Name: Interrogatório funcional do Adulto Hypothalamic Neurogenesis com Focal Radiológica Inibição (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-14T22:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Aprenda a técnica de irradiação focal guiada por tomografia computadorizada para inibir a neurogênese em modelos animais pequenos. Este método permite investigar o papel funcional de populações específicas de progenitores neurais no hipotálamo adulto.

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Agradecemos C. Montojo, J. Reyes, e M. Armour para aconselhamento e assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por Institutos Nacionais de Saúde dos EUA concessão F31 NS063550 (para DAL), um prêmio Basil O&#39;Connor Iniciado Scholar e subvenções do Fundo Klingenstein e NARSAD (a SB). SB é um WM Keck Distinguished Scholar Jovem em Pesquisa Médica.

Uso animal Obter a aprovação do Comitê Animal Care e Use institucional para tratamento padrão e de uso de protocolos. O protocolo corrente foi desenvolvido para estudos de irradiação focais sobre 5.5-10 semanas de idade adultos ratinhos C57BL6 / J, tal como descrito anteriormente (Figura 2) 2. No entanto, outras idades e de pequenas espécies animais (ratos, hamsters, esquilos, etc) também podem ser usados, desde que os protocolos de anestesia efetivos e um atlas de referência radiográficas que permitam identificar a região de interesse (ROI) estão disponíveis. 1. Calibração de Plataforma Radiológica CT-guiada Realizar calibrações baseadas em filme para a dose de radiação na plataforma radiológico com antecedência para cada tamanho de colimador e tipo de filtro tubo de raios-X usados. A fim de atingir um raio de arco de irradiação no local de destino desejado, use o software de planejamento de dose de radiação 49 available na maioria das plataformas comerciais de radiação para calcular tempo de entrega exigido com base na dose de radiação, a profundidade da região de interesse (ROI) com base em tomografias computadorizadas do mouse, ea velocidade de rotação da plataforma robótica; detalhes sobre este são deixados de fora deste protocolo como eles diferem entre as plataformas de radiação. Para efeitos de visualização do hipotálamo ventrobasal 2 (Figura 3), com imagens de RM, operar o tubo de raios-X com um ponto focal de 0,4 mm e a energia do feixe de 100 kVp, com 1 milímetro Al filtração. Para irradiação focal da ZAP, opere o tubo de raios-X a 225 kVp, 13 mA, e um ponto focal de 1 mm com filtração de 0,15 milímetros Cu, para entregar 10 Gy de radiação a uma profundidade de tecido de 0,6 centímetros ao longo de um tratamento tempo de 4,6 minutos. Segmentação entre diferentes ROIs exigirá cálculo diferentes parâmetros. <ol><li> Se estudar os efeitos da dieta rica em gordura sobre a neurogênese na eminência mediana, como descrito anteriormente 2, obter quatro semanas de idade, do sexo feminino C57BCamundongos L6 / J de laboratórios Jackson mouse e casa quatro ratos por gaiola. Interruptor de alimentos a partir de ração normal para uma dieta de alto teor de gordura às cinco semanas de idade. Permitir camundongos se adapte à nova moradia e alimentação. Realizar tratamento CFIR em 5,5 semanas de idade. Transporte submete à sala de operação que contém a plataforma radiológica. Minimizar os níveis de estresse durante a transferência. Prepare isoflurano câmara de anestesia gás. Em seguida, adicione um único rato na câmara. Em paralelo, preparar almofada de aquecimento (baixa definição) para o pós-tratamento. </li><li> Uma vez que o mouse está sob e não mais respondendo a compressão pé-almofada, trazer o assunto para a plataforma radiológica e coloque na cama imobilização da fase robótico. Coloque a boca do sujeito no copo anestesia nariz-cone, e dentes no guarda mordida (Figura 1D). Colocar o plano do mouse em cima da cama de imobilização e verificar para ver se ele continua a manter apatia. Se assim for, fita para baixo do mouse para a cama com fita de gaze. Enquanto gravando o mouse para a cama, Certifique-se o chefe é nivelado a um plano horizontal. Isto pode ser determinado, puxando para cima das orelhas e ver se eles estão niveladas. Uma vez que o mouse está na posição correta, feche o escudo protetor de chumbo. </li><li> Adquirir a verificação do computador-tomografia usando software on-board de plataforma radiológico do experimentador (isto irá variar entre plataformas), que irá proporcionar uma varredura estrutural anatômica tridimensional do assunto mouse. Verifique se a cabeça do rato é nivelado ao plano horizontal. Se não, repita os passos de 1,2-1,3 até a cabeça do sujeito é nivelado. </li><li> Identificar ROI imagem CT by. Calcular a distância de ROI para a superfície do crânio com um ângulo de 45 ° em relação ao plano horizontal, como mostrado na Figura 3E. </li><li> Usando o software on-board, tirar um raio-X do assunto rato por cima, como mostrado na Figura 4A. Em seguida, retire do mouse a partir da plataforma radiológica, colocar almofada de aquecimento, e monitorar até ativa. </li><li> A partir das imagens coronais CT, calcular a profundidade média ROI anatómica de pelo menos três ratos a fim de determinar a dosagem de entrega. Como um exemplo de um estudo anterior em que 2 10 Gy de radiação foi administrada para o hipotálamo ventrobasal, a profundidade da ROI do crânio (a partir de um ângulo de 45 °) é de 0,66 cm (Ver Figura 3E). Sabendo disso, os pesquisadores usaram o software de planejamento de dose (DPS) instalado em sua plataforma radiológica para calcular a velocidade de rotação adequado e duração do tratamento para atingir dose desejada para o ROI. </li><li> Após a determinação da duração do tratamento e da velocidade de rotação da fase robótico com o software de dose-planeamento, medir distribuições de dose dos parâmetros calculados com películas sensíveis à radiação GAFchromic incorporados num modelo simulado-rato de plástico equivalente de água. Para fazer isso, incorporar três filmes sensíveis à radiação GAFchromic entre quatro empilhadas verticalmente blocos de plástico equivalente de água 29 comomostrado na Figura 4B. </li><li> Coloque modelo de simulação do mouse contendo filmes GAFchromic no palco robótico, e executar o feixe de irradiação focal com os parâmetros recém-calculados. Por exemplo, para visar a ventrobasal hipotálamo, introduzir os parâmetros de filtro de 0,15 milímetros de Cu, 225 kVp, 13 mA, 1 mm de diâmetro do feixe de radiação ambiente, 45 ° de ângulo de pórtico, 1,3 ° / s de rotação, e de 4,6 min para se obter um ROI a dose radiológica de 10 Gy. </li><li> Após a irradiação, verifique filmes para padrão e intensidade da dose de radiação. Para um ângulo de rotação de 360 ​​°, com os parâmetros listados para atingir o hipotálamo ventrobasal, um anel escuro na película acima isocentro, uma pequena mancha nítida no filme isocentro, e um anel mais leve na película abaixo do isocentro correspondente para o cone administração do feixe de irradiação serão observados (Figura 4B). </li><li> Sobreponha isocentro filme GAFchromic sobre os raios-X de objetos do rato a partir do qual os parâmetros foram callada. O ponto focal irradiado no isocentro deve sobrepor-se com a região de ROI desejada, como mostrado na Figura 4C. </li></ol> Método alternativo: Se a dificuldade em atingir o ROI cérebro persistir, utilize contraste iodado injetado por via intratecal para melhorar a visualização dos ventrículos em imagens de CT. Por uma questão de brevidade, este procedimento é deixado de fora deste protocolo, mas é descrito anteriormente 35, 50. Contraste de iodo irá fornecer marcos ventriculares adicionais (Figura 5A). 2. Determinar a precisão de irradiação Além disso confirmar a precisão do feixe CFIR pela visualização direta do feixe de radiação no tecido 2, 35, 51. Para fazer isso, execute imunohistoquímica para detectar γH2AX 51, uma proteína histona e um marcador precoce de rupturas de filamentos duplos de DNA. Assuntos do mouse deve ser transcardially perfundidos e fixados dentro de uma hora de irradiação. Após irradiation, reparo do DNA rapidamente se segue, e os níveis de ΥH2Ax diminuir significativamente 35. <ol><li> Repita os passos de 1,1-1,3. </li><li> Depois que o alvo é identificado no CT, o tema do mouse é movido sob controle robótico para alinhar esta meta com o feixe de radiação entrega. Entrada parâmetros calculados (velocidade de rotação e tempo de tratamento para atingir dose desejada) a partir do passo 1.6 em software dose de planejamento e começar o tratamento. O tratamento é entregue com o pórtico apontou para 45 ° em relação à vertical, enquanto o mouse gira sobre um eixo orientado verticalmente. </li><li> Após a irradiação, realizar perfusão transcardial sobre assuntos do mouse. Realize perfusão dentro de uma hora 52. Após perfusão, correção imersão cérebros em PFA 4% / PBS e abane durante a noite a 4 ° C. </li><li> Na manhã seguinte, lavar 5 min em PBS, 3x para remover paraformaldeído fixador. Em seguida, imerso em 30% de sacarose em PBS 1x num agitador a 4 ° C. </li><li> Agite suavemente a 4 ° C (usdualmente 12-16 h), até que o cérebro se afunda até o fundo do tubo. Isto serve como um passo crioproteção. Uma vez que os cérebros afundar, remova cérebro com uma colher perfurada para evitar excesso de 30% sucrose/1x transferência PBS. Rapidamente incorporar no congelamento médio em gelo seco. Agitar meio de congelamento com ponteira e alinhar cérebro em moldes de plástico. </li><li> Uma vez completamente congelado, transferir blocos de cérebro de -20 ° C congelador para armazenamento. </li><li> No dia em que será realizada imuno-histoquímica, a secção coronal em 40 mM de espessura, e flutuam em uma placa de 24 poços contendo PBS com um pincel fino. Seções devem ser mantidos em ordem serial correta para a imunocoloração para determinar a cobertura de irradiação da região de destino. </li><li> Pré-aquecer 0,01 M de solução de citrato de sódio a 80 ° C em banho de água em preparação para o passo de recuperação de antigénio. Simultaneamente, enquanto o citrato de sódio é o aquecimento, executar lavagens de 5 min 3x em 0,01 M de PBS. </li><li> Uma vez que uma solução de citrato de sódio é de 80 ° C, submergir secções cerebrais in a solução tampão de citrato de sódio. Deixar em banho de água a 80 ° C durante 1 hora. </li><li> Retirar secção e permita que a solução de citrato de sódio para atingir a temperatura ambiente, em seguida, executar três lavagens de 5 minutos em 0,01 M de PBS. </li><li> Bloquear secções do cérebro durante 1 h em PBS-Triton, contendo 5% de soro de cabra normal. </li><li> Incubar secções do cérebro durante a noite em PBS contendo Triton-5% de soro de cabra normal com concentração de 1:700 de ratinho anti-fosfo-H2AX anticorpo primário a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte, 15 min executar lavagens 3x em PBS 0,01 M, Triton. </li><li> Incubar secções cerebrais PBS-Triton, contendo 5% de soro de cabra normal com anticorpo secundário de cabra anti-ratinho conjugada com 488 nm fluorphore na concentração de 1:500 durante 2 horas. </li><li> Execute 15 min lavagens 3x em 0,01 M PBS-Triton. </li><li> Realizar 4 &#39;(DAPI) mancha-diamidino-2-fenilindole ,6 (1:5000 em PBS) durante 10 min para visualizar núcleo. Em seguida, lavam secções do cérebro durante 5 min com PBS. </li><li> Montar em eletrostática chmicroscópio arged desliza por seção flutuante em PBS. Limpe o excesso de PBS e deixar as lâminas secar. Lamela as lâminas, utilizando o meio de montagem e de permitir que as lâminas seca no escuro e à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Tire fotos de cortes coronais de série com microscópio de fluorescência. ΥH2Ax immunostaining (verde) indica local de irradiação. DAPI (azul) é uma mancha nuclear (Figura 5B). </li></ol> 3. Preparação de Rato Assuntos para irradiação focal Examine os resultados de positividade ΥH2Ax. Uma vez satisfeito com a calibração e direcionamento do feixe de radiação, prosseguir com o experimento. Neste ponto, o tempo total necessário para tratar de um ratinho (a partir de instalação de animais para a conclusão de administração do feixe) é de aproximadamente 10-15 minutos para um tratamento de 10 Gy com um raio de 1 mm. <ol><li> Encomende quatro semanas de idade camundongos fêmeas C57BL6 / J de laboratórios Jackson do Mouse. Casa de quatro ratos por gaiola, e mudar comida de ração normala uma dieta de alto teor de gordura às cinco semanas de idade. Camundongos soco orelha para dar-lhes as marcas de identificação únicos. Monitorar a saúde dos ratos diariamente. Nota: marcadores metálicos não pode ser utilizado à medida que vai resultar em estrias artefactos no CT. </li><li> Pesar camundongos um dia antes de o tratamento de radiação ou farsa. Camundongos divididos em dois grupos de radiação ou tratamento placebo e garantir que não há diferença significativa de peso entre coortes. No dia do tratamento, quando os ratos estão seis semanas de idade, pesar novamente todos os ratos e registrar sua massa. Gentilmente transportar ambos os grupos para a plataforma radiológica. Tome cuidado para minimizar os níveis de estresse. </li><li> Prepare isoflurano câmara de anestesia gás. Anestesiar dois ratos, um no grupo irradiação pré-determinado, e outro no grupo controle farsa. Prepare almofada de aquecimento definido na baixa definição para o tratamento pós-operatório. </li><li> Siga os passos de 1,2-1,4 para o mouse para receber a irradiação. Para o mouse farsa, mantenha o mouse na câmara de anestesia enquanto o tratamento está acontecendo. Faça sure que câmara anestesia é perto da plataforma CFIR assim quaisquer efeitos sobre a radiação ambiente são tidos dentro Após o alvo é identificado na CT, mova o mouse assunto sob controle robótico para alinhar esta meta com o feixe de radiação entrega. Entrada de parâmetros (velocidade de rotação e duração do tratamento) calculado em software dose de planejamento. </li><li> Uma vez que o tratamento de irradiação for concluída, voltar tanto farsa e os ratos irradiados a almofada de aquecimento, e monitorar até que eles acordam. </li><li> Retornar tanto farsa e ratos irradiados para biotério. Monitorar todos os dias. Pesa-se a ratinhos cada meia semana. Para confirmar a irradiação da zona proliferativa hipotálamo alvo, administrar injeções intraperitoneais de BrdU (50 mg / kg), três dias após o tratamento e examinar a neurogênese entre grupos por colabeling de imuno-histoquímica para BrdU e um marcador neuronal de um mês após a exposição inicial BrdU (Figura 6) 2. </li></ol>

JW tem um financiamento e de consulta de pesquisa acordos com Xstrahl, Inc.

Irradiação focal CT-guiada (CFIR) é uma abordagem nova e completa do sistema capaz de fornecer campos de radiação a alvos em pequenos animais sob controle robótico usando CT-orientação 32. A capacidade de CFIR para entregar vigas altamente concentrado para pequenos modelos animais proporciona novas oportunidades de pesquisa para colmatar pesquisas de laboratório e tradução clínica. Este artigo descreve a abordagem CFIR para entrega radiação preciso para atingir especificamente uma população progenitor neural ...

Descobertas recentes demonstraram que o cérebro de mamíferos adultos pode ser submetido a um notável grau de plasticidade. Neurônios-nascido adultas são gerados durante a vida adulta em nichos especializados do cérebro dos mamíferos 1. Qual é a função desses neurônios nascido de adultos? E mais ainda, que eles desempenham um papel na fisiologia e comportamento? Estudos sobre o tema têm, tradicionalmente focada na zona subventricular dos ventrículos laterais ea zona subgranular do hipocampo, no entanto, estudos recentes têm caracterizado a neurogênese em outras regiões do cérebro, como o hipotálamo dos mamíferos 2. Neurogenesis foi avaliado no pós-natal e adulto hipotálamo 2-10, e a função destes neurónios hipotalâmicos-nascidos ainda uma área activa de investigação. A caracterização funcional de neurônios nascido de adultos continua a ser um desafio significativo para o campo da neurociência em geral. Inibição seletiva de especificaçãoIFIC populações progenitoras neurais permanece limitada pela falta de marcadores moleculares disponíveis, que são únicas para populações progenitoras neurais individuais 11. Assim, a eliminação seletiva dos neurônios nascido de adultos destes progenitores neurais através de segmentação genética continua difícil. Da mesma forma, a entrega viral para atingir os neurônios nascido de adultos sofre de potenciais variáveis ​​de confusão, tais como a introdução de lesão e inflamação no ambiente 12. Novas ferramentas radiológicos estão surgindo, no entanto, que permitem contornar essas confunde e investigar essas questões por meio da segmentação anatômica exato e preciso em pequenos animais. A radiação ionizante inibe o nascimento e diferenciação de novos neurônios, e permite que um método não invasivo para atingir populações progenitoras neurais 13-15. Recentemente, descrevemos uma região germinal da eminência mediana do hipotálamo dos mamíferos (ME) que denominou a zona proliferativa hipotálamo (ZAP) 2 </sup&gt;. Descobrimos que quando ratos jovens adultos do sexo feminino receberam uma dieta rica em gordura (DFH), os níveis de neurogênese em ratos HFD-alimentados foram substancialmente mais elevadas do que a sua comida normal (NC) controles alimentados nesta região ME 2. Para testar se a neurogênese adulta dentro do ME hipotálamo regula o metabolismo e do peso, buscou-se interromper esse processo. A eminência mediana é uma pequena estrutura unilateral na base do terceiro ventrículo a partir do qual as hormonas reguladoras são libertados. A fim de inibir a proliferação e neurogênese posterior sem alterar as outras funções fisiológicas desta região do cérebro, desenvolvemos uma técnica de irradiação focal não-invasivo para inibir seletivamente o nascimento de neurônios adultos recém-nascidos na eminência mediana do hipotálamo 2. Vários grupos têm utilizado a radiação para suprimir a neurogênese em regiões canônicas 14-28. No entanto, as abordagens radiológicos anteriores geralmente alvo de grandes áreas, ou often involuntariamente também alvejado várias áreas do cérebro onde foi reportado a neurogênese, o que torna difícil para associar de forma inequívoca quaisquer defeitos comportamentais observadas com defeitos em populações específicas progenitoras neurais. A capacidade de irradiação mais direcionado é fornecido pelo plataformas radiológicos que combinam c omputer imagem guiada por tomografia com f ocal ir feixe de radiação (CFIR) entrega para permitir anatômica mira de precisão 29-36. Feixes de radiação tão pequenas quanto 0,5 mm de diâmetro estão disponíveis para atingir populações progenitoras neurais específicos 35. Esta metodologia permite-nos atingir o ME hipotálamo e prender proliferação e bloqueiam a neurogênese em pequenos animais. Após o tratamento radiológico nestas populações progenitoras, testes fisiológicos e comportamentais podem ser realizados para esclarecer a função potencial de células-nascido adultos. Segmentação focal é especialmente importante para a nossa aplicação, desde oglândula pituitária está localizado perto da eminência mediana do hipotálamo; irradiação da hipófise pode afetar a função hormonal e, posteriormente, confundir os resultados. A base biológica para a supressão da neurogênese após irradiação ainda permanece obscuro. Estudos de radiação anteriores têm contado com grandes vigas área, e concluíram que a supressão da neurogênese é mediada através de uma resposta inflamatória 14, 37. Como tal, não está claro se a irradiação altamente focal poderia suprimir a neurogênese, uma vez que não evocar uma resposta inflamatória substancial. No entanto, estudos recentes do nosso grupo do clássico região neurogénica no hipocampo têm demonstrado que a irradiação altamente focal com uma dose de 10 Gy, pode suprimir a neurogénese durante pelo menos 4 semanas após a irradiação 35. Para interrogar a função dos neurônios do hipotálamo nascido de adultos na eminência mediana, usamos uma radiação precisão device capaz de fornecer imagens CT em combinação com feixes de radiação de pequeno diâmetro para inibir a neurogênese ME. Utilizando um tubo de raio-X acoplado a um pórtico que gira ao longo de um intervalo de 360 °, que entregam arco de feixe do feixe de micro irradiação com o uso de uma fase de amostra controlado roboticamente, que permite a rotação de um sujeito animal durante o tratamento de radiação (Figura 1) . Uma maior resolução do detector de raios-X é utilizado para a aquisição de imagens, quando o pórtico está na posição horizontal 33. Para este estudo, imagens de TC foram reconstruídos com um tamanho de voxel isotrópico de 0,20 mm. No bordo de imagem CT permitiu a identificação de um alvo, enquanto o animal está na posição de tratamento. O alvo foi localizado usando o software de planejamento de dose de navegação CT, que foi incluído com a nossa plataforma radiológicos disponíveis comercialmente. Depois de localizar o nosso ROI por imagem CT, o animal foi movido para a posição de tratamento adequado pelo estágio espécime robótico que tem quatro grausRees de liberdade (X, Y, Z, θ). Através de uma combinação de ângulos de pórtico e estágio robô, vigas podem ser entregues a partir de quase qualquer direção em relação ao animal, e tratamentos de arco-like estereotáxica são possíveis 29. Para estes e todos os outros estudos de imagiologia, os ratos foram colocados num dispositivo de imobilização, que permite a libertação de gás anestésico de isoflurano durante a restringir o movimento. A cama de imobilização é CT compatível, e se conecta ao palco espécime robótico 34. Esperamos que CFIR proporcionará avanços conceituais em um número de áreas de investigação. Apesar de usarmos segmentação radiológica da eminência mediana do hipotálamo como prova de princípio desta técnica, CFIR pode ser usado para atingir qualquer região do corpo de qualquer modelo pequeno organismo em princípio. Nos ciências neurológicas, por exemplo, prever que esta técnica pode ser utilizada para avaliar a função de populações progenitoras activamente proliferativas que têm sido sugeridos para exist em outros órgãos circumventricular, tais como a área postrema 38, 39, 40 do órgão subfornical e na hipófise 41. Controvérsias de longa data sobre o papel funcional da neurogênese adulta e identificação de um papel causal no comportamento também pode agora ser melhor abordados. Em aves canoras, esta técnica pode abordar o papel da neurogênese adulta na manutenção do comportamento robusto e sazonal do canto dos pássaros 42, que tem sido dificultado pela capacidade de inibir seletivamente a neurogênese em regiões específicas do cérebro. Compreender este modelo comportamental robusto pode lançar uma nova visão sobre o papel da neurogênese adulta na regulação de outros comportamentos sexualmente dimórficos. Em alternativa, no campo metabólica, CFIR pode ser usada para explorar aspectos do papel de proliferação dos hepatócitos e o seu papel no metabolismo e no balanço de energia. A possibilidade de avanço conceptual em várias disciplinas de investigação é aumentada pela introdução desta técnica. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Neste artigo, vamos demonstrar as capacidades do CFIR para anatômica precisão direcionamento de um feixe de irradiação focal. Embora inicialmente desenvolvido esta plataforma de pesquisa de radiação de pequenos animais (SARRP) para os nossos estudos, outros dispositivos similares já estão comercialmente disponíveis que podem realizar irradiação semelhante guiada por TC focal 43, 44. Por isso, nós generalizamos este protocolo CFIR com passos necessários para todas as plataformas de pesquisa, em vez de os específicos para SARRP. As vantagens das abordagens mais CFIR radiológicos anteriores para inibir a neurogénese são que esta técnica permite a orientação da imagem volumétrica tridimensional para a localização e orientação da dose, a dose conformada minimiza a exposição de regiões cerebrais nontargeted, e geometria do feixe de alta precisão permite a distribuição da dose com conformado limites feixe afiadas. Nós delineamos como usar imagens CT-guiada para atingir a dose a uma região anatômica específica, e ao fazê-lo, como visualizar a radiaçãodose de distribuição diretamente no tecido usando coloração imuno-histoquímica para γ-H2AX, um marcador de DNA quebras de fita dupla 35, 45-48. A utilização desta abordagem para a irradiação seletiva de nichos neurogênicos podem ter implicações significativas na revelando o papel funcional de novos neurônios nascido de adultos sobre a fisiologia e doenças.

<table><tbody><tr><td>plataforma de pesquisa SARRP</td><td>Xstrahl</td><td>RS225A</td><td><a href="http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm" target="_blank">http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm</a></td></tr><tr><td>SARRP bunker de irradiação</td><td>Xstrahl</td><td></td><td>Opcional, mas a exposição à radiação deve ser contida com blindagem alternativa de chumbo</td></tr><tr><td>GAF filme crômico</td><td>IPS</td><td>GAFchromic ETB2</td><td></td></tr><tr><td>Fantasma de rato</td><td>Gammex</td><td>457</td><td>Compre placas de água sólida de 0,5 cm x 30 cm x 30 cm da Gammex e corte no tamanho desejado.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-fosfo-histona H2AX Ser139 de camundongo</td><td>Millipore, Inc.</td><td>05-636</td><td>clone JBW301</td></tr><tr><td>Dieta de roedores com alto teor de gordura</td><td>Dietas de pesquisa</td><td>D12492i</td><td>60% das calorias como gordura, os alimentos devem ser irradiados</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>10019-360-40</td><td></td></tr><tr><td>0,01 M Citrato de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>1,471 g de citrato de sódio dissolvido em 500 ml de água deionizada</td></tr><tr><td>Superfrost Plus slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>contra-coloração nuclear</td></tr><tr><td>Meio de montagem</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Vectashield ou Gelvatol é preferido</td></tr></tbody></table>

interrogatório funcional do adulto hypothalamic neurogenesis com focal radiológica inibição

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

A caracterização funcional de neurônios nascido de adultos continua a ser um desafio significativo. Abordagens para inibir adulto neurogenesis via entrega viral invasiva ou animais transgénicos têm potenciais confunde que tornam a interpretação dos resultados a partir destes estudos difícil. Novas ferramentas radiológicos estão surgindo, no entanto, que permitem que se investigue de forma não invasiva a função de selecionar grupos de neurônios nascido de adultos por meio da segmentação anatômica exato e preciso em pequenos animais. Radiação ionizante Focal inibe o nascimento e diferenciação de novos neurônios e permite a segmentação de regiões específicas progenitoras neurais. A fim de esclarecer o papel funcional potencial que a neurogênese adulta hipotálamo desempenha na regulação de processos fisiológicos, desenvolvemos uma técnica de irradiação focal não-invasivo para inibir seletivamente o nascimento de neurônios nascido de adultos na eminência mediana do hipotálamo. Nós descrevemos um método para C omputer guiada por tomografiaf ocal ir radiação (CFIR) entrega para permitir anatômico preciso e exato visando em pequenos animais. CFIR usa orientação imagem volumétrica tridimensional para a localização e orientação da dose de radiação, minimiza a exposição à radiação de regiões cerebrais nontargeted, e permite a distribuição da dose conformada com fronteiras nítidas feixe. Este protocolo permite fazer perguntas sobre a função dos neurônios nascido de adultos, mas também abre as áreas de perguntas em áreas de radiobiologia, biologia do tumor, e imunologia. Estas ferramentas radiológicos irá facilitar a tradução de descobertas no banco à cabeceira.

Avaliando Targeting CT-guiada e Precisão A calibração mecânica do sistema é crítico para assegurar que os feixes de vários ângulos todos se intersectam num ponto único. A calibração foi realizada com um método baseado na imagem semi-automático, onde a precisão do alinhamento extremidade-a-extremidade foi medido como sendo de 0,2 milímetros 29. Esta precisão é muito crítico que o volume da estrutura da eminência mediana do hipotálamo é pequeno 2. Para testar essa calibração...

A função dos neurônios de mamíferos nascido de adultos continua a ser uma área ativa de pesquisa. A radiação ionizante inibe o nascimento de novos neurônios. Usando computador guiada por tomografia irradiação focal (CFIR), segmentação anatômica tridimensional de populações específicas progenitoras neurais agora pode ser usado para avaliar o papel funcional da neurogênese adulta.

Interrogatório funcional do Adulto Hypothalamic Neurogenesis com Focal Radiológica Inibição

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

O objetivo geral deste procedimento é descrever uma técnica radiológica avançada, que permite realizar irradiação focal em modelos animais pequenos e, subsequentemente, inibir a proliferação com resolução anatômica específica. Isso é realizado primeiramente empregando-se imagem volumétrica tridimensional guiada por tomografia computadorizada para localização da região de interesse. O segundo passo do procedimento consiste em calcular a entrega e a duração do tratamento radiológico na região de interesse.O terceiro passo é realizar a calibração baseada em filme para a dose de radiação. O passo final é determinar a precisão do feixe de radiação por meio da visualização direta do feixe de radiação no tecido. Em última análise, os resultados desses estudos podem demonstrar o papel funcional potencial de populações selecionadas de neuroprogenitores proliferativos por meio da análise pós-tratamento da fisiologia e do comportamento.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes para suprimir a neurogênese, como a irradiação ampla do cérebro, é que ela utiliza feixes de radiação com diâmetro tão pequeno quanto 0,5 milímetros para direcionar populações neurogenéticas específicas. Isso permite associar de forma inequívoca defeitos comportamentais ou fisiológicos às funções específicas de populações neurogenéticas. A demonstração visual deste método é essencial, pois os procedimentos de configuração do feixe de radiação são inicialmente difíceis de aprender, devido ao grande número de etapas envolvidas no uso tanto do hardware quanto do software para localização do prop e dosagem. Prepare uma câmara de anestesia com gás fluoreto de iso, depois adicione um único camundongo à câmara.Paralelamente, prepare uma manta térmica no nível baixo para os cuidados pós-tratamento com o animal. Quando o camundongo não responder mais à compressão da planta do pé, leve-o à plataforma radiológica e coloque-o sobre a cama de imobilização da plataforma robótica. Coloque seu focinho no cone nasal do anestésico e seus dentes no protetor bucal.Coloque o camundongo em posição plana sobre a cama de imobilização. Se ele permanecer inerte, fixe o camundongo com fita de gaze. Certifique-se de que a cabeça esteja nivelada em relação a um plano horizontal puxando as orelhas para cima.Uma vez que o camundongo esteja na posição correta, feche o escudo protetor de chumbo. Agora, realize uma tomografia computadorizada utilizando o software integrado da plataforma radiológica para obter um exame tridimensional da estrutura anatômica do camundongo a partir das imagens. Verifique se a cabeça está nivelada em relação ao plano horizontal.Se não estiver, continue ajustando a cabeça do camundongo até que esteja. Agora, identifique a região de interesse (ROI) nas imagens de TC para visualizar o hipotálamo basal ventral com imagem de tomografia computadorizada. Opere o tubo de raios X conforme listado.Calcule a distância da ROI até a superfície do crânio usando um ângulo de 45 graus em relação ao plano horizontal. Utilizando o software integrado, realize uma radiografia do camundongo a partir da vista superior. Em seguida, remova o camundongo da plataforma radiológica.Coloque-o sobre a placa aquecida e monitore até que esteja ativo. A partir das imagens de tomografia computadorizada coronal, calcule a profundidade anatômica média da ROI de pelo menos três camundongos para determinar a dosagem de administração. Como exemplo de um estudo anterior em que 10 gray de radiação I foram administrados ao hipotálamo ventrobasal, a profundidade da ROI a partir do crânio em um ângulo de 45 graus é de 0,66 centímetros.Uma vez conhecido o valor, utilize um software de planejamento de dose para calcular a rotação, velocidade e duração apropriadas do tratamento para a dose desejada na ROI. Em seguida, meça as distribuições de dose dos parâmetros calculados. Incorpore três filmes sensíveis à radiação GAF chromic em um modelo de camundongo feito de plástico equivalente à água.Posicione-os entre quatro blocos plásticos equivalentes à água dispostos verticalmente. Coloque o modelo de camundongo na plataforma robótica e aplique o feixe de irradiação focal com os parâmetros recém-calculados. Neste exemplo, testa-se uma dose de radiação de 10 Gy no hipotálamo basal ventral. Após a irradiação, verifique o padrão e a intensidade da dose nos filmes para uma rotação em ângulo de 360 graus, direcionada ao hipotálamo basal ventral, o feixe cônico.Uma radiação produz um anel escuro no filme acima do centro ISO, um pequeno ponto nítido no centro ISO do filme e um anel mais claro no filme abaixo. O centro ISO agora sobrepõe o filme GA FCH Cromic do centro ISO sobre os raios X. O ponto focal irradiado no centro ISO deve sobrepor-se à ROI desejada posteriormente.A precisão do feixe de irradiação pode ser avaliada no tecido por meio da visualização de um marcador de quebras na dupla fita do DNA. Após confirmar a calibração e o direcionamento do feixe de irradiação, prossiga com o experimento. Neste exemplo, camundongos fêmeas C57BL/6J com cinco semanas de idade receberam uma dieta rica em gordura durante uma semana antes do tratamento.No dia anterior ao tratamento, os camundongos foram pesados e divididos em dois grupos com nenhuma diferença significativa de peso entre eles. No dia do tratamento, os camundongos foram pesados novamente e, em seguida, transportados suavemente para a plataforma radiológica e anestesiados dois camundongos, um no grupo experimental e outro no grupo controle. Também configure a manta térmica na temperatura baixa para o tratamento pós-operatório.Posicione o camundongo para receber irradiação conforme descrito anteriormente. Enquanto o tratamento estiver em andamento, mantenha o camundongo controle no câmara de anestesia próximo à plataforma CFIR, para que quaisquer efeitos da radiação ambiente sejam levados em consideração. Após o alvo ser identificado na tomografia computadorizada, mova o camundongo sob controle robótico para alinhar o alvo com o feixe.Em seguida, insira a configuração da dose calculada e aplique a radiação. Após a irradiação, coloque ambos os camundongos sobre a placa aquecida e monitore-os até que acordem. Depois que todos os camundongos forem irradiados, monitore-os diariamente e pese-os duas vezes por semana.Três dias após o tratamento, para confirmar a irradiação, administre injeções intraperitoneais de BRDU um mês depois. Identifique neurogênese em células com BRDU e um marcador neuronal. As distribuições de dose foram medidas com GAF crômico.Filmes sensíveis à radiação embutidos em um camundongo simulado. O cone de radiação tinha uma largura total em meia altura de 2,31 milímetros. O feixe focal demonstra o alinhamento preciso de feixes provenientes de diferentes direções.Este filme pode ser sobreposto a uma radiografia do camundongo real, demonstrando a posição e a precisão do feixe. Caso o direcionamento da ROI seja insuficiente com base nos marcos anatômicos, pode-se utilizar uma injeção de contraste iodado intratecal para aprimorar o direcionamento. Os ventrículos laterais e o terceiro ventrículo são claramente visualizados em exames de TC adquiridos na plataforma radiológica A-C-F-I-R, para confirmar ainda mais o direcionamento guiado por TC do hipotálamo me.A localização do feixe no tecido foi visualizada a partir das quebras de DNA de dupla fita, sendo que a coloração gama H dois A x demonstrou um direcionamento preciso com uma borda extremamente nítida do feixe. O tratamento com arco semelhante ao estereotáxico, consistindo em um arco a 45 graus em relação à vertical, direcionou efetivamente ao hipotálamo basal ventral, sem irradiar outras nichos neurogênicos.O efeito da irradiação na neurogênese foi investigado em camundongos adultos alimentados com dieta rica em gordura. Houve aproximadamente 85% de inibição da neurogênese em comparação com os controles tratados com simulacro. Enquanto isso, em uma estrutura adjacente ao local de irradiação, não houve diferença estatisticamente significativa entre os animais irradiados e os controles simulados.Camundongos irradiados que receberam dietas ricas em gordura antes do tratamento apresentaram ganho de peso reduzido após o tratamento em comparação com o grupo tratado com simulação. Em contraste, camundongos controle alimentados com ração normal, que tinham níveis significativamente mais baixos de neurogênese do que seus pares alimentados com dieta rica em gordura, não mostraram diferença significativa no peso entre os grupos submetidos à simulação versus irradiados. Além disso, essa redução no ganho de peso em camundongos irradiados alimentados com dieta rica em gordura é acompanhada por alterações no metabolismo e na atividade, uma vez dominado.Essa técnica pode ser realizada em aproximadamente 15 minutos por camundongo, se executada corretamente. Apenas não se esqueça de que trabalhar com radiação pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de blindagem de chumbo, detectores de radiação e treinamento adequado no manuseio de radiação, devem sempre ser tomadas antes e durante a realização deste procedimento.

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