Name: Nanomecânica de interações medicamentosas-alvo e de detecção de resistência antibacteriana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-25T09:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Aprenda a quantificar resistência antibacteriana usando sensores de cantilever para medir interações medicamentosas-alvo. Este método inovador facilita a descoberta de novos agentes antibacterianos com precisão nanométrica.

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Joseph W. Ndieyira foi apoiado pelo Conselho de Engenharia e Ciências Físicas Research (EPRSC), Centro Interdisciplinar de Pesquisa em Nanotecnologia (IRC), a Royal Society (RS) e Biano consultoria (BNC). Agradecemos, Alejandra Donoso Barrera, Dejian Zhou, Manuel Vögtli, Matthew Batchelor, Matthew A. Cooper, Torsten Strunz, Trevor Rayment e Gabriel Aeppli para discussões úteis.

1. Preparação de Cantilevers <ol><li> Usando pinças Teflon imergir número seleccionado de fichas (cada braço de suporte em cantilever medindo 500 mm de comprimento, 100 mm de largura e 0,9 mm de espessura) em uma solução recém-preparada de piranha (na proporção de 1:1 H 2 SO 4 e H 2 O 2), durante 20 min . </li><li> Após cerca de 20 minutos retirar as fichas cantilever de solução piranha e lavá-los abundantemente com água deionizada e transferir imediatamente para uma solução piranha preparada na hora. Repita o passo 1.1 acima, se os chips conter manchas de sujeira Caso contrário, prossiga para a próxima etapa. </li><li> Após uma limpeza cuidadosa em água deionizada, lavar com etanol puro e seco em cantilever sobre os chips numa placa de aquecimento a 75 ° C para remover quaisquer vestígios de água. Inspecioná-los usando um microscópio óptico para confirmar a sua limpeza. </li><li> Transfira as batatas fritas cantilever limpos para uma câmara de evaporação e bombear para baixo, visando a alcançar um vácuopressão de 10 -7 mbar. </li><li> Uma vez que a pressão de vácuo requerida é atingida, revestimento de um dos lados de cada braço de suporte com uma matriz de titânio de 2 nm a primeira actua como uma camada de adesão antes de uma camada adicional de ouro de 20 nm de espessura. Para confirmar a sua espessura, usar monitor de cristal de quartzo colocados diretamente acima da fonte de destino. </li><li> Deixe revestidos chips sensores cantilever ouro na câmara de 1-2 horas para esfriar sob vácuo antes da abertura. </li><li> Transferir as fichas recém evaporada até um recipiente de armazenagem cheio de vácuo com árgon para prevenir qualquer forma de contaminações. </li></ol> 2. Cantilever Chip funcionalização <ol><li> Em primeiro lugar, providenciar micro-tubos capilares em um estágio 2 de funcionalização de acordo com o tamanho do passo do cantilever de 250 um. </li><li> Em seguida, injectar mM soluções etanólicas tiol 2 de moléculas-alvo de superfície, isto é, mucopeptides bacterianas (D-Ala e D-Lac), e um &#39;inert &#39;alcanotiol encerra em trietileno glicol (PEG), conhecidos para resistir biomolecular adsorção. 16 Cada um dos tubos capilares devem conter um sortido moléculas de captura na superfície determinados aleatoriamente para evitar a polarização do utilizador. </li><li> Ainda incubar durante 20 min as consolas na microcapilares enchido com soluções contendo tiol capturando moléculas de superfície. Assegure-se que as soluções das moléculas de captura na superfície estão confinadas para cada sensor cantilever indivíduo para evitar ou minimizar o cruzamento de contaminações. Se este processo é utilizado corretamente, ele deve alterar sistematicamente os recém-preparados ouro cantilevers revestidos em sensores quimicamente ativos formados, permitindo SAMs de alvos mucopeptídeos bactérias a se formar em superfícies revestidas de ouro como receptores. </li></ol> 3. Preparação da solução <ol><li> Dissolver M sais de fosfato de sódio mono-e di-básicos 0,1 em água ultrapura (18,2 mohms · cm resistividade) e mistura do tó produzir um valor de 7,4 pH. </li><li> Adicionar 0,002% do PS80 para as soluções tamponadas para minimizar os efeitos de agregação causadas por interações inespecíficas de moléculas da droga para o vidro. </li><li> Diluir com drogas soluções recentemente tamponado a diferentes concentrações desejadas que permitirão o cálculo de K d. </li><li> Filtrar as soluções da droga preparadas de fresco utilizando filtros de 0,2 ^ m e sonicar durante 5 minutos à temperatura ambiente antes de purgar com árgon. </li><li> Repita o procedimento com a droga no soro tamponado com soro todo. Suavemente vortex durante 15 min, com 5 minutos adicionais para assegurar a solubilidade completa. </li></ol> 4. Superfície de detecção stress <ol><li> Coloque um chip sensor cantilever funcionalizada em uma câmara de célula de fluxo líquido. </li><li> Alinhar o ponto de laser na extremidade livre de cada um dos sensores e confirmar o alinhamento através do aquecimento a câmara de líquido para 1 ° C. Todos os oito de ouro revestidas conjuntos de sensores cantilever devem ser submetidos a compressive dobragem para baixo devido ao efeito de bimetálico causado pelas diferenças nas taxas de expansão de silício e ouro. </li><li> Após aquecimento durante cerca de 10 min, para permitir que as vigas de arrefecer durante mais 10 minutos. </li><li> Calcular a variação da flexão aos sinais de flexão máxima entre os sensores individuais em cantilever e, se o desvio-padrão relativo dos sinais de flexão é ≤ 5%, então, aceitar o alinhamento, como de outro modo desejável repetir o processo. </li><li> Em seguida, medir as freqüências de ressonância de todas as oito vigas para calcular as suas constantes de mola. Se a variação da constante entre cada sensor cantilever num chip de mola é ≤ 1%, então, aceitar o chip como tendo propriedades mecânicas consistentes contrário substituir o sensor de chip de cantilever. </li><li> Ainda, o uso de um sistema de fluidos (Modelo génios Plus) através de uma válvula de seis vias para conseguir a troca de líquido no interior da célula, enquanto o fluxo de aquisição de dados deve ser conseguido usando um modo automatizado LabViewftware. </li><li> Para monitorar o cantilever dobrar de dados, utilizar os seguintes protocolos de medição: i) ou injetar solução tampão ou soro sem droga para medição de controle com duração de 5-30 min para estabelecer uma linha de base; ii) injetar solução droga para 30-60 min; iii) injectar 10 mM de HCl para lavagem de 10-60 min para dissociar complexos fármaco ligado, iv) finalmente injectar um novo passo de lavagem utilizando uma solução tampão para a outra 5-30 min para regenerar os péptidos de superfície e restaurar o sinal de linha de base. Sempre assegurar que todos os sinais são adquiridas sob caudal de líquido constante de 30-180 ul / min e a temperatura fixa de 25 ° C num armário de temperatura controlada. </li><li> Os sinais de dobra absolutos de todos os oito vigas deve ser monitorado usando o tempo de série multiplexados método feixe óptico com um único detector sensível à posição. </li><li> Para analisar os sinais de flexão a partir de cada uma das concentrações da droga, as dobragens diferenciais resultantes são convertidas em um stres diferenciaiss entre os lados superior e inferior do braço de suporte, usando a equação de Stoney. </li></ol>

<ol><li>Ndieyira, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+detection+of+antibiotic-mucopeptide+binding+in+a+model+for+superbug+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical detection of antibiotic-mucopeptide binding in a model for superbug drug resistance.</a> Nat. Nanotech. 3, 691-696 (2008).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse é declarado

Estes resultados demonstram que os sensores de matriz em cantilever tem sensibilidade para detectar e quantificar as alterações em interacções de ligação alvo da droga, especialmente na resistência à vancomicina associada com a eliminação de uma única ligação-H do bolso de ligação da droga. Mostramos a sensibilidade de detecção nanomolar de Van, de acordo com ressonância plasmon de superfície (SPR) estudos anteriores 18,19, e revelam que o método cantilever pode detectar e quantificar diretamente as moléculas da droga no sangue em concentrações clinicamente relevantes, como rotineiramente aplicada na prática clínica. Os nossos dados sugerem que a tensão de superfície diferencial pode ser descrita por uma equação de forma de produto (1), ou seja, (i) um termo químico descrever os acontecimentos de ligação específicos da droga-alvo, e (ii) um termo que descreve a conectividade geométrica mecânica entre reagir quimicamente sites de superfície, o que implica que as interações químicas locais dissociar o mecânico mundialinterações al do cantilever. Enquanto que o termo químico, é dado pela isotérmica de adsorção de Langmuir clássica, o termo geométrica revela um mecanismo percolative das drogas-alvo superficiais induzidas por tensão alterações. O limiar crítico pc ~ 10% (Figura 5) foi necessário para detectar o cantilever flexão diferencial, mostrando que a tensão de superfície é transduzida colectivamente quando uma fracção relativamente grande da superfície é ocupada por moléculas antibióticas. Para p ≥ PC, a ligação mecânica entre os locais de superfície é gradualmente transformada quimicamente estabelecida, e as interacções repulsivas de curto alcance, tais como interacções estéricas entre os nós da rede nanomecânico dá origem a aumento da dobragem para baixo da totalidade da linha suspensa. Especula-se que o nosso modelo de percolação nanomecânico pode desempenhar um papel importante no modo de acção de glicopeptídeos antibióticos em bactérias reais. Estes resultados destacam a alta sensibilidade da tecnologia cantilever para studying modo de atuação dos antibióticos e representam uma nova ferramenta de pesquisa para o estudo de drogas para melhorar a compreensão das operações de antibióticos na escala nano para informar e permitir a descoberta de drogas poderosas para controlar os problemas de infecções superbug. Para preparar o sistema cantilever para medições reprodutíveis e sensível, abordamos um conjunto de metas no protocolo, especialmente para o carregamento da amostra na célula microfluídica e procedimentos operacionais padrão para permitir detecções nanomecânicos quantitativos. Importância da tecnologia cantilever com relação aos métodos existentes Em resumo, destacamos que, embora esta tecnologia foi proposta mais de 25 anos atrás, não encontrou o seu caminho para a clínica devido à falta de medidas cuidadosas e repetitivo sobre medicamente alvos relevantes. Aqui vamos demonstrar os procedimentos que estabelecem a relevância do uso de cantilevers nanomecânicos para investigar o mecânicoai influência de antibióticos sobre os objectivos da parede celular bacteriana e para detectar a resistência antibacteriana. Os métodos convencionais de rastreio de fármacos exigem algum tipo de marcação fluorescente ou radioactiva de uma molécula repórter para medir a ligação de um analito para o seu alvo, muitas vezes em ligação com um ensaio de ligação competitiva ou ensaios de proteína enzimática e 20. A marcação das biomoléculas não só é demorado e caro, mas o rótulo pode também interferir com a interacção molecular por obstruir o local de ligação, levando a falsos negativos. Além disso, os compostos fluorescentes são muitas vezes hidrofóbicas, que podem conduzir a ligação de fundo e falso positivos. Devido a estas limitações, existe um interesse crescente em novos técnicas rótulo livres que permitem que praticamente todo o complexo molecular para ser rastreadas com desenvolvimento mínima do ensaio. As tecnologias de superfície rótulo sem mais estabelecidas no presente são SPR e Microbalance cristal de quartzo (QCM). Em contraste com essa medida SPR thconstante dieléctrica e, de um rótulo - tecnologia cantilever livre detecta a tensão de superfície gerada por uma interacção ligando-receptor, que pode medir directamente as forças nanomecânicos gerados pela ligação de ligandos específicos a receptores da superfície. A singularidade destes sensores é a sua sensibilidade não depende de propriedades dielétricas causados ​​pela variação da massa devido à ligação como na SPR e QCM, mas sim sobre uma mudança induzida por mínimos na tensão de superfície no plano analito, tornando a tecnologia exclusivamente adequado para estudar nanomecânica as moléculas de droga em concentrações antibióticas clinicamente relevantes (3-27 uM) 17. Cantilevers são também particularmente adequados para pequenas moléculas (tais como fragmentos de ADN e os medicamentos) a detecção, sob condições fisiológicas, incluindo ambientes complexos o que é em grande parte com base na indústria farmacêutica e, por conseguinte, irá servir como uma ferramenta complementar na descoberta de drogas. Tecnologia Cantilever foram empregados com sucesso nocampos da genômica 3,5, gás sensoriamento 21, proteômica 22, e as drogas 1. Além disso, cantilevers são fabricados com tecnologia de silício de baixo custo e, devido à sua compatibilidade com os processos de microfabricação, consolas podem ser miniaturizados para melhor sensibilidade e paralelização em grandes conjuntos de sensores para múltiplas drogas composto de triagem e maiores informações ricas rendimento testes de rastreio. Melhorias da instrumentação e projeto experimental vai permitir uma grande variedade de interações a serem analisados ​​em tempo real para ajudar a avançar na busca de uma nova geração de superdrugs para resolver os problemas de infecções resistentes a múltiplas drogas. Etapas críticas dentro do protocolo O desenvolvimento de protocolos de medição robusto é fundamental para as aplicações desta tecnologia. Para conseguir medições quantitativas satisfatórios alvo da droga e para determinar a concentração mais baixa de antibiótico tboné pode ser detectado no sangue, ou tampão de soro foram tratadas, passos críticos dentro do protocolo. A primeira tarefa envolve afinação e otimização de produtos químicos de captura de superfície para melhorar a especificidade de detecção de cantilever e sensibilidade. Inegavelmente, a superfície estresse transdução é um fenômeno coletivo, exigindo uma fração relativamente grande da superfície a ser coberta para estabelecer a conectividade entre as regiões quimicamente reativos. Mostra-se que, variando a densidade de péptidos na superfície de base, um limiar crítico ~ p ≥ 10%, é determinada em que a escala de tensão de superfície em função da densidade de peptídeo e caso contrário, zero (Figura 5). É importante que as experiências foram concebidas para investigar a uniformidade da tensão ao longo das vigas de assegurar desvios máximos de sinal para medições sensíveis. Além disso, os protocolos de regeneração da superfície eficientes precisam estar no lugar, permitindo que múltiplas medições de ciclo e reduzir os custos para cada test. Embora a concepção de um receptor da superfície usando tiolada extremidade hidrofóbica, a orientação da molécula de receptor e um espaçamento entre elas é essencial para permitir a auto-montagem de empacotamento denso devido a interacções de Van-der-Waals entre as moléculas, para minimizar interacções não específicas. Além disso, as moléculas de captura deve conter um polietileno glicol (PEG) do ligador para permitir uma certa parte da matriz de detecção para ser hidrófila para evitar a inserção de moléculas de analito na solução de reagir directamente com a superfície de ouro sem revestimento. As moléculas ligantes de PEG deve agir como espaçadores para reduzir constrangimentos estéricos e, portanto, permitir que os analitos solução de interagir especificamente com os receptores de superfície para induzir mensurável mudança de tensão de superfície. O sensor de matriz cantilever tem de ser testados com pelo menos uma medição de referência no local e o sinal apresentado em tempo real a deformação diferencial, obtida subtraindo o desvio absoluto do cantilever de referência a partir do sEnsing consolas. Assim, um cantilever de referência é essencial para explicar as interações inespecíficos como as mudanças de temperatura, mudanças no índice de refração ou interações na parte de baixo não funcionalizado do cantilever. Optimização do caudal (~ 30-150 ul / min) constitui um passo crítico no âmbito do protocolo, porque garante a troca eficiente de líquidos e um transporte de massa firme suficiente de materiais da solução. O projeto de uma célula líquido deve permitir a optimização do volume (5-80 mL) para as taxas de fluxo rápido para permitir a troca de líquido perfeito para superar as limitações de transporte de massa. A taxa de fluxo é especialmente importante durante a execução de medidas cinéticas 23. Câmaras de grande volume de líquido requer altas taxas de fluxo incontroláveis ​​levando a grandes requisitos de volume de amostra, o que aumenta desnecessariamente o preço do ensaio. Anteriormente, nós usamos o fluxo de gravidade para injetar diferentes amostras para a câmara de líquido medida. Fluxo de gravidade tem a vantagem de que corças não necessita de quaisquer partes mecânicas e, por conseguinte, não introduzir ruído adicional para o sistema. No entanto, sua desvantagem é que ele só funciona de forma confiável em taxas relativamente altas de fluxo (~ 200 mL / min). Obviamente, uma taxa de fluxo mais baixa (≤ 1 ul / min) exigiria volumes limitados de amostra por unidade de tempo mas, por outro lado, faz com que as reacções muito mais lenta e, portanto, requer tempos mais longos de contacto. Além disso, o fluxo de gravidade tem uma grande variação na sua velocidade de fluxo, uma vez que depende da diferença de altura entre a entrada e a saída, que diminui à medida que as soluções de amostra são consumidos durante a experiência. Para evitar problemas de escoamento por gravidade, de uma bomba de seringa deve ser usado. A vantagem do uso de uma bomba de seringa é que permite uma taxa de fluxo constante durante um longo período de tempo, permitindo que os experimentos a ser realizado num ambiente mais controlado. Limitações do protocolo O grande desafio na obtenção de um reprodutível umadetecção biológica específico d usando cantilever sensores consiste em assegurar que as propriedades da camada receptora são bioquimicamente &quot;activa&quot; e uniforme para cada ensaio. O segredo para o sucesso experimental é um pré-tratamento cuidadoso do chip sensor com uma limpeza padronizada e protocolo imobilização com químicos vinculador para orientar as moléculas do receptor em sua conformação ativa. Em nossa configuração atual, funcionalizar matrizes cantilever usando pequenos capilares de vidro, o que pode estar sujeito a alguns inconvenientes e pode ser problemático em alguns casos. Estes capilares de vidro são abertos em ambas as extremidades e, portanto, os solventes da amostra pode evaporar facilmente. Por exemplo, se a temperatura da etapa de funcionalização não é controlada com precisão, a taxa de evaporação pode variar significativamente em diferentes momentos especialmente quando a utilização de solventes voláteis como o etanol. Há também uma possibilidade de uma pequena variação no tempo de incubação a partir de um braço de suporte para outro gendo em consideração que os líquidos de detecção têm que ser carregados consecutivamente para os capilares. O outro factor limitante na funcionalização capilar é a falta de capacidade para assegurar que consolas estão sempre inserido no capilares exactamente da mesma maneira. Além disso, por vezes, as consolas têm de ser puxado um pouco para fora dos capilares, a fim de evitar a contaminação cruzada das amostras de líquidos podem fluir para o corpo da ficha. Nós podemos resolver estes problemas através do emprego de spotters jato de tinta como um procedimento de revestimento de superfície alternativo para consolas casaco. Enquanto que permitiria o controlo exacto do revestimento da amostra, com a possibilidade de dimensionar-se para matrizes de grandes dimensões, o problema mais comum é que as pequenas gotas que são depositadas sobre as vigas pode evaporar-se dentro de segundos e requer um ambiente de humidade controlada. Portanto, o tempo de incubação não podem ser ajustados facilmente, o que pode ser desejável para algumas aplicações. A interação sutil de fatores como amostra volume, o tempo de incubação e taxa de evaporação têm impacto direto sobre a exposição das consolas à amostra funcionalização e cuidados devem ser tomados para garantir a química de superfície otimizadas para ensaios cantilever como qualquer pequena variação na densidade molecular receptor terá um grande efeito sobre o cantilever resposta. Modificações de projeto experimental (ou seja, técnicas alternativas ou materiais) Para superar o grande desafio na obtenção de procedimento de revestimento reprodutível para o desenvolvimento futuro da tecnologia cantilever, diferentes estratégias são necessárias que usaria cantilevers integrados em canais microfluídicos. A ideia é que os chips especiais cantilever deve ser concebido de modo que cada braço de suporte é colocado no seu próprio canal de linha para permitir que nos procedimentos de funcionalização situ onde os canais são endereçadas individualmente. Estas modificações de desenho experimental permitiria processo de revestimento, para ser executared num ambiente controlado e fechado em que a exposição ao solvente é precisamente controlada pelo tempo de incubação e da taxa de fluxo para a imobilização de moléculas de captura automatizada em chips de cantilever. Os mesmos canais poderia então ser utilizado para as experiências de ligação reais onde todas as vigas podem ser expostas à mesma solução de analito. Além do processo de funcionalização cantilever, o mecanismo de leitura cantilever também precisa melhorar. O método de deflexão do feixe óptico é altamente sensível e que tem sido usado com sucesso em tecnologias Atomic Force Microscopy (AFM), durante muitos anos. No entanto, para as aplicações de sensores de cantiléver autoportantes a leitura óptica tem algumas desvantagens, por exemplo, não permitir medições em líquidos opacos, tais como o sangue, o alinhamento de um conjunto de lasers pode ser demorada e fastidiosa e a configuração actual não pode diferenciar entre desvios de inclinação e vertical. Assim, o futuro desenvolvimento da cantilevtecnologia er terá que considerar os aspectos do projeto do sensor geral (por exemplo, geometrias cantilever) ea leitura cantilever para protocolos de medição robustos tanto nas áreas e ambientes de laboratório. Manalis e colegas 22 desenvolveram novos tipos de sensores de cantiléver ocas onde as consolas têm um canal microfluídico incorporado dentro do feixe, permitindo que o dispositivo seja operado de um vácuo, com factores de alta qualidade. Neste modo, actuar como microbalança consolas 22, e, por conseguinte, já não é necessário dispor de uma assimetria entre os dois lados relativamente a funcionalização, assim, as moléculas de captura podem ser ligadas covalentemente ou physisorbed directamente sobre o silício, normalmente utilizando SAM ou silanos 24. As vigas podem também ser modificadas com uma camada fina de polímero, que é, em seguida, conjugada com anticorpos para a detecção 25 bioquímicas. Solução de problemas A pró comumblema relacionado com as medições em cantilever é a introdução de bolhas de ar para dentro da célula de fluxo microfluidico. Deve ser tomado cuidado para assegurar que não há bolhas de ar sejam introduzidas na célula de líquido durante a montagem do chip. Sinal de derivação também é outro problema comum causado pelas diferenças na temperatura das amostras. As vigas devem ser equilibradas para estabilizar antes de medições são realizadas. Todos os tampões, analitos e soluções de regeneração deve ser armazenada na mesma sala, como o instrumento cantilever para permitir que todas as soluções que têm a mesma temperatura. Embora a bomba de seringa pode proporcionar taxas de fluxo muito precisos e extremamente baixo, que é geralmente associada com o ruído mecânico nas medições em cantilever. Por isso, é importante a elaboração de um simples e eficaz redutor de ruído para evitar ruídos desnecessários nos sinais de deflexão. O redutor de ruído consiste em pequeno reservatório de líquido localizado entre a bomba de seringa e a célula de líquido, o qual absorve tele o ruído mecânico da bomba. Por causa da natureza sensível do detector óptico, o sistema de medição de cantilever deve idealmente ser operados em uma configuração fechada para bloquear todas as luzes de rua de interferir com o sistema de leitura óptica. Além disso, a qualidade das camadas de detecção pode diminuir significativamente, se um grande número de passos de lavagem são realizados nas vigas que limitam a vida útil do chip do sensor. Aplicações alternativas ou futuro depois de dominar esta técnica Cantilevers SAM revestidas com terminação em amino ou grupo carboxilo podem ser usados ​​como sensores de pH. Os grupos terminais funcionais protonar ou deprotonado dependendo do pH da solução e pode gerar uma carga de superfície, que leva o braço de suporte de dobrar 24. Dado que os sensores de cantiléver pode controlar as interacções fármaco-alvo associadas com a desestabilização da parede celular de uma bactéria de vida 1,6,7, que, por conseguinte, ajudar noa pesquisa e para o desenvolvimento de uma nova geração de antibióticos para combater infecções resistentes a drogas. Em consolas futuras seriam usados ​​como microbalanças para medir a massa e as taxas de células individuais 26 de crescimento. A tecnologia de cantilever será benéfico para o estudo das respostas celulares a vários factores de crescimento ou drogas. Ele também irá oferecer uma nova ferramenta para a detecção rápida de vários biomarcadores, que tem relevância imediata em aplicações médicas e point-of-care. Dada a versatilidade, tamanho pequeno, e robustez de sensores de cantiléver, eles vão formar um monitor sensível de fatores ambientais nocivos. Eles já demonstraram a sua sensibilidade na detecção de gases tóxicos e nocivos, que podem escapar do laboratório e unidades de produção industrial no meio ambiente, tais como o ácido fluorídrico 27 ou cianeto de hidrogênio 28.

O reconhecimento de paradigma sustenta grandes áreas da biologia molecular e da medicina. Em farmacologia, por exemplo, o objectivo é que interfere com uma via patológica pela chave destinada a um participante de um processo bioquímico, tais como transglycoslyation ou transpeptidação que catalisa a reticulação dos péptidos da parede celular bacteriana. O projeto de drogas é, portanto, reduzida a definição de uma molécula apropriada para atingir um encaixe local bacteriana específica para induzir um ajuste perfeito. Um exemplo clássico emulando o sucesso desta abordagem é a vancomicina (Van), que tem como alvo a parede celular de peptidoglicano, uma característica estrutural conservado de uma bactéria. Em uma bactéria gram-positiva nascente, a matriz consiste peptidoglicano de péptidos de terminação na sequência lisina-D-alanina-D-alanina, preso através de um ligante C55 lipídicas 8-10 aqui denominados D-Ala. Esses peptídeos expostos nos precursores de peptidoglicano são fundamentais para oprotecção mecânica das células bacterianas contra as forças ambientais severas, e mais importante, não são encontrados em células humanas, tornando-os alvos ideais para medicamentos antibióticos. Van liga especificamente a extremidade C-terminal dos péptidos da parede celular bacteriana, formando um moderadamente forte Van-péptido complexo, como mostrado na Figura 1. Esta interacção entre os blocos e Van péptidos expostas as acções de transpeptidases e transglycosylases, que catalisam a reticulação das paredes das células 1, impedindo-os de forma eficaz a partir de reticulação e, por conseguinte, nanomechanically enfraquece a célula bacteriana que conduz à sua morte por ruptura 1,6, 7. O surgimento de enterococo resistente à vancomicina (VRE) é um problema de saúde crescente 11 e porque a resistência bacteriana em enterococos surge devido à mudança súbita de uma amida linkage a uma ligação éster 8, esta mudança estrutural extremamente simples na superfície da bactéria exclui uma única ligação de hidrogénio do local de encaixe Van &#39;s com uma alteração posterior da bolsa de ligao. É importante neste processo altera o pentapéptido de terminal alanina presente em Enterococcus vancomicina susceptível (VSE) a uma lisina-D-alanina-D-lactato 10,12, aqui denominado D-Lac, produzindo uma redução significativa na Van-D-Lac afinidade de ligação pela três ordens de magnitude prestação Van terapeuticamente ineficazes contra infecções enterocócicas 1, o crescimento alarmante de bactérias resistentes aos antibióticos é, portanto, impulsionando o desenvolvimento de abordagens inovadoras para acelerar e restaurar a atividade antibacteriana de agentes antibacterianos ou a descoberta de drogas mais potentes contra bactérias multirresistentes infecções. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Nossos experimentos usando cantilevers free-standing é inspirado nos sistemas, como células que aproveitar a energia química em movimento. A capacidade de os sensores de cantiléver para traduzir a energia química em movimento mecânico torna sondas originais com vantagens consideráveis ​​para controlar perturbações mecânicas dos objectivos da parede celular bacteriana em tempo real. Os sensores de cantiléver require &#39;marcas&#39; no repórter e biomoléculas são detectados rapidamente em uma reação de etapa única. Eles podem rastrear múltiplas drogas em paralelo em ambientes fisiológicos, tais como soluções tamponadas e soro todo. Além disso, a tecnologia utiliza em cantilever referenciamento situ para medições diferenciais que lhes permitam detectar especificamente as interacções fármaco-alvo e, em virtude da sua fabricação por meio de vias de processamento de semicondutor padrão, eles são passíveis de produção em massa e paralelização para o rastreio de alto rendimento de milhares de drogas por hora. Em particular vários conjuntos de sensores cantilever são ferramentas úteis para o estudo da resistência aos antibióticos à vancomicina - porque a resistência à vancomicina é, essencialmente, um problema mecânico 1,6,7. As reacções entre o alvo modelo da parede celular bacteriana e Van na solução pode ser detectada através da monitorização das alterações na tensão induzida clinicamente relevante de interacções de ligação alvo da droga. A tensão gerada a partir de reacções de superfície, que se manifesta em um sinal de flexão do cantilever é analisada visualmente por meio de sensores de iluminação com um feixe de laser. Além disso, adequando o revestimento receptivo de moléculas-alvo de superfície bacterianas em cima do sensor de cantilever, perto de um número não-limitado de analitos (Van), as interações bioquímicas específicas e biomecânica do modelo matriz da parede celular bacteriana é monitorado em tempo real. Além do evento de reconhecimento molecular, existem vários factores que podem causar sensores de cantiléver para deflect, que incluem: - as variações de temperatura, a ligação não específicos ou alterações de índice de refracção da solução. Para ter em conta os sinais não específicos, em medições diferenciais são realizadas in situ, onde a dobragem de ambas as consolas de medição e de referência são monitorados continuamente para analisar interacções específicas. Além disso, a sensibilidade de detecção dos sensores de cantiléver que dependem dos química de superfície e geometria pode ser melhorada por meio do ajuste da densidade superficial de p (em que p é definido como a relação da área da superfície ocupada por moléculas de captura a toda a área de superfície superior do cantilever coberta pela população total de moléculas tal como determinado por fotoelectrão de raios-X de espectroscopia (XPS) 1. Aqui este protocolo detalhes como a vancomicina ou qualquer outro antibiótico ligação a parede celular análogos precursoras bacterianas (mucopeptides) em concentrações clinicamente relevantes na solução tamponada asoro sanguíneo nd pode ser detectada usando cantilever tecnologia sem-marcação. Superfícies de ouro frescas são usadas porque monocamadas auto-organizadas (SAMs) tendem a formar facilmente camadas estáveis ​​em 13,14 limpo ouro. SAM tipicamente consiste de moléculas pequenas com uma porção tiol ligados covalentemente na superfície de ouro, enquanto a unidade de captura desejado, na outra extremidade é deixada livre para interagir com as metas de analitos em solução. Tióis formar um sistema flexível, em particular tendo em conta que muitos compostos tiol com diferentes grupos terminais químicas estão comercialmente disponíveis ou são facilmente sintetizados num laboratório. No entanto, deve ser tomado cuidado para assegurar que as moléculas com uma porção tiol deve ter os grupos finais correctas, por exemplo, numa proteína ou péptido de conjugação, o grupo amino deve estar virada para dentro, para a reacção com o grupo carboxílico do radical tiol amarrado no à tona a ocorrer. Aqui, os tióis foram diretamente conjugado com miméticos tripeptídeo de bactérias lipídico II do bparede celular acterial objectivos sintetizados por metodologia de fase sólida, utilizando comercialmente disponível Wang pré-D-Ala e resinas de Wang-D-Lac eo padrão Fmoc grupo protector de química 15. Embora esta descrição é voltado para vancomicina, claramente ele pode ser estendido a outros antibióticos e de fato mais estudos são convidados por pesquisadores de diferentes áreas particularmente em bioquímica, farmacologia e ciência dos materiais a adotar facilmente este protocolo para seus próprios experimentos.

<table><tbody><tr><td>Scentris</td><td></td><td>Scentris, Veeco Instruments, Inc</td><td>Não está em produção</td></tr><tr><td>Válvula</td><td></td> de seis vias <td>MVP, Hamilton, Reno, NV</td><td>Permite injeção de concentração múltipla</td></tr><tr><td>EB Evaporador</td><td></td><td>BOC Edwards Auto 500, Reino Unido</td><td>O feixe de elétrons é preferível devido à deformação dos cantilevers causada por problemas de aquecimento térmico</td></tr><tr><td>Recipiente</td><td></td> de armazenamento <td>Agar Scientific, Reino Unido</td><td>Mantém os filmes revestidos de ouro frescos</td></tr><tr><td>Vidro</td><td></td> capilar <td>King Precision Glass, Claremont, CA, EUA</td><td>Para funcionalização capilar das matrizes cantilever</td></tr><tr><td>Modelo de bomba</td><td></td><td>Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, EUA</td><td>Bom para taxa de fluxo controlada de amostras líquidas em canais microfluídicos</td></tr><tr><td>0,2-4,5 &mu; m Filtros</td><td>1511940001</td><td>Merck Millipore</td><td>Para filtragem de amostras</td></tr><tr><td>Chips</td><td></td> cantilever <td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td><td>Fosfato</td></tr> de <tr><td>sódio monobásico</td> altamente sensível <td>10049-21-5</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>Para fazer soluções tampão</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>7558-79-4</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>Para fazer soluções tampão</td></tr><tr><td>Polissorbato 80 (PS80) ou Tween 80</td><td>9005-65-6</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>Usado em soluções tampão para prevenir interações inespecíficas em</td></tr><tr><td>água</td><td></td> DI de vidraria <td>Millipore Co., Billerica, MA, EUA</td><td>Usado para fazer soluções Soro</td></tr><tr><td>integral</td><td>GEM-700-110-H</td><td>Sera Laboratories International Ltd, Reino Unido</td><td>Usado em medições que imitam condições fisiológicas</td></tr><tr><td>Vancomicina (Van)</td><td>1404-93-9</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>Medicamento usado</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>7664-93-9</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>Usado para procedimentos de limpeza de vidraria</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>7722-84-1</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>Usado para procedimentos de limpeza de vidraria</td></tr><tr><td>D-Ala e D-Lac</td><td></td><td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td><td>Receptores de superfície revestidos no cantilever para detecção de interações</td></tr> <tr>medicamento-alvo<td>LabView</td><td></td><td>National Instruments Co., Austin, TX, EUA</td><td>Software usado para interface instrumental para permitir medições controladas</td></tr></tbody></table>

nanomecânica de interações medicamentosas-alvo e de detecção de resistência antibacteriana

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

O sensor de cantilever, o qual actua como um transdutor de reacções entre o modelo de matriz da parede celular bacteriana imobilizadas na sua superfície e antibióticos em solução, tem mostrado um considerável potencial em aplicações bioquímicas detecção com sensibilidade e especificidade sem precedentes 1-5. As interacções fármaco-alvo gerar tensão de superfície, fazendo com que o braço de suporte para dobrar, e o sinal pode ser analisado opticamente quando é iluminada por um laser. A mudança na tensão de superfície medidos com precisão nano-escala permite que as interrupções de biomecânica da parede celular bacteriana modelo tem como alvo a ser rastreado em tempo real. Apesar de oferecer vantagens consideráveis, vários conjuntos de sensores cantilever nunca foi aplicado na quantificação de interações de ligação droga-alvo. Aqui, um relatório sobre o uso de silicone várias matrizes cantilever revestido com alcanotiol monocamadas auto-organizadas que imitam bacteriana matriz da parede celular para estu quantitativamentedy interações de ligação de antibióticos. Para compreender o impacto da vancomicina sobre a mecânica de estruturas da parede celular bacteriana 1,6,7. Foi desenvolvido um novo modelo de um braço de suporte, que propõe que a flexão pode ser descrita por dois factores independentes; i), nomeadamente um elemento químico, que é dado por uma isotérmica de adsorção de Langmuir clássica, a partir da qual podemos calcular a constante de dissociação de equilíbrio termodinâmico (K d) e ii) um factor geométrico, essencialmente uma medida da quantidade de péptidos receptores bacterianos são distribuídas na superfície do braço de suporte. A distribuição superficial dos receptores de peptídeos (p) é utilizado para investigar a dependência da geometria e do ligando de carregamento. Mostra-se que um valor de limiar de p ~ 10% não é crítico para aplicações de detecção. Abaixo do qual não é detectado nenhum sinal de flexão enquanto que acima deste valor, o sinal de ruptura aumenta quase linearmente, revelando que o stress é um produto químico de um local de ligação de factor e um fator geométrico combinado pela conectividade mecânica das regiões reagiram e fornece um novo paradigma para a concepção de agentes poderosos para combater infecções superbug.

A mudança de tensão medida com precisão de nano-escala, com uma sensibilidade sem precedentes para um único exclusão H-bond, é explorada para acompanhar os rompimentos do modelo bacterianas biomecânica da parede celular em tempo real (Figuras 2a-d). O limite de sensibilidade para a detecção de drogas de Van foi investigada por diluição seriada suas concentrações em passos de 1,000 uM a 10 nM ≤, revelando 10 nM (~ 15 ng / ml) como a concentração mínima detectável dando origem a uma média de -9 ± ~ 2 nm como os sinais de flexão diferencial (Figura 2c). A capacidade para detectar antibióticos sob ambiente fisiológico, foi investigada no soro numa gama de concentrações clinicamente relevantes de 3-27 fiM 17. Após a injecção de 7 uM Van no soro (soro fetal de vitelo 90% e 10% de tampão fosfato de sódio pH 7,4) em todas as vigas e em condições idênticas, o sinal diferencial paraDAla sérico era 105 ± 4 nm, enquanto que para DLac cantiléveres revestidos, foi observada nenhuma dobra (Figura 3). Os sinais de flexão consideráveis ​​observados para revestido DAla (vancomicina susceptível) consolas são causadas pelas fortes interacções de ligação alvo da droga. No entanto, para revestido DLac (resistentes à vancomicina) cantilevers, a presença de repulsão do estado fundamental do par solitário de oxigênio ea reduzida NH vínculo no vancomicina bolso ligação 10,12 contribui para o enfraquecimento das interações de ligação droga-alvo que resulta em menor ou nenhuma cantilever flexão, particularmente para concentrações de vancomicina inferiores (Figura 3). No entanto, para uma elevada concentração de vancomicina, observamos sinais mensuráveis ​​para DLac flexão. Além disso, nosso projeto experimental é importante para a referenciação situ onde todos cantilevers revestidas com ambos e DAla DLac exposto simultaneamente a mesma substância a analisar, em tempo real. Para entender o papel preciso da química e geometria, foi elaborado um modelo de uma descrevendo a correlação entre as interações solvente e mecânicos de superfície. Isso produz a tensão de superfície: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" /> para p&gt; pc e zero caso contrário (1) O primeiro termo da equação (1) é a isotérmica de adsorção de Langmuir, sendo responsável por eventos de ligação droga-alvo eo segundo termo é a forma de lei de potência que descreve as conseqüências mecânicas de grande escala de formação de rede estressado. A constante corresponde a uma tensão máxima de superfície, quando todos os sítios de ligação estão ocupados acessíveis e K, d é a superfície de equilíbrio de dissociação contrasTant no cantilever. A análise, conforme mostrado na Figura 4 é o resultado do ajuste global de equação (1), sobreposto sobre os sinais de tensão diferencial medida que revelem, a ~ 29,7 ± 1,0 ou 14,1 ± 3,0 mN / m e K ~ d 1,0 ± 0,3 800 ± 310 ou iM para D-Ala ou DLac péptidos, em que A corresponde a uma medida da tensão de superfície, quando todos os sítios de ligação estão ocupados acessíveis. A maior sensibilidade do braço de suporte foi afinado por densidades variando sistematicamente o péptido p, enquanto os dados de controlo de esforço em função do p, enquanto as concentrações de antibióticos fixada em 10, 100 e 250 uM, respectivamente (Figura 5). O processo foi repetido com o stress como uma função das concentrações de Van enquanto as densidades de péptidos fixado em p ~ 100%. &lt;img alt = &quot;Figura 1&quot; fo: content-width = src &quot;5 polegadas&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Detecção de antibióticos cantilever superfície interacções de ligação. a) Representação esquemática de uma matriz de sensores cantilever e o modo pelo qual as interacções fármaco-alvo são detectados nanomechanically. b) interacção de ligação química entre uma molécula de fármaco (Van) e o análogo mucopeptídeos bacteriana (D-Ala ou D-Lac). c) O mecanismo pelo qual a mutação bactérias sensíveis à vancomicina (VSE) adquire resistência à vancomicina pela exclusão de um H-bond único no bolso vinculativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" /&gt; Figura 2. Seguir os rompimentos do modelo bacterianas biomecânica da parede celular em tempo real. a) Os sinais de flexão absolutos de D-Ala, D-Lac e PEG cantiléveres revestidas em tampão fosfato de vancomicina e 250 uM. Os sinais de referência de PEG diferenciais são mostrados em linhas pretas. B) sinais de flexão diferenciais de D-Ala e D-Lac cantiléveres revestidas em tampão fosfato 250 mM e vancomicina. C) O braço de suporte de deflexão diferencial de um sinal dependente da dose, como uma função de tempo na presença de concentrações de vancomicina na ordem de 10 nM (linha amarela), 100 nM (linha vermelha) e 1000 nM (linha vermelho escuro), respectivamente. d) Os sinais de deflexão em cantilever diferenciais para as três D-Ala sensores de cantiléver revestidos como um função do tempo, na presença de 10vancomicina nM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" /> Figura 3. Rastreamento das interrupções do modelo bacterianas biomecânica da parede celular em tempo real para um D-Ala e D-Lac cantilevers revestidos na presença de 7 mM vancomicina em soro fetal bovino. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" /> Figura 4. Investigando os nanomecânica de interações droga-alvo. Plot mostrando a resposta ao estresse superfície diferencial medida para D-Ala (círculos pretos) e D-Lac (círculos vermelhos) cantilevers revestidos em função da vancomicinaconcentração em solução [Van]. Os dados são descritos pela equação (1) (linhas sólidas) 1. <img alt="Figura 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" /> Figura 5. Optimização da sensibilidade de detecção de nanomecânico de interacções receptor-ligando por investigar a dependência da carga e da geometria do receptor através de monocamadas mistas. De medição de tensão de superfície respostas diferenciais de sensores de cantiléver como uma função de D-Ala cobertura de superfície, p, na presença de concentrações fixas de vancomicina solução a 10 mM (linha preta), 100 mm (linha vermelha) e 250 mM (linha verde).

Resistência adquirida aos antibióticos é um grande problema de saúde pública e é atualmente classificada pela OMS como uma das maiores ameaças à vida humana. Aqui descrevemos o uso da tecnologia do cantilever para quantificar a resistência antibacteriana, fundamental para a descoberta de novos agentes e poderosa contra bactérias resistentes a múltiplas drogas.

Nanomecânica de interações medicamentosas-alvo e de detecção de resistência antibacteriana

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

O objetivo geral deste procedimento é medir as alterações nas propriedades mecânicas de alvos bacterianos modelo subjacentes causadas por interações de ligação ao alvo do fármaco, e quantificar a resistência antibacteriana. Isso é realizado primeiramente depositando 20 nanômetros de filme de ouro em um lado do arranjo de sensores em balanço pré-limpo. O segundo passo é auto-organizar alvos superficiais apropriados, imitando fenótipos bacterianos sensíveis e resistentes a fármacos em seis dos sensores em balanço, enquanto os dois sensores em balanço restantes são organizados com alvos modelo bacterianos irrelevantes para atuar como controles de medição.Em seguida, os arranjos de sensores em forma de canteiro são carregados em uma câmara de fluxo líquido. O passo final é preparar soluções de fármacos em faixas de concentração clinicamente relevantes e injetar sequencialmente cada concentração de fármaco sobre os arranjos de sensores em forma de canteiro. Em última instância, luz laser focalizada nas extremidades livres do arranjo de sensores em forma de canteiro é utilizada para demonstrar as deflexões do canteiro causadas pelas alterações na tensão superficial decorrentes das interações de ligação entre o fármaco e seu alvo.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como ressonância de plásmons de superfície e microbalança de cristal de quartzo, é que ela detecta diretamente a tensão superficial gerada por interações de ligação entre fármacos e seus alvos, medindo forças anomecânicas específicas causadas por cada ligação do fármaco aos alvos na superfície. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da farmacologia, como a velocidade, eficiência e precisão da dosagem. Geralmente, indivíduos novos neste assunto enfrentarão dificuldades devido ao alinhamento tedioso das amostras.No entanto, recentemente inovamos um novo mecanismo de leitura, que não exige o alinhamento inicial da amostra, e no futuro o uso deste método será muito mais fácil e amigável para o usuário. Para começar, utilize um par de pinças de teflon para imergir um chip de cantiléver em uma solução de parama recém-preparada durante 20 minutos. Os cantiléveres utilizados neste experimento têm 500 micrômetros de comprimento, 100 micrômetros de largura e 0,9 micrômetros de espessura.Após 20 minutos, remova o cantiléver e enxágue-o completamente com água desionizada. Inspecione o chip limpo usando um microscópio óptico para procurar impurezas. Coloque os chips com qualquer resíduo de poeira ou sujeira restante em solução de piranha fresca por mais 20 minutos.Após uma limpeza completa em água desionizada, enxágue o chip em etanol puro e seque-o em uma placa aquecedora a 75 graus Celsius por cerca de 30 segundos para remover quaisquer vestígios de água. Em seguida, inspecione-o novamente usando um microscópio óptico para confirmar sua limpeza. Transfira o chip do cantiléver limpo para uma câmara de evaporação carregada com fontes de titânio e ouro.Bombeie até que uma pressão de vácuo de um vezes 10 à potência de menos sete milibar seja alcançada. Uma vez atingido o vácuo necessário, recubra um lado de cada arranjo de ponteiras com uma camada de titânio com espessura de dois nanômetros. Em seguida, configure o sistema para depositar uma camada de ouro com espessura de 20 nanômetros sobre o titânio, que atua como camada de adesão.Confirme a espessura de cada camada com um monitor de cristal de quartzo colocado diretamente acima da fonte alvo. Após atingir a espessura correta, deixe as pastilhas de cantiléver revestidas com ouro na câmara por uma a duas horas para esfriar sob vácuo antes de abrir a câmara. Em seguida, transfira o chip sensor de cantiléver para um recipiente de armazenamento a vácuo preenchido com Argonne para evitar qualquer forma de contaminação.Os chips de cantiléver podem ser armazenados aqui indefinidamente. No entanto, se não houver recipiente de armazenamento disponível, o chip deve ser usado imediatamente pouco antes do experimento. Organize os tubos capilares microscópicos em canais sobre uma plataforma de funcionalização de acordo com o espaçamento de cantiléver de 250 micrômetros.Em seguida, alinhe-os usando uma lâmina de vidro e prenda-os com uma braçadeira para impedir que se movam durante o experimento. Em seguida, prepare soluções de dois milimolares de receptores de superfície folados, obtidos a partir de alvos da parede celular bacteriana sensíveis e resistentes a fármacos, utilizando etanol puro. Depois, coloque um cantiléver separado em cada um dos tubos capilares microscópicos.Certifique-se de que as soluções das moléculas de captura da superfície estejam confinadas a cada sensor em balanço individual para evitar contaminação. Em seguida, atribua aleatoriamente uma mistura dessas moléculas de captura da superfície aos tubos capilares microscópicos e, depois, injete oito microlitros das soluções alvo da superfície nos tubos designados. Deixe os balanços incubarem nas soluções por 20 minutos.Neste período, as alavancas recém-preparadas revestidas com ouro se tornarão sensores quimicamente ativos por meio da auto-organização de peptídeos muco bacterianos em monocamadas sobre suas superfícies revestidas com ouro. Comece dissolvendo sais de fosfato de sódio mono e dibásico 0,1 molar em água ultrapura e misture para obter um valor de pH de 7,4, utilizando filtros de 0,2 mícrons para filtrar a solução. Em seguida, adicione 0,002% de polissorbato 80 à solução tamponada.Isso minimizará os efeitos de agregação causados por interações não específicas das moléculas do fármaco com o vidro. Em seguida, dilua a vancomicina e a orin com soluções recém-tampadas até a concentração desejada de 100 pico molar a 250 micromolar, o que permitirá o cálculo de KD. Vortexe e sonique as amostras para garantir a dissolução completa do fármaco no tampão e no soro, a fim de determinar se a ação do fármaco é modificada por proteínas séricas. Repita este procedimento com as mesmas concentrações do fármaco, mas desta vez adicione-as ao soro integral.Também vorte as amostras de soro por um total de 20 minutos durante a mistura para garantir a solubilidade completa das drogas. Por fim, purgue as soluções com Argônio para iniciar a detecção da tensão superficial nas micropresas. Primeiro, carregue os oito sensores de micropresas funcionalizadas no chip em uma câmara de fluxo líquido.Em seguida, alinhe o ponto do laser na extremidade livre de cada sensor. Confirme o alinhamento aquecendo a câmara líquida em um grau Celsius. Todos os oito arranjos de sensores em balanço revestidos com ouro sofrerão flexão compressiva para baixo devido ao efeito bimetálico causado pelas diferenças nas taxas de expansão do silício e do ouro.Após aquecer por aproximadamente 10 minutos, calcule a variação de flexão nos sinais máximos de flexão entre os sensores de cantiléver individuais. Se o desvio padrão relativo dos sinais for menor ou igual a 5%, aceite o alinhamento como desejável. Caso contrário, repita o processo após o alinhamento.Deixe as alavancas esfriarem até a temperatura ambiente por 10 minutos para garantir a equilibração. Em seguida, meça as frequências ressonantes das oito alavancas e calcule suas constantes elásticas. Se a variação da constante elástica entre cada sensor de alavanca for menor ou igual a 1%, aceite a calibração.Caso contrário, substitua o sistema fluidico conectivo do sensor de chip de cantiléver, como a bomba de seringa mostrada aqui, ao chip apropriado por meio de uma válvula de seis vias. Ajuste a taxa de fluxo do sistema para funcionar a uma taxa constante entre 30 e 180 microlitros por minuto e monte todo o sistema em um gabinete com controle de temperatura a 25 graus Celsius. Em seguida, inicie a injeção de tampão ou soro sozinho, sem fármaco, para obter uma medição de linha de base de controle com duração entre cinco e 30 minutos.Inicie o software de visualização automatizada do laboratório para adquirir simultaneamente os dados de deflexão de cada uma das alavancas. Monitore os sinais absolutos de flexão de todas as oito alavancas utilizando um método óptico de feixe multiplexado no tempo em série com um único detector sensível à posição. Após a aquisição da linha de base, injete uma solução do fármaco por 30 a 60 minutos, seguindo a amostra de teste.Uma lavagem com HCl 10 milimolar é injetada por 10 minutos a uma hora para dissociar quaisquer complexos de fármaco ligados. Utilizando este sistema, é possível obter precisão em escala nanométrica e sensibilidade sem precedentes à exclusão de uma única ligação de hidrogênio. A alteração na extremidade de uma cadeia peptídica de D alanina para D lactato resulta em uma redução significativa da ligação da vancomicina, tornando bactérias com a sequência DLAC resistentes a esta terapia. Quando concentrações variadas do fármaco foram testadas na cadeia peptídica terminada em D alanina, demonstrou-se que a vancomicina possui um efeito dependente da dose, sendo cerca de 10 nanomolar a menor concentração detectável.A capacidade deste sistema de detectar antibióticos em um ambiente fisiológico foi investigada adicionalmente em soro, numa concentração clinicamente relevante de sete micromolar. Embora as microvaretas revestidas com D-alanina ainda tenham apresentado uma curvatura considerável nessas condições, as revestidas com DLAC não apresentaram. Utilizando pontos de dados de múltiplas concentrações do fármaco, é possível criar modelos que descrevam os eventos de ligação entre o fármaco e seu alvo.As linhas de ajuste mostradas aqui combinam a absorção do langur, a isoterma e um termo para descrever as consequências mecânicas em larga escala da formação de redes sob estresse. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em minutos para confirmar a eficiência e a precisão da dosagem de medicamentos, bem como qualquer sinal de resistência bacteriana, se realizada corretamente.

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JoVE Journal

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