada com você. Mais.
A principal vantagem dessa técnica é que ela entrega o patógeno diretamente entre as folhas. Isso elimina o problema de penetração do patógeno. Para iniciar linhas de plantas selecionadas para inoculação e triagem, conforme mostrado aqui, duas linhas de labirinto, cinco linhas de teosinto e 40 linhas cruzadas de teosinto de labirinto com resistência não caracterizada a U Mais foram usadas para este estudo para experimentos experimentais e de inoculação de injeção de agulha de controle.
Plante quatro sementes de cada linha de planta em pequenos planos, empurrando as sementes cerca de meia polegada no solo com um dedo e cobrindo-as levemente com terra. Em seguida, coloque as plantas em uma câmara de crescimento e regue as sementes até ficarem encharcadas, garantindo que permaneçam sob o solo após a rega. Cultive as plantas com ambientes diurnos e noturnos de 28 e 20 graus Celsius e ciclos de luz e escuridão de 14 e 10 horas, respectivamente.
E aproximadamente 500 micromolares por metro quadrado por segundo de radiação fotossinteticamente ativa no topo do dossel. Mantenha a umidade relativa durante o dia e a noite em aproximadamente 70% e 90%, respectivamente, e mantenha todas as plantas na mesma câmara de crescimento para manter um ambiente de crescimento congruente em todo o experimento. Oito dias após o plantio das sementes, use um laço estéril para listrar o huis de um estoque de glicerol congelado em ágar dextrose de batata ou placas de PDA, incubar a 30 graus Celsius por dois dias e monitorá-lo regularmente para garantir que esteja crescendo bem sob uma capa de fluxo laminar.
Use um palito estéril para selecionar uma única colônia para cada cepa e coloque-os em tubos de três mililitros de caldo PD. Incubar as culturas a 30 graus Celsius e 200 RPM por dois dias, verificando periodicamente o crescimento. Em seguida, meça o OD 600 das culturas para garantir que elas tenham sido cultivadas até um OD de 1,0.
Com água, levar as culturas a uma concentração final de 1 milhão de células por mililitro num volume final de 30 mililitros. Esta concentração de suspensão de células patogênicas resulta consistentemente em boa infecção das plantas. Então, antes da inoculação, misture volumes iguais dos dois que você fez como cepas.
Antes de encher uma seringa de três mililitros com a suspensão celular, encha a seringa de controle com água para injetar com o mínimo de danos à planta. O tecido anexa agulha hipodérmica de ponto zero de 457 milímetros por 1,3 centímetro à extremidade de cada seringa. Remova as plantas da câmara de crescimento e injete em um ângulo de 90 graus logo acima da linha do solo.
Insira cuidadosamente a agulha do U maus no caule de uma planta experimental até que esteja no meio do caule. Injete aproximadamente 100 microlitros da suspensão celular. Ele empurrará o caule e ficará visível à medida que se move para o turbilhão da planta.
Continue injetando plantas experimentais adicionais até que as seringas se esvaziem. Em seguida, encha-o com água para limpar a agulha de qualquer tecido vegetal e reabasteça a seringa até que todas as plantas sejam injetadas. Use a seringa de água para injetar as plantas de controle de maneira semelhante.
Quando as injeções estiverem completas. Coloque as plantas de volta na câmara de crescimento diariamente. Regue apenas o solo e verifique o desenvolvimento de patógenos e as reações de resistência das plantas.
Usando uma classificação de reação de resistência de um a cinco, dimensione, pontue e registre as reações de resistência para cada planta 7, 10, 14 e 21 dias após a inoculação ou DPI. Os valores numéricos na escala de classificação aumentam com o aumento da gravidade da doença. Por exemplo, A1C uma reação de resistência A ou duas indica resistência.
Uma reação de três, quatro ou cinco resistências indica suscetibilidade. Compare as reações de resistência das plantas experimentais e de controle e selecione plantas experimentais com classificação de reação de resistência A1C um, a ou dois. Essas plantas são consideradas resistentes à matis.
Neste experimento, a maioria das plantas inoculadas com húmus foi suscetível à infecção. As plantas apresentaram desenvolvimento severo da doença demonstrado pela formação de caule e galha basal com esporos de telio preto. Várias plantas morreram após a inoculação devido à severidade da doença.
Em contraste, as plantas controle estavam muito limpas e não apresentaram desenvolvimento de patógenos em nenhuma parte da planta, indicando que o desenvolvimento de patógenos nas plantas experimentais foi devido à inoculação por injeção de agulha com U Mais. Foram identificadas três linhas de agressão cruzada de teosinto resistentes a U Mais, e uma inoculação bem-sucedida foi verificada por esclerose menor, ciano em produção, ou menor formação de galhas foliares. Essa técnica pode ser feita de maneira altamente eficiente com reprodutibilidade. Isso ajuda na inoculação e fenotipagem de um grande número de plantas.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método de injeção com agulha para inoculação de plantas de milho e teosinto com o patógeno biotrófico Ustilago maydis. Esta técnica permite a administração controlada do patógeno, facilitando sua entrada na planta por meio da formação de apressórios.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Fitopatologia
- Interações Planta-Microrganismo
- Técnicas de Inoculação Fúngica
Antecedentes
- Ustilago maydis é um patógeno biotrófico que afeta o milho.
- Métodos eficazes de inoculação são cruciais para o estudo da resistência de plantas a doenças.
- A injeção com agulha fornece um método preciso para a entrega do patógeno.
- Compreender as respostas das plantas a patógenos pode orientar estratégias de melhoramento genético.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável de inoculação para Ustilago maydis.
- Selecionar linhagens de milho e teosinto quanto à resistência à doença.
- Comparar as reações de resistência entre plantas experimentais e controles.
Métodos Utilizados
- Seleção de linhagens vegetais para inoculação e triagem.
- Plantio de sementes para os grupos experimentais e controle.
- Injeção de suspensão celular de Ustilago maydis no caule de cada planta.
- Comparação das reações de resistência entre plantas inoculadas e plantas controle.
Resultados Principais
- O método de injeção com agulha permite inoculações reprodutíveis.
- A fenotipagem visual revela resultados bem-sucedidos de inoculação.
- As reações de resistência podem ser efetivamente avaliadas entre diferentes linhagens vegetais.
- Este método aprimora a compreensão das interações planta-patógeno.
Conclusões
- O método de injeção com agulha é eficiente para o estudo de Ustilago maydis.
- Ele fornece um ambiente controlado para avaliar a resistência da planta.
- Os resultados contribuem para a compreensão mais ampla da resistência a doenças no milho.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação precisa da patogenicidade é essencial para identificar linhagens de culturas resistentes a doenças na biotecnologia agrícola. Este método de injeção com agulha permite a administração reprodutível de Ustilago maydis, apoiando a validação de alvos em estudos de interação planta-patógeno. A abordagem facilita a triagem fenotípica e a redução de riscos mecanicistas em programas de melhoramento voltados para a resistência a patógenos biotróficos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de interações entre hospedeiro e patógeno por meio da entrega controlada de patógenos.
- Valor Operacional: Fornece inoculação padronizada para pontuação consistente das reações de resistência.
- Valor Preditivo: Apoia a identificação de linhagens resistentes para melhoramento genético subsequente e validação de características.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera classificações quantitativas de reação à resistência (escala de 1 a 5) para triagem fenotípica.
- Valor Operacional: Garante entrega reprodutível do patógeno entre folhas de plantas, reduzindo a variabilidade.
- Escalabilidade: Compatível com inoculação de alto rendimento de grandes populações de plantas (por exemplo, 700 plantas).
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Relaciona fenótipos de resistência a linhagens de introgressão genética para aplicações em melhoramento.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a seleção de linhagens resistentes de teosinte e milho-teosinte para empilhamento de características.
- Redução de Riscos Mecanística: Esclarece fenótipos de suscetibilidade versus resistência por meio de pontuação visual dos sintomas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir o teste de hipóteses sobre mecanismos de resistência em linhagens vegetais antes das etapas de identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias ao isolar a entrega do patógeno como uma variável independente.
- Triagem: Fornece inóculo padronizado para sistemas biológicos prontos para ensaio.
- Análises: Fornece escores ordinais de resistência (DPI 7,10,14,21) para correlação de características quantitativas.
- Pesquisa Translacional: Conecta reações de resistência a contextos genéticos em linhagens de introgressão.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliar múltiplas cepas de patógenos em painéis de germoplasma.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista em ensaios de patogenicidade por meio da injeção direta no caule.
- Valor Operacional: Elimina barreiras à penetração do patógeno, melhorando a consistência da infecção.
- Valor Estratégico: Aumenta a confiabilidade nas avaliações de resistência por meio da comparação entre fenótipos experimentais e controle.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de linhagens resistentes para avanço na linha de melhoramento.
Considerações de Implementação
- Requer experiência na preparação de culturas fúngicas assépticas e no manejo de plantas.
- Depende de instrumentação estéril com seringa e agulha para inoculação precisa.
- Necessita padronização de câmara de crescimento para condições ambientais reprodutíveis.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes estádios de desenvolvimento vegetal e genótipos.
- Limitado à aplicabilidade de injeção no caule; não é adequado para ensaios de patogenicidade foliares ou específicos de raiz.
