Name: Detectando, visualizar e quantificar a geração de espécies reativas de oxigênio em um modelo de sistema Amoeba (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 41 s
Description: Aprenda a detectar e quantificar espécies reativas de oxigênio em amebas usando microscopia de fluorescência e ensaios em leitor de placas. Estes métodos permitem análise qualitativa e quantitativa do estresse oxidativo celular.

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Somos gratos aos Drs. Karl-Heinz Krause e Vincent Jaquet para ajuda e conselhos para configurar estes protocolos, e também agradecer Christoph Bauer e Jérôme Bosset da Plataforma Bioimaging do NCCR e Dr. Navin Gopaldass por seu apoio técnico. A pesquisa é apoiada por uma bolsa ProDoc da National Science Foundation suíço.

1. Visualização e medição qualitativa de ROS Produção em Fagossomos As contas OBG revestidos deve ser preparado com antecedência. Os processos de revestimento miçangas e técnica agar são adaptados a partir de referências publicadas 5,14. <ol><li> Adicionar 1 ml de suspensão de 3,0 mM esferas de sílica carboxiladas (cerca de 1,8 x 10 9 esferas) em um tubo de 1,5 ml, lavar as contas 3x com 1 ml de PBS por centrifugação rápida e centrifugação. </li><li> Ressuspender as pérolas em 1 ml de PBS contendo 25 mg / ml de cianamida (para activar as esferas de sílica carboxiladas para ligar covalentemente prelabeled BSA), incubar numa roda durante 15 min. </li><li> Lavar 3x com 1 ml de tampão de acoplamento (borato de sódio 0,1 M, pH 8,0) por centrifugação rápida (centrífuga à velocidade máxima de um tampo de mesa mini-centrifuga-se durante 5 segundos, ou, alternativamente, centrifugar a 2.000 g durante 1 min numa centrífuga de bancada) e vórtex para remover o excesso de cianamida. </li><li> Misturar os grânulos foram lavados com 500 mL de coupling tampão contendo 1 mg de verde OxyBurst (OBG) H2HFF (di-hidro-2 &#39;, 4,5,6,7,7&#39;-hexafluorofluorescein)-BSA, encher o tubo com gás azoto a partir de um padrão de gás pode antes de nivelamento, e incubar numa roda, durante 14 horas (durante a noite) à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lave as contas 2x com 1 ml de tampão de têmpera (250 mM de glicina em PBS) para remover não reagiu OBG, e duas vezes com tampão de acoplamento para remover o tampão de têmpera por centrifugação rápida e centrifugação. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão de ligação contendo 50 ng de Alexa Fluor 594 éster de succinimidilo para conjugar a BSA. Encher o tubo com azoto antes de nivelamento, e incubar em uma roda durante 1,5 horas à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lave as contas 3x com 1 ml de tampão de têmpera por centrifugação rápida e vortex para parar a reacção, em seguida, lavar as contas 3x com 1 ml de PBS por centrifugação rápida e centrifugação. </li><li> Finalmente, voltar a suspender as pérolas em 1 ml de PBS com 2 mL de 10% w / v de azida para o armazenamento a longo prazo. Medir a concentration de grânulos em suspensão com um hemocitómetro (geralmente cerca de 1-2 x 10 9 contas / ml), encher o tubo com azoto antes de nivelamento, e armazenar a 4 ° C no escuro. </li><li> A eficiência do revestimento da fluoresceína OBG pode ser testada, verificando o espectro de emissão com excitação a 500 nm. Quando oxidado por H 2 O 2 na presença de peroxidase de rábano (HRP), a intensidade de fluorescência de grânulos oxidadas, no pico de emissão (538 nm), é de 11-12x maior que a dos grânulos revestidos não oxidados. </li><li> Colheita crescimento exponencial células Dictyostelium de um prato 10 centímetros Petri, placa diferentes densidades de células em três centímetros pratos com um plástico opticamente transparente ou com fundo de vidro, e cultivá-las durante a noite. Escolha os pratos que são cerca de 80% confluentes para o experimento. Um protocolo detalhado para o cultivo de células de Dictyostelium foi publicada em 15 de. </li><li> Substituir o meio de cultura com meio loflo (médio LF), incubar2 horas antes da experiência, a fim de diminuir a autofluorescência extracelular e intraendosomal do meio de cultura HL5C. </li><li> Em paralelo, o material fundido 10 ml de 1,5% de agar bacto em meio LF, verter o agar sobre uma superfície plana (isto é, uma placa de vidro de 10 cm x 10 cm), a fim de formar uma camada de agar de cerca de 1 mm de espessura, para esperar 10-15 min a solidificar. Cortar a camada de agar em 2 cm x 2 centímetros quadrados e coloque no meio LF para uso posterior. </li><li> Enquanto isso, prepare a fiação de disco ou grande microscópio de campo, definir a temperatura da câmara ambiental a 22 ° C e ajustar as configurações para este experimento. (Veja os comentários adicionais na discussão). </li><li> Após 2 horas de incubação, aspirar o meio LF a partir dos 3 cm de disco, mas a monocamada de células deve ainda ser coberto por uma fina película de meio. Dilui-se os grânulos revestidos a 1,5 x 10 7 esferas / ml, e adicionar 10 ul para a camada de células. </li><li> Pegue uma folha de agar quadrado, drenar o excesso de líquido, mas manter molhado. Com cuidado, coloque ªe agar quadrados no topo da camada de células. Não mova o quadrado agar quando se está deitado sobre as células. O agar é utilizado para aumentar o contato entre esferas e células, melhorando assim a absorção, e também ligeiramente comprime as células, mantendo-as melhor no plano focal da objetiva. </li><li> Coloque a tampa sobre o prato, coloque-o no palco microscópio e, automaticamente, tirar fotos nos canais vermelho, verde e fase a cada 1 min de 2 horas ou mais. </li><li> Selecione e focar em eventos celulares que contêm todo o processo de fagocitose. Mesclar os 3 canais otimizados e montar as imagens em um filme usando o software de processamento de imagem profissional. Quantificar intensidades de fluorescência de cada contas selecionadas em canais vermelho e verde, ea proporção de verde / vermelho vai refletir a dinâmica phagosomal produção ROS das células. </li></ol> 2. Medição quantitativa e Média taxa de transferência de superóxido intracelular Produção <ol><li> Coletar one 80% confluentes prato de Dictyostelium, em 10 ml de meio HL5C. Células Centrífuga Dictyostelium a 850 xg durante 5 min, com cuidado e o excesso de meio completamente aspirado. Ressuspender as células em tampão SS6.4 [0,12 M de sorbitol em tampão de Sorensen (14,69 mM de KH 2 PO 4, e 6,27 mM de Na 2 HPO 4), pH 6,4], contagem de células e diluir para uma densidade final de 6 x 10 6 células / ml (ver comentários adicionais na discussão). </li><li> Adicionar 50 ul de suspensão celular em cada poço de uma branca não transparente placa de 96 poços (ver comentários adicionais na discussão). </li><li> Diluir estoque DHE (30 mM em DMSO) a 500 vezes com SS6.4, pipeta 50 ul de DHE diluída para cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos, se necessário. A concentração final da DHE é de 30 uM. A reacção inicia-se imediatamente. </li><li> Estímulos ou inibidores podem ser adicionados neste momento, ou em outros pontos de tempo de acordo com as necessidades específicas. </li><li> Use o ponto de &quot;leitura &amp; # top final34, Modo de um leitor de microplacas de fluorescência, fluorescência com excitação / emissão a 522 nm/605 nm, ler todos os 2 minutos durante 1 hora, a vibração da média de 5 segundos / min, a 22 ° C. </li></ol> 3. Quantitativa e High Throughput Medição de Extracelular H 2 O 2 Produção <ol><li> Siga os mesmos passos descritos em 2.1 e 2.2. </li><li> Prepare HRP diluída pela adição de 5 ul de estoque de HRP (100 U / ml em água destilada) em 10 ml de SS6.4, vórtice ou inverter o tubo para misturar bem e manter em gelo para posterior utilização. A solução HRP diluída é de 0,05 U / ml. </li><li> Preparar a mistura de reacção por mistura de AUR o estoque AUR (AUR 10 mM em DMSO) e a solução diluída em tampão HRP SS6.4 para as concentrações finais de 6,25 jiM, e 0,005 U / ml, respectivamente. Como um exemplo, para preparar a mistura de reacção para 40 reacções, misturar 1,600 mL de SS6.4 com 400 ul de HRP e diluída com 2,5 ml de solução de estoque AUR. </li><li> Adicionar 50 ul de mistura AURtura em cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos, se necessário. Agora, a reacção começa. </li><li> Estímulos ou inibidores podem ser adicionados neste momento, ou em outros pontos de tempo de acordo com as necessidades específicas. </li><li> Use o ponto de modo final &quot;top leitura&quot; de uma micro leitor de placas de fluorescência, com fluorescência excitação / emissão a 530 nm nm/590, leia cada 2 minutos para 1 hora, a vibração da média 5 seg / min, a 22 ° C. </li></ol>

<ol><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li>
<li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li>
<li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dictyBase+2013%3A+integrating+multiple+Dictyostelid+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li>
<li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li>
<li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Part.+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2(2008).</li>
<li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li>
<li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li>
<li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li>
<li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li>
<li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li>
<li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li>
<li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li>
<li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-overlay+immunofluorescence%3A+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li>
<li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li>
<li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li>
<li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T. Autophagosomes and Phagosomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDieckmann%2C+R+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Deretic, V. 445, Humana Press. Totowa, NJ. 317-328 (2008).</li>
<li>Amir, Y., Edward, O. -A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proto.+Exch%22%5BJournal%5D)">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li>
<li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Em comparação com os métodos anteriormente descritos, o ensaio de OBG visualiza dinamicamente o processo de geração de ROS phagosomal ao nível da célula individual, em vez de medir o sinal médio ROS a partir de uma população de células. Tais métodos população de amostragem tendem a obscurecer a informação crítica causada por fagocitose não-sincrónico. Nós adaptado com sucesso DHE e AUR ensaios para Dictyostelium e otimizados os protocolos. Mais importante, nós especificados os tipos e localizações subcelulares ...

Espécies reativas de oxigênio (ROS) estão envolvidos em uma ampla variedade de processos biológicos, tais como a defesa do hospedeiro, a sinalização, o desenvolvimento do tecido e resposta à lesão, bem como hipertensão e câncer. O phagosomal NADPH oxidase máquinas bem estudado é dedicado a geração de ROS rápida, conhecida como a explosão oxidativa, para matar as bactérias ingeridas em phagosomes dos neutrófilos 1. Além disso, o vazamento de elétrons como um subproduto da cadeia respiratória mitocondrial foi previamente pensado para ser responsável apenas por uma fonte não regulamentada de ROS. Mas, recentemente, foi identificado como um mecanismo importante para contribuir para a matança intraphagosomal de bactérias nos macrófagos do rato 2. Nos últimos anos, a ameba social Dictyostelium, tornou-se um modelo poderoso e popular para o estudo de células mecanismos intrínsecos da resposta imune inata. De fato, Dictyostelium e fagócitos humanos partilham uma surpreendentemente alto nível de conservação em molecular máquinas responsáveis ​​por bactérias sentindo, imersão e matando 3,4. Os homólogos de proteínas e enzimas relacionadas com a produção de ROS e toxinas, tais como oxidase de NADPH, catalases, superóxido dismutase, pode ser encontrado em humanos e Dictyostelium. À medida que a ameba melhor estudada, Dictyostelium apresenta várias vantagens únicas sobre sistema modelo de mamíferos. Eles crescer à temperatura ambiente, sem a necessidade de CO 2, com um tempo de duplicação de 8-10 horas. Eles podem ser facilmente mantidas como culturas aderentes ou em suspensão. Além disso, graças ao seu genoma haplóide completamente seqüenciado e anotado, e para a manipulação genética fácil, Dictyostelium tornou-se um modelo muito atraente organismo experimental. Em estudos anteriores, vários derivados clorados e fluorados de fluoresceína (conhecidos coletivamente como OxyBurst verde, OBG) que emitem fluorescência após a oxidação por ROS, têm sido usados ​​como um repórter ROS. Cell-permeante esterified derivados são usados ​​para medir citoplasmática ROS, enquanto dextrano ou derivados acoplados à proteína de células-impermeabilizante são usados ​​para medir ROS extracelular. Em particular, grânulos de OBG-ASB revestidas já tiverem sido usadas para detectar a produção de ROS phagosomal em células de mamíferos 5. No entanto, a abordagem baseada em leitor de microplacas só pode dar uma curva de geração de ROS em média de uma população de células. Com o presente protocolo, usando Dictyostelium, um dos fagócitos profissionais e condições experimentais otimizadas, obtemos fagocitose estável e eficiente, sem conjugar qualquer opsonina sobre as contas. DHE tem sido usada em vários sistemas de modelos, tais como os neutrófilos e macrófagos de mamífero, para detectar a produção de ROS 6-9. Enquanto isso, existem algumas controvérsias sobre a especificidade e sensibilidade do método 8,10. Como uma versão melhorada de Amplex Red, a intensidade de fluorescência de AUR é menos sensível ao pH, o que torna mais adequado para medirROS em ambientes não-neutras ou fracamente ácidas. AUR foi recentemente aplicado em vários sistemas de mamíferos 11,12, mas a sua utilização em modelos não mamíferos, o que muitas vezes necessitam de meios de crescimento ligeiramente ácido, não tem sido relatado ainda. Além disso, não existe um protocolo publicado quantitativamente e dinamicamente medir a produção e localização ROS na ameba Dictyostelium sociais. O objetivo do conjunto de protocolos apresentados é fornecer uma solução fácil e versátil para monitorar vários ROS e sua localização, e ainda dar insights sobre os mecanismos celulares relacionados com o ROS. Para o ensaio de OBG, usamos a microscopia ao vivo para acompanhar todo o processo de geração de ROS phagosomal após a captação de contas OBG revestidos por células Dictyostelium, e forneceu uma nova abordagem para estudar o mecanismo de matar intraphagosomal de bactérias. Nós otimizamos de médio rendimento DHE e AUR ensaios em Dictyostelium, para medir Superox intracelularide e H 2 O 2 extracelular produção, respectivamente, utilizando LPS como um potente estimulador de ROS. Observe que o LPS foi recentemente demonstrado que o aumento da actividade bactericida de Dictyostelium direcção bactérias ingeridas 13. Além disso, o tratamento com DEDTC e catalase confirmado explicitamente que estes dois métodos de medir especificamente diferentes tipos e localizações subcelulares de ROS em Dictyostelium. Finalmente, o ensaio de OBG pode ser adaptado a qualquer célula fagocítica aderente, por opsonizantes ainda mais os grânulos com ligandos para receptores de células fagocíticas animais. Em princípio, os ensaios de DHE e AUR pode ser também para medições em qualquer célula aderente ou não aderente em condições experimentais apropriadas aperfeiçoá-lo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td><td>Invitrogen</td><td>O-13291</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>Contas de sílica carboxilada</td><td>Kisker Biotech</td><td>PSi-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>HL5C médio</td><td>para médio</td><td>HLC0102</td><td></td></tr><tr><td>meio LoFlo</td><td>para médio</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>Bacto ágar</td><td>BD</td><td>204010</td><td></td></tr><tr><td>Dihidroetídio</td><td>Sigma</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed</td><td>Invitrogen</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase de rábano</td><td>Roche</td><td>10108090001</td><td></td></tr><tr><td>Dietilditiocarbamato (DEDTC)</td> <td>Sigma</td><td>D3506-100G</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C9322-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cyanamide</td><td>Sigma</td><td>187364-25G</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeos</td><td>Sigma</td><td>L2630-25G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>ibidi &mu;-Dish 35 mm, high</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td>Fundo feito de plástico opticamente transparente</td></tr><tr><td>Prato MatTek 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Fundo feito de um lamínula de vidro</td></tr><tr><td>Scepter Cell Counter</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC00000</td><td></td></tr><tr><td>Placa branca de 96 poços</td><td>Nunc</td><td>236108</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>SORVALL</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>BioTek</td><td>Synergy Mx</td><td></td></tr></tbody></table>

detectando, visualizar e quantificar a geração de espécies reativas de oxigênio em um modelo de sistema amoeba

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Espécies reativas de oxigênio (ROS) compreendem uma gama de moléculas reativas e de curta duração contendo oxigênio, que são dinamicamente interconvertidos ou eliminados ou cataliticamente ou espontaneamente. Devido aos curtos períodos de vida da maioria ROS ea diversidade de suas fontes e localizações subcelulares, um quadro completo só pode ser obtida por meio de medições cuidadosas usando uma combinação de protocolos. Aqui, apresentamos um conjunto de três protocolos diferentes usando OxyBurst Green (OBG) revestida de contas, ou dihydroethidium (DHE) e Amplex Ultrared (AUR), para monitorar qualitativa e quantitativamente vários ROS em fagócitos profissionais, como Dictyostelium. Nós otimizamos os processos de revestimento contas e miçangas OBG revestidos usados ​​e microscopia ao vivo para visualizar dinamicamente intraphagosomal geração ROS no nível de uma única célula. Foram identificados lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli como um potente estimulador para a geração de ROS em Dictyostelium. Além disso, nós dtempo real eveloped, ensaios de médio rendimento, utilizando DHE e AUR para medir quantitativamente superóxido intracelular e extracelular H 2 O 2 a produção, respectivamente.

A geração de ROS em phagosomes pode ser visualizada qualitativamente e dinamicamente por microscopia (S1 do ficheiro). A fluorescência vermelha emitida pela Alexa fluor 594 é insensível pH e mantém-se constante no ambiente phagosomal, enquanto que a oxidação de OBG aumenta a fluorescência no canal verde. O espectro de emissão de ensaios in vitro e oxidado OBG grânulos revestidos não oxidados são comparados na Figura 1B, que mostra um aumento significativo da intensidad...

Nós adaptamos um conjunto de protocolos para a medição de espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem ser aplicados em vários modelos celulares ameba e mamíferos para estudos qualitativos e quantitativos.

Detectando, visualizar e quantificar a geração de espécies reativas de oxigênio em um modelo de sistema Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

O objetivo geral do experimento a seguir é fornecer uma solução simples e versátil para monitorar diversas espécies reativas de oxigênio ou ERO e sua localização, além de oferecer novas perspectivas sobre mecanismos celulares relacionados às ERO. Isso é alcançado mediante a realização de três ensaios diferentes, sendo que o primeiro utiliza microesferas revestidas com RST verde ou OB G e microscopia em tempo real, em que a fluoresceína OB G e o Alexa Fluor 594 são ligados covalentemente à superfície de microesferas de sílica de três mícrons por meio de BSA.A emissão de fluorescência do OBG fluoresceína indica a oxidação por ESP, enquanto o sinal do Alexa Fluor 594 ajuda a localizar as microesferas e serve como controle para a quantificação da fluorescência. O segundo método utiliza a sonda sensível ao superóxido di-hidroetídio ou DHE em um ensaio baseado em leitor de placas. Como resultado da oxidação pelo superóxido, a etídio é capaz de se intercalar no DNA nuclear e mitocondrial e apresenta picos de excitação e emissão deslocados para 522 nanômetros e 605 nanômetros, respectivamente.A intensidade de fluorescência de AUM corresponde à quantidade de produção de superóxido, permitindo a medição quantitativa da geração de superóxido intracelular nas células. O terceiro método é também um ensaio baseado em leitor de placas. A sonda sensível ao peróxido de hidrogênio plex ultra red ou a UR é utilizada para medir quantitativamente a produção extracelular de peróxido de hidrogênio.A intensidade fluorescente de um OX de UR corresponde à quantidade de peróxido de hidrogênio produzido fora das células. São obtidos resultados que mostram a localização da geração dinâmica de ERO com base nos ensaios O-B-G-D-H-E e UR. A principal vantagem desta técnica em relação aos outros métodos existentes, como os ensaios em placa baseados em OB GSA, é que ela visualiza dinamicamente a geração de Al Roth no nível de célula única.Em vez de espelhar e sinal médio de Roth de uma população de células. Tais métodos de média populacional tendem a ocultar informações críticas devido à fagocitose não sincronizada. Para iniciar o procedimento de codificação de microesferas com oxy, Burt Green ou OBG, adicione um mililitro de uma suspensão de microesferas de sílica carboxiladas de 3,0 mícrons em um tubo de 1,5 mililitro.Centrifugue o tubo rapidamente e remova o sobrenadante. Adicione um mililitro de PBS e vortex neste sentido. Lave as microesferas três vezes com PBS.Após a terceira lavagem, remova o sobrenadante e ressuspenda as esferas. Em um mililitro de PBS contendo 25 miligramas por mililitro de cianeto, a solução de cianeto deve ser preparada fresca cada vez antes do uso, incubando em rotação durante 15 minutos. Isso ativará as esferas de sílica carboxiladas para ligarem covalentemente a BSA pré-marcada; após 15 minutos, centrifugue o tubo e remova o sobrenadante.Adicione um mililitro de tampão de acoplamento e lave por vórtex três vezes com tampão de acoplamento, fazendo uma centrifugação rápida e vórtex, para remover o excesso de cianeto; misture as esferas lavadas com 500 microlitros de tampão de acoplamento contendo um miligrama de OBGH dois H-F-F-B-S-A e, em seguida, encha o tubo com gás nitrogênio proveniente de um cilindro padrão. Após fechar o tubo, incube em rotação por 14 horas à temperatura ambiente, no escuro, no dia seguinte. Bloqueie o OBG não reagido lavando as esferas duas vezes com um mililitro de tampão de bloqueio, por meio de uma centrifugação rápida e vórtex, e depois lave duas vezes com tampão de acoplamento para remover o tampão de bloqueio. Após a remoção do sobrenadante, adicione um mililitro de tampão de acoplamento contendo 50 microgramas de LOR 594 cin a éster médio para conjugação à BSA.Encha o tubo com tampa de nitrogênio e incube em rotação durante 1,5 hora à temperatura ambiente no escuro. Ao final da incubação de 1,5 hora, interrompa a reação lavando as microesferas três vezes com um mililitro de tampão de quenching. Em seguida, lave as microesferas três vezes com um mililitro de PBS.Finalmente, Ray, suspenda as microesferas em um mililitro de PBS com dois microlitros de azida a 10% (peso por volume) para armazenamento de longo prazo. Meça a concentração de microesferas na suspensão com um hemocitômetro; normalmente é de um a dois vezes 10 elevado à nona microesferas por mililitro.Encha o tubo com tampa de nitrogênio e armazene a quatro graus Celsius no escuro. Inicie este procedimento colhendo células de alium em crescimento exponencial de uma placa de Petri de 10 centímetros. Plaque diferentes densidades de células em placas de três centímetros com fundo plástico ou de vidro opticamente transparente e cultive-as durante a noite até a manhã seguinte.Escolha as placas com cerca de 80% de confluência para uso no experimento. Substitua o meio de cultura por meio de baixo fluxo ou meio LF e incube por duas horas antes do experimento, a fim de reduzir a autofluorescência extracelular e intra-endossomal do meio de cultura HL five C. Derreta 10 mililitros de ágar BDO 1,5% no meio LF e despeje o ágar sobre uma superfície plana para formar uma camada de ágar com cerca de um milímetro de espessura.Aguarde de 10 a 15 minutos para que o ágar solidifique. Corte a camada de ágar em quadrados de dois por dois centímetros e coloque em meio LF para uso posterior. Repare o microscópio de campo claro.Defina a temperatura da câmara ambiental em 22 graus Celsius e ajuste as configurações necessárias para o experimento. Após duas horas de incubação, aspire o meio LF do recipiente de três centímetros, mas deixe a monocamada de células coberta por uma fina película de meio. Dilua as microesferas revestidas com OBG previamente preparadas para 1,5 vezes 10 à sétima microesferas por mililitro e adicione 10 microlitros sobre a camada de células.Retire uma lâmina quadrada de ágar e remova qualquer líquido em excesso, mas mantenha o ágar úmido. Coloque suavemente a lâmina de ágar sobre a camada de células. A sobreposição de ágar aumenta o contato entre as microesferas e as células, melhorando assim a captação.Ele também comprime ligeiramente as células, mantendo-as melhor no plano focal do objetivo. Coloque a tampa sobre a placa para o sucesso do experimento. Não mova a sobreposição de AGA quando ela estiver cobrindo as células e também é fundamental iniciar imediatamente a etapa de aquisição de imagens.Em seguida, coloque a placa sobre a platina do microscópio e capture automaticamente imagens nos canais vermelho, verde e de contraste de fase a cada minuto, durante duas horas ou mais. Para medir a produção de ERO, selecione e foque em eventos celulares que contenham todo o processo de fagocitose. Utilizando um software profissional de processamento de imagens, una os três canais otimizados e monte as imagens em um filme.Quantifique as intensidades de fluorescência de cada uma das microesferas selecionadas nos canais vermelho e verde. A razão entre vermelho e verde refletirá a produção dinâmica de FOMO R os pelas células. Para medir a produção intracelular de superóxido, primeiro colete uma placa com 180% de confluência de alium em 10 mililitros de meio HL cinco C, em seguida centrifugue as células de alium a 850 vezes G durante cinco minutos e aspire cuidadosa e completamente o meio, ressuspenda as células em tampão SS 6.4, conte as células e dilua até uma densidade final de seis vezes 10 à sexta potência células por mililitro.Adicione 50 microlitros de suspensão celular em cada poço de uma placa branca opaca de 96 poços. Dilua o estoque de di-hidro-etídio ou DHE em 500 vezes com tampão SS 6,4. Em seguida, utilize uma pipeta multicanal para distribuir 50 microlitros do DHE diluído em cada poço da placa de 96 poços. A concentração final de DHE é de 30 micromolar.A reação começará imediatamente. Estímulos ou inibidores podem ser adicionados neste momento ou em outros pontos temporais conforme necessidades específicas. Incube as células com agitação suave do meio a 22 graus Celsius.Leia a fluorescência com um leitor de microplacas com fluorescência a cada dois minutos durante uma hora. Utilize o modo de leitura superior no ponto final com excitação de fluorescência em 522 nanômetros e emissão em 605 nanômetros. Inicie este procedimento preparando uma placa de 96 poços com células dium conforme demonstrado no segmento anterior.Prepare a peroxidase de rábano-picante diluída ou HRP adicionando cinco microlitros do estoque de HRP em 10 mililitros de tampão SS 6,4. Inverta o tubo para homogeneizar bem e mantenha em gelo. A solução de HRP diluída está a 0,05 unidades por mililitro.Prepare a plex ultra red ou uma mistura de reação UR misturando o estoque de UR e a solução diluída de HRP no tampão SS 6,4 até as concentrações finais de 6,25 micromolares de UR e 0,005 unidades por mililitro de HRP. Adicione 50 microlitros da mistura UR em cada poço.A reação começará imediatamente. Estímulos ou inibidores podem ser adicionados neste momento ou em outros pontos temporais conforme necessidades específicas. Incube as células com agitação suave do meio a 22 graus Celsius.Leia a fluorescência com um leitor de microplacas com fluorescência a cada dois minutos durante uma hora. Utilize o modo de leitura superior no ponto final com excitação de fluorescência em 530 nanômetros e emissão em 590 nanômetros. A eficiência do revestimento do OB g fluoresceína é testada utilizando peróxido de hidrogênio e HRP para oxidar as microesferas revestidas in vitro e verificando o espectro de emissão utilizando excitação em 500 nanômetros.Como mostrado neste gráfico, as microesferas oxidadas exibem um pico de emissão significativo em 538 nanômetros em comparação com o das microesferas não oxidadas, com uma razão de intensidade de pelo menos 11 a 12 vezes maior. A geração de ERO nos fagossomos em células dium pode ser visualizada qualitativa e dinamicamente por microscopia, conforme mostrado neste filme representativo em lapso de tempo gravado por 40 minutos usando ampliação de seis x durante o primeiro minuto após a internalização. Por fagocitose, a fluorescência das microesferas revestidas com OBG fluorescein mudou de vermelho para laranja brilhante, indicando que as ERO provavelmente foram produzidas diretamente no interior dos fagossomos.A produção intracelular de superóxido e extracelular de peróxido de hidrogênio é quantificada pelos ensaios DHE e UR, respectivamente. Um resumo das reações bioquímicas relacionadas a esses dois ensaios é apresentado. O superóxido é convertido em peróxido de hidrogênio pela superóxido dismutase ou SOD, e o peróxido de hidrogênio é convertido em água e oxigênio pela catalase no ensaio DHE.Um leitor de microplacas é utilizado para medição quantitativa de superóxido intracelular com média produtividade. Um experimento representativo mostra que, quando estimulado com lipopolissacarídeo de E. coli (LPSA), a produção dinâmica de superóxido a partir de células AX dois é significativamente maior do que o nível basal de células AX dois não estimuladas e do que o fundo da reação no tampão; a diminuição da fluorescência azul e o aumento da fluorescência vermelha são inversamente correlacionados. Como esperado.A localização da produção de R Os medida pelo ensaio com DHE é confirmada pelos seguintes resultados. A adição do inibidor permeável à membrana de superóxido dismutase D-E-D-T-C-A aumentou o sinal de DHE de maneira dependente da dose, indicando que o D-E-D-T-C causou o acúmulo do substrato da superóxido dismutase. Alternativamente, a adição de um agente quenchador de peróxido de hidrogênio permeável à membrana não afetou a produção de superóxido no ensaio A UR.Um leitor de microplacas é utilizado para medição quantitativa de média escala da produção extracelular de peróxido de hidrogênio. Um experimento representativo mostra que, quando estimulado com LPS, a produção dinâmica de peróxido de hidrogênio pelas células AX dois é significativamente maior do que o nível basal das células AX dois não estimuladas e a reação de fundo; quando tratadas com várias concentrações de D-E-D-T-C ou catalase, o sinal A UR diminui de maneira dependente da dose, devido à inibição da produção de peróxido de hidrogênio a partir do superóxido intracelular e ao esgotamento do peróxido de hidrogênio extracelular, respectivamente. Os tratamentos com D-E-D-T-C e catalase confirmaram explicitamente que os ensaios DHE e A UR medem especificamente diferentes tipos e localizações subcelulares de ERO Indicum seguindo este procedimento.Outros métodos, como espelhar a geração de Ross durante a infecção com bactérias patogênicas ou não patogênicas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a forma pela qual o garanhão Dictal responderá a diferentes infecções bacterianas em termos de geração de perda. E não se esqueça de que trabalhar com bactérias patogênicas, como Microbacterium marum, pode ser extremamente perigoso, e precauções, como medidas apropriadas de BSL 2, devem ser sempre adotadas ao realizar este procedimento.

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Biology

Biologia

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