Detectando, visualizar e quantificar a geração de espécies reativas de oxigênio em um modelo de sistema Amoeba

O objetivo geral do experimento a seguir é fornecer uma solução fácil e versátil para monitorar várias espécies reativas de oxigênio ou ROS e sua localização e fornecer mais informações sobre os mecanismos celulares relacionados a ROS. Isso é conseguido realizando três ensaios diferentes, o primeiro dos quais usa esferas verdes RST ou revestidas com OB G e microscopia ao vivo, fluoresceína ob g e Alexa. O flúor 594 é acoplado covalentemente à superfície de três mícrons de grânulos sica via BSA.

A emissão de fluorescência da fluoresceína OBG indica a oxidação por ROS, enquanto o sinal do Alexa Fluor 594 ajuda a localizar os grânulos e serve como controle para a quantificação da fluorescência. O segundo método utiliza a sonda sensível ao superóxido dihidro etídio ou DHE em um ensaio baseado em leitor de placas. Como resultado da oxidação pelo superóxido, o etídio é capaz de se intercalar no DNA nuclear e mitocondrial e mudou os picos de excitação e emissão em 522 nanômetros e 605 nanômetros, respectivamente.

A intensidade de fluorescência do AUM corresponde à quantidade de produção de superóxido, permitindo a medição quantitativa da geração de superóxido intracelular nas células. O terceiro método também é um ensaio baseado em leitor de placas. A sonda sensível ao peróxido de hidrogênio plex ultra red ou um UR é usada para medir quantitativamente a produção de peróxido de hidrogênio extracelular.

A intensidade fluorescente de um UR OX corresponde à quantidade de peróxido de hidrogênio produzida fora das células. São obtidos resultados que mostram a localização da geração dinâmica de ROS com base nos ensaios O-B-G-D-H-E e UR. A principal vantagem desta técnica sobre os outros métodos existentes, como OB GSAs baseados em taxa de placa, é que ela visualiza dinamicamente a geração de Al Roth no nível de célula única.

Em vez de espelhar e calcular a média do sinal de Roth de uma população de células. Tais métodos de média populacional tendem a obscurecer informações críticas devido à fagocitose não síncrona. Para iniciar o procedimento de codificação de esferas com oxi, Burt Green ou OBG, adicione um mililitro de uma suspensão de esferas de sílica carboxilada de 3,0 mícrons em um tubo de 1,5 mililitro.

Gire o tubo rapidamente e remova o sobrenadante. Adicione um mililitro de PBS e vórtice desta maneira. Lave as contas três vezes com PBS.

Após a terceira lavagem, remova o sobrenadante e ressuspenda os grânulos. Em um mililitro de PBS contendo 25 miligramas por mililitro de cianeto, a solução de cianeto deve ser preparada recentemente a cada vez antes do uso incubar em uma roda por 15 minutos. Isso ativará os grânulos de sílica carboxilada para ligar covalentemente o BSA pré-marcado após 15 minutos, centrifugar o tubo, remover o sobrenadante.

Adicione um mililitro de tampão de acoplamento e lave em vórtice três vezes com tampão de acoplamento por uma centrifugação rápida e vórtice para remover o excesso de cianeto, misture os grânulos lavados com 500 microlitros de tampão de acoplamento contendo um miligrama de OBGH dois HFB Depois de tampar o tubo incubado em uma roda por 14 horas em temperatura ambiente no escuro no dia seguinte, extinguir o OBG não reativo lavando os grânulos duas vezes com um mililitro de tampão de têmpera por uma centrifugação rápida e vórtice e, em seguida, lave duas vezes com tampão de acoplamento para remover o tampão de têmpera. Após a remoção do sobrenadante, adicione um mililitro de tampão de acoplamento contendo 50 microgramas de LOR 594 cin um éster médio para conjugar com BSA.

Encha o tubo com tampa de nitrogênio e incube em uma roda por 1,5 horas em temperatura ambiente no escuro. No final da incubação de 1,5 horas, pare a reação lavando as esferas três vezes com um mililitro de tampão de têmpera. Isso é seguido pela lavagem das contas três vezes com um mililitro de PBS.

Finalmente, Ray, suspenda as contas em um mililitro de PBS com dois microlitros de 10% de peso por volume. Azida para armazenamento de longo prazo. Meça a concentração de grânulos na suspensão com um hemocitômetro, normalmente é de uma a duas vezes 10 elevado ao nono grânulo por mililitro.

Encha o tubo com tampa de nitrogênio e armazene-o quatro graus Celsius no escuro. Inicie este procedimento colhendo células de alium de crescimento exponencial de uma placa de placa de Petri de 10 centímetros. Diferentes densidades de células em pratos de três centímetros com um fundo de plástico ou vidro opticamente transparente e cultivá-los durante a noite na manhã seguinte.

Escolha os pratos que são cerca de 80% confluentes para uso no experimento. Substituir o meio de cultura por meio de baixo fluxo ou LF e incubar durante duas horas antes da experiência, a fim de diminuir a autofluorescência extracelular e intra-endossomal do meio de cultura HL cinco C. Derreta 10 mililitros de ágar 1,5% BDO em meio LF e despeje o ágar em uma superfície plana para formar uma camada de ágar com cerca de um milímetro de espessura.

Aguarde de 10 a 15 minutos para que o ágar-ágar solidifique. Corte a camada de ágar em quadrados de dois por dois centímetros e coloque em meio LF para mais tarde. Usar. Repare o microscópio de campo amplo.

Defina a temperatura da câmara ambiental para 22 graus Celsius e ajuste as configurações necessárias para o experimento. Após duas horas de incubação, aspirar o meio LF da placa de três centímetros, mas deixar a monocamada celular coberta por uma fina película de meio. Dilua as esferas revestidas com OBG previamente preparadas para 1,5 vezes 10 elevado à sétima esferas por mililitro e adicione 10 microlitros à camada de células.

Pegue uma folha quadrada de ágar e escorra o excesso de líquido, mas mantenha o ágar úmido. Coloque delicadamente o quadrado de ágar no topo da camada celular. A sobreposição de ágar aumenta o contato entre grânulos e células, melhorando assim a absorção.

Também comprime levemente as células, mantendo-as melhor no plano focal da objetiva. Coloque a tampa no prato Para o sucesso do experimento. Não mova a sobreposição AGA quando ela estiver cobrindo as células e também é fundamental iniciar a etapa de imagem imediatamente.

Em seguida, coloque o prato no microscópio stage e tire fotos automaticamente nos canais vermelho, verde e de fase a cada minuto por duas horas ou mais. Para medir a produção de ROS, selecione e concentre-se em eventos celulares que contêm todo o processo de fagocitose. Usando um software profissional de processamento de imagem, mescle os três canais otimizados e monte as imagens em um filme.

Quantifique as intensidades de fluorescência de cada uma das esferas selecionadas nos canais vermelho e verde. A proporção de vermelho para verde refletirá a produção dinâmica de FOMO R os das células. Para medir a produção de superóxido intracelular primeiro, colete 180% de prato confluente de alium em 10 mililitros de HL cinco C em seguida, centrifugue as células alium a 850 vezes G por cinco minutos e aspire cuidadosa e completamente o meio ressus, ressuspenda as células em células de contagem de tampão SS 6.4 e dilua até uma densidade final de seis vezes 10 elevado a seis células por mililitro.

Adicione 50 microlitros de suspensão celular em cada poço de um estoque de diidro etídio diluído de 96 poços ou DHE branco não transparente 500 vezes com tampão SS 6.4. Em seguida, use uma pipeta multicanal para dispensar 50 microlitros do DHE diluído em cada poço da placa de 96 poços. A concentração final de DHE é de 30 micromolares.

A reação começará imediatamente. Estímulos ou inibidores podem ser adicionados neste ponto ou em outros momentos de acordo com necessidades específicas. Incube as células com agitação média a 22 graus Celsius.

Leia a fluorescência com um leitor de microplacas de fluorescência a cada dois minutos durante uma hora. Use o modo de leitura superior do ponto final com excitação de fluorescência a 522 nanômetros e emissão a 605 nanômetros. Comece este procedimento preparando uma placa de 96 poços com células de dío, conforme demonstrado no segmento anterior.

Prepare a peroxidase diluída de rabanete ou HRP adicionando cinco microlitros de estoque de HRP em 10 mililitros de tampão SS 6.4. Inverta o tubo para misturar bem e mantenha no gelo. A solução HRP diluída está a 0,05 unidades por mililitro.

Prepare o plex ultra red ou uma mistura de reação UR misturando o estoque de UR e a solução diluída de HRP em tampão SS 6.4 até concentrações finais de 6,25. Micromolar a UR e 0,005 unidades por mililitro. HRP adiciona 50 microlitros de uma mistura UR em cada poço.

A reação começará imediatamente. Estímulos ou inibidores podem ser adicionados neste ponto ou em outros momentos de acordo com necessidades específicas. Incube as células com agitação média a 22 graus Celsius.

Leia a fluorescência com um leitor de microplacas de fluorescência a cada dois minutos durante uma hora. Use o modo de leitura superior do ponto final com excitação de fluorescência a 530 nanômetros e emissão a 590 nanômetros. A eficiência do revestimento da fluoresceína OB g é testada usando peróxido de hidrogênio e HRP para oxidar os grânulos revestidos in vitro e verificando o espectro de emissão usando excitação a 500 nanômetros.

Como mostrado neste gráfico, os grânulos oxidados mostram um pico de emissão significativo em 538 nanômetros em comparação com o de grânulos não oxidados com uma relação de intensidade de pelo menos 11 a 12 vezes. A geração de ROS em fagossomos em células de dium pode ser visualizada qualitativa e dinamicamente por microscopia, conforme mostrado neste filme representativo de lapso de tempo gravado por 40 minutos usando ampliação de seis x durante o primeiro minuto após o aumento. Por fagocitose, a fluorescência dos grânulos revestidos com fluorescência OBG mudou de vermelho para laranja brilhante, indicando que as ROS provavelmente foram produzidas diretamente dentro dos fagossomos.

A produção de superóxido intracelular e peróxido de hidrogênio extracelular é medida quantitativamente pelos ensaios DHE e UR, respectivamente. Um resumo das reações bioquímicas relacionadas a esses dois ensaios é mostrado. O superóxido é convertido em peróxido de hidrogênio pela superóxido dismutase ou SOD e o peróxido de hidrogênio é convertido em água e oxigênio por catalase no ensaio DHE.

Um leitor de microplacas é usado para medição quantitativa de rendimento médio de superóxido intracelular. Um experimento representativo mostra que, quando estimulado com lipopolissacarídeo LPSA de e coli, a produção dinâmica de superóxido de AX duas células é significativamente maior do que o nível basal de AX duas células não estimuladas e o fundo da reação em tampão, a diminuição da fluorescência azul e o aumento da fluorescência vermelha estão inversamente correlacionados. Como esperado.

A localização da produção de R os medida pelo ensaio DHE é confirmada pelos seguintes resultados. A adição de inibidor de superóxido dismutase permeada por membrana D-E-D-T-C-A aumentou o sinal DHE de maneira dependente da dose, indicando que o D-E-D-T-C causou o acúmulo do substrato da superóxido dismutase. Alternativamente, a adição de um supressor de peróxido de hidrogênio IMP de membrana não afetou a produção de superóxido no ensaio A UR.

Um leitor de microplacas é usado para medição quantitativa de médio rendimento da produção de peróxido de hidrogênio extracelular. Um experimento representativo mostra que, quando estimulado com LPS, a produção dinâmica de peróxido de hidrogênio de AX duas células é significativamente maior do que o nível basal de AX duas células não estimuladas e a reação de fundo quando tratada com várias concentrações de D-E-D-T-C ou catalase, o sinal de A UR diminui de maneira dependente da dose devido à inibição da produção de peróxido de hidrogênio a partir do superóxido intracelular e depleção de peróxido de hidrogênio extracelular, respectivamente. Os tratamentos com D-E-D-T-C e catalase confirmaram explicitamente que os ensaios DHE e UR medem especificamente diferentes tipos e localizações subcelulares de ROS Indicum Após este procedimento.

Outros métodos, como espelhar a geração de Ross durante a infecção por bactérias patogênicas ou não patogênicas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como o garanhão Dictal responderá a diferentes infecções bacterianas em termos de geração de perdas. E não se esqueça de que trabalhar com bactérias patogênicas, como microbactérias marum, pode ser extremamente perigoso e precauções como BSL apropriadas duas medidas devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.