Interrogatório funcional do Adulto Hypothalamic Neurogenesis com Focal Radiológica Inibição

O objetivo geral deste procedimento é descrever uma técnica radiológica avançada, que permite realizar irradiação focal em modelos de pequenos animais e, posteriormente, inibir a proliferação com resolução anatômica específica. Isso é feito empregando primeiro imagens volumétricas tridimensionais guiadas por tomografia computadorizada para localização da região de interesse. A segunda etapa do procedimento é calcular a entrega e a duração do tratamento radiológico na região de interesse.

O terceiro passo é realizar a calibração baseada em filme para a dose de radiação. A etapa final é determinar a precisão do feixe de radiação por visualização direta do feixe de radiação no tecido. Em última análise, os resultados desses estudos podem demonstrar o papel funcional potencial de populações de neuroprogenitores em proliferação selecionadas por meio da análise pós-tratamento da fisiologia e do comportamento.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes para suprimir a neurogênese, como a irradiação ampla do cérebro, é que ela usa feixes de radiação tão pequenos quanto 0,5 milímetros de diâmetro para atingir populações neurogenerativas específicas. Isso permite associar inequivocamente defeitos comportamentais ou fisiológicos às funções específicas das populações neurogenerativas. A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de configuração do feixe de radiação são difíceis de aprender inicialmente devido às inúmeras etapas envolvidas no uso do hardware e do software para localização e dosagem do prop, prepare uma câmara de anestesia com gás flúor ISO e, em seguida, adicione um único mouse à câmara.

Paralelamente, prepare uma almofada de aquecimento na configuração baixa para cuidados com os animais pós-tratamento. Quando o mouse não responder mais à compressão de uma almofada de pé, leve-o para a plataforma radiológica e coloque-o no leito de imobilização do estágio robótico. Coloque a boca no copo de anestesia do cone nasal e os dentes no protetor de mordida.

Coloque o rato na cama de imobilização. Se ele não responder, prenda o mouse com fita adesiva. Certifique-se de que a cabeça esteja nivelada em um plano horizontal, puxando as orelhas para cima.

Quando o mouse estiver na posição correta, feche a blindagem protetora de chumbo. Agora adquira uma tomografia computadorizada usando o software integrado da plataforma radiológica para obter uma varredura estrutural anatômica tridimensional do sujeito do mouse a partir das imagens. Verifique se a cabeça está nivelada em relação ao plano horizontal.

Caso contrário, continue ajustando a cabeça do mouse até que fique assim. Agora identifique o ROI das imagens de TC para visualizar o hipotálamo basal ventral com imagens de TC. Opere o tubo de raios-x conforme listado.

Calcule a distância da ROI à superfície do crânio usando um ângulo de 45 graus em relação ao plano horizontal. Usando o software integrado, tire um raio-x do assunto do mouse de cima. Em seguida, remova o mouse da plataforma radiológica.

Coloque-o na almofada de aquecimento e monitore-o até que esteja ativo. A partir das imagens coronais de TC, calcule a profundidade anatômica média do ROI de pelo menos três camundongos para determinar a dosagem de entrega. Como exemplo de um estudo anterior em que 10 cinzas de radiação I foram administrados ao hipotálamo basal da ventra, a profundidade da ROI do crânio de um ângulo de 45 graus é de 0,66 centímetros.

Uma vez que o valor seja conhecido, use o software de planejamento de dose para calcular a rotação, velocidade e duração apropriadas do tratamento para a dose desejada para o ROI. Em seguida, meça as distribuições de dose dos parâmetros calculados. Incorpore três filmes sensíveis à radiação crômica GAF em um mouse simulado de plástico equivalente à água.

Posicione-os entre quatro blocos de plástico equivalentes a água empilhados verticalmente. Coloque o mouse simulado no estágio robótico e execute o feixe de irradiação focal com os parâmetros recém-calculados. Neste exemplo, uma dose de radiação de 10 graus para o hipotálamo basal ventral é testada Após a irradiação, verifique o padrão e a intensidade da dosagem nos filmes para uma rotação angular de 360 graus, visando o hipotálamo basal ventral, o feixe cônico.

Uma radiação produz um anel escuro no filme acima do centro ISO, um pequeno ponto nítido no filme central ISO e um anel mais claro no filme abaixo. O centro ISO agora sobrepôs o filme ISO center GA FCH Chromic sobre os raios-x. O ponto focal irradiado no centro ISO deve se sobrepor ao ROI desejado posteriormente.

A precisão do feixe de irradiação pode ser avaliada no tecido visualizando um marcador de quebras de DNA de fita dupla. Uma vez satisfeito com a calibração e o direcionamento do feixe de irradiação, prossiga com o experimento. Neste exemplo, camundongos C 57 pretos e seis fêmeas J com cinco semanas de idade receberam uma dieta rica em gordura por uma semana antes do tratamento.

No dia anterior ao tratamento, os camundongos foram pesados e divididos em duas coortes, sem diferença significativa de peso entre as coortes. No dia do tratamento, os camundongos foram pesados novamente e, em seguida, transportados suavemente para a plataforma radiológica e anestesiados em dois camundongos, um do grupo experimental e outro controle. Ajuste também a almofada de aquecimento para a configuração baixa para o tratamento pós-operatório.

Configure o mouse para receber irradiação conforme descrito anteriormente. Enquanto o tratamento estiver em andamento, mantenha o camundongo falso na câmara de anestesia perto da plataforma CFIR, para que quaisquer efeitos na radiação ambiente sejam levados em consideração. Depois que o alvo for identificado no tc, mova o assunto do mouse sob o controle robótico para alinhar o alvo com o feixe.

Em seguida, insira a configuração de dose calculada e forneça a radiação após a irradiação. Coloque os dois ratos na almofada de aquecimento e monitore-os até que acordem. Depois que todos os camundongos forem irradiados, monitore-os diariamente e pese-os duas vezes por semana.

Três dias após o tratamento Para confirmar a irradiação, administre injeções intraperitoneais de BRDU um mês depois. Identifique a neurogênese em células com BRDU e um marcador neuronal. As distribuições de dose foram medidas com GAF crômico.

Filmes sensíveis à radiação embutidos em um mouse simulado. O cone de radiação tinha uma largura total de 2,31 milímetros, no máximo. O feixe focal demonstra o alinhamento preciso dos feixes de diferentes direções.

Este filme pode ser sobreposto a um raio-x do objeto real do mouse, demonstrando a posição e a precisão do feixe. Se o direcionamento do ROI for insuficiente com os pontos anatômicos, uma injeção de contraste de iodo intratecal pode ser usada para melhorar o direcionamento. Os ventrículos lateral e terceiro são claramente visualizados em tomografias computadorizadas adquiridas na plataforma radiológica A-C-F-I-R para confirmar ainda mais o direcionamento guiado por TC da membrana hipotalâmica.

A localização do feixe no tecido foi visualizada a partir das quebras de DNA de fita dupla resultantes da coloração gama H dois A x demonstrou um direcionamento preciso com uma borda extremamente afiada para o feixe. O tratamento de arco estereotáxico que consiste em um arco a 45 graus da vertical atingiu efetivamente o hipotálamo basal ventral. Sem irradiar outros nichos neurogênicos.

O efeito da irradiação na neurogênese foi investigado com camundongos adultos alimentados com dieta hiperlipídica. Houve aproximadamente 85% de inibição da neurogênese em comparação com controles tratados com simulação. Já em uma estrutura adjacente que faz fronteira com o local de irradiação, não houve diferença estatisticamente significativa entre os animais irradiados e os controles simulados.

Camundongos irradiados alimentados com dietas ricas em gordura antes do tratamento tiveram diminuição do ganho de peso pós-tratamento em comparação com o grupo tratado com simulação. Em contraste, camundongos de controle alimentados com ração normal, que tinham níveis significativamente mais baixos de neurogênese do que seus colegas alimentados com alto teor de gordura, não mostraram uma diferença significativa de peso entre os grupos simulados e irradiados. Além disso, esse ganho de peso reduzido em camundongos alimentados com alto teor de gordura irradiados é acompanhado por mudanças no metabolismo e na atividade, uma vez dominado.

Essa técnica pode ser feita em aproximadamente 15 minutos por mouse, se executada corretamente. Só não se esqueça de que trabalhar com radiação pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de blindagem de chumbo, detectores de radiação e treinamento adequado de uso de radiação devem sempre ser tomadas antes e durante a execução deste procedimento.