Extração de proteínas e 2-D métodos Eletroforese em Gel de

O objetivo geral deste procedimento é gerar um mapa bidimensional do proteoma bacteriano. Isso é realizado primeiramente cultivando uma cultura bacteriana e coletando as proteínas. Em seguida, as proteínas coletadas são separadas em uma única dimensão de acordo com seu pH.

Por meio da focalização isoelétrica após a separação na primeira dimensão, as proteínas são separadas adicionalmente na segunda dimensão de acordo com seu peso molecular. Por fim, o gel da segunda dimensão é corado e as proteínas são visualizadas. Em última instância, podem-se obter resultados que mostram diferenças na expressão proteica por meio da eletroforese bidimensional.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da patogênese bacteriana, como quais proteínas são produzidas sob certas condições e como diferentes isolados bacterianos diferem na produção de proteínas. Essas informações podem auxiliar na identificação de proteínas candidatas que possam estar envolvidas na virulência. Após cultivar 100 mililitros de uma cultura bacteriana de leite frio até a fase estacionária, transfira 35 mililitros para um tubo de centrífuga e centrifugue a 4.500 ×g e quatro graus Celsius por 20 minutos.

Resuspenda o pellet em 35 mililitros de PBS frio e repita a centrifugação. Após ressuspende o pellet em um mililitro de PBS frio, transfira a solução para um microtubo estéril de dois mililitros e centrifugue novamente. Repita a lavagem com um mililitro de PBS frio antes de centrifugar a quatro graus Celsius e 14.000 Gs por um minuto. Descarte o sobrenadante e adicione um mililitro de solução P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F. Transfira o pellet dissolvido para um tubo com tampa de rosca de dois mililitros contendo cerca de 0,5 mililitros de esferas de vidro previamente esterilizadas.

Em seguida, na câmara fria, para romper as células, utilize um mini homogeneizador de esferas três vezes, por um minuto cada, colocando a amostra em gelo após cada ciclo e centrifugando por um minuto antes de transferir o sobrenadante para um tubo estéril de poliestireno de cinco mililitros. Para aumentar o rendimento, repita a homogeneização duas vezes com uma alíquota adicional de P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F. Recolha as amostras.

Em seguida, após quantificar a proteína, armazene alíquotas de 200 microgramas a menos 80 graus Celsius até o momento de uso para realizar a primeira dimensão. A focalização isoelétrica ou IEF começa utilizando solução de limpeza para fitas a fim de limpar os suportes para fitas. Em seguida, enxágue as fitas com água milli Q.

Em seguida, deixe-os de cabeça para baixo para secar; após a secagem, atribua cada amostra a um número de suporte para fitas de gel. Carregue uma amostra de proteína previamente preparada de 200 microgramas no poço lateral do suporte e use a pipeta para distribuir a amostra ao longo do suporte, utilizando pinças limpas. Retire as fitas de gel da embalagem.

Em seguida, remova a camada protetora das tiras de gel antes de posicioná-las com o lado áspero voltado para baixo, em movimento lento e deslizante, para umedecer as tiras desde a extremidade negativa até a extremidade positiva. Para prevenir a queima, coloque papel de blotting umedecido com água esterilizada sobre o eletrodo e sob as tiras de gel. Remova bolhas de ar e recubra com uma fina camada de óleo mineral para evitar ressecamento.

Alinhe os suportes das tiras de gelo na máquina de IEF. Execute as amostras usando o programa listado aqui. Os géis podem ser removidos a qualquer momento durante o último passo.

Quando o programa estiver concluído, remova as tiras dos suportes e, a menos que sejam usadas imediatamente, cubra-as com filme plástico e armazene-as a menos 80 graus Celsius até o momento de realizar a eletroforese SDS-PAGE em segunda dimensão. Após montar o equipamento de moldagem de gel para SDS-PAGE, prepare a solução do gel em um frasco com ponta de vácuo e barra de agitação, adicionando tampão Tris 1,5 molar e mistura de água MCU, e desgaseifique a solução em velocidade moderada com o vácuo por 20 minutos. Quando o vácuo terminar, adicione 10% de SDS à solução do gel pipetando pelas laterais do frasco. Para evitar a introdução de bolhas, adicione então persulfato de amônio e TEMED recém-preparados e agite.

Despeje o gel e deixe endurecer, depois dissolva DTT na solução de equilíbrio previamente preparada. Retire as fitas do armazenamento a menos 80 graus Celsius, desenrole-as e posicione as fitas IPG com o lado do gel voltado para baixo no tampão, incubando por 30 minutos. Em seguida, adicione 4,5 litros de tampão de eletroforese ao tanque de corrida.

Em seguida, utilizando pinças, remova as tiras da solução de equilíbrio e use um papel toalha para drenar o tampão em excesso. Desmonte o equipamento de moldagem do gel e lave as placas de vidro com água morna. Após substituir a água na parte superior do gel pelo tampão de corrida, use pinças limpas para posicionar uma tira sobre a placa longa, com o lado do gel voltado para você.

Lubrifique a tira com um x de tampão e use uma tira de plástico para deslizar a tira IPG mais para baixo, encostando-a ao gel, removendo todas as bolhas de ar entre a tira e o gel. Adicione solução selante de agarro ao topo da tira para fixá-la no lugar. Em seguida, após repetir o processo para todas as tiras, abaixe-a no tanque de eletroforese.

Após garantir que o nível do tampão 1x na câmara externa esteja no nível designado, fixe a câmara superior. Coloque o suporte da câmara de tampão superior sobre as placas de vidro e pressione para baixo. Adicione o tampão de corrida 2x na câmara superior até a linha média.

Em seguida, adicione o tampão de eletroforese 1x à câmara externa até atingir a linha superior. Coloque a tampa e ligue a unidade de eletroforese e a fonte de alimentação. Execute as amostras durante a noite a 52 volts, 96 miliampères e cinco watts.

Execute os géis até que as linhas líderes estejam a um centímetro do fundo. Após o tempo de corrida, remova as placas do suporte. Assim que os géis forem retirados das placas de vidro, fixe-os na solução um por pelo menos uma hora ou durante a noite a quatro graus Celsius.

Em seguida, transfira os géis para a solução de fixação dois e agite durante uma hora. Lave os géis em água Milli Q quatro vezes, por 15 minutos cada. Depois, use a solução de nitrato de prata para corar os géis por 30 minutos ou até 48 horas.

Após lavar os géis por um minuto em água Milli Q, transfira-os para a solução reveladora até que o gel fique corado. Após cerca de cinco a 30 minutos, para interromper a reação, transfira os géis para a solução de parada por 10 minutos. É mostrado aqui um gel corado com Kumasi Blues de extratos proteicos de células inteiras de Ol dia multivorans.

Isolados clínicos cultivados em caldo LB ou caldo de manitol com levedura e colhidos na fase estacionária. A análise comparativa dos perfis proteicos extraídos das mesmas culturas bacterianas em duas ocasiões diferentes mostrou padrões de bandas semelhantes, indicando extrações proteicas bem-sucedidas. Nesta figura, a análise por eletroforese em gel bidimensional de 200 microgramas de proteína total de Bural dio, pseudo mostra uma abundância de mais de 500 pontos que podem ser individualmente identificados por espectrometria de massas.

Após este procedimento, outros métodos, como citometria, podem ser realizados para determinar diferenças quantitativas e qualitativas entre isolados bacterianos estreitamente relacionados. Além disso, com uma modificação no método de coloração, os pesquisadores podem determinar a identidade de manchas proteicas mediante a excisão de manchas e espectrometria de massas.