Name: Extração de proteínas e 2-D métodos Eletroforese em Gel de Burkholderia Espécies (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprenda extração de proteínas e eletroforese 2-D para análise proteômica de patógenos Burkholderia. Este método permite mapear o proteoma bacteriano e identificar diferenças na expressão proteica.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de estudo da Universidade de British Columbia (a BV) e doações de Fibrose Cística Canadá e Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (DPS) para. Agradecemos Jacqueline Chung para a preparação inicial dos protocolos.

1. Crescimento Cultura (dias 1 +2) <ol><li> Crescer uma cultura de partida: 3 ml de Luria Bertani (LB) caldo numa ml tubo de pressão top 15, a 37 ° C durante a noite rotador. Dilui-se o crescimento durante a noite a uma DO600 de 0,6. Adicionar 1 ml desta diluição para 100 ml de caldo LB num balão Erlenmeyer de 250 mL. Incubar a 37 ° C com agitação a 250 rpm durante 16 horas em fase estacionária (SP), a melhor aproximada, em cultura descontínua, condições de infecção e para assegurar que os factores de virulência bacteriana sob o controlo de factores de sinal de fase estacionária, tais como centros de investigação e de quorum detecção, são expressos. Alternativamente, as bactérias cresceram em SP cedo ou fase semi-logarítmica tardia ou pode ser usada para obter informação sobre a fase de adaptação bacteriana. </li><li> Depois de 16 horas a medir DO600 e assegurar a cultura atingiu SP por comparação com uma curva de crescimento previamente construído sob condições idênticas. </li></ol> 2. Extração de proteínas (dia 3) <ol><li&gt; Relaxe todos os meios de comunicação e soluções de antemão, a geladeira durante a noite. Todos os passos devem ser realizados com os tubos em um balde de gelo. Prechill uma microcentrífuga e uma centrifugadora Beckman Coulter Alto Desempenho (ou equivalente) a 4 ° C e o rotor interno (rotor JA-20 =, centrífuga = J2-HS). </li><li> Preparar a solução (PMSF, 174,19 g / mol) em acetona pela dissolução de 0,0174 g de PMSF (PMSF &#39;CUIDADO&#39; é tóxico e corrosivo, o uso de rosto escudos e luvas) em 1 ml de acetona (acetona &#39;CUIDADO&#39; é fresco 0,1 M de fluoreto fenilmetanossulfonilo tóxico e inflamável, usar escudos face e luvas). </li><li> Adicione-se uma solução de PBS / EDTA / PMSF: 0,1 ml de 0,1 M de PMSF, 0,1 ml de 0,5 M de EDTA, e 9,8 ml de PBS. Verifique o OD da cultura hr 16 é de aproximadamente onde deve estar em SP. </li><li> Tomar 35 ml da cultura bacteriana e transferência para um tubo de centrífuga de Oakridge e centrifugar a cultura a 4.500 x g durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante para um recipiente de resíduos eadição de 35 ml de PBS arrefecido e ressuspender o pellet. Centrifugar novamente a 4500 × g durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de PBS frio. Transferir para estéril 2 ml de Eppendorf e centrifuga-se 1 min a alta na microcentrífuga a 14000 × g a 4 ° C. Retire e elimine o sobrenadante. </li><li> Adicione 1 ml de solução de PBS / EDTA / PMSF, ressuspender o sedimento e transferir para um tubo de 2 ml parafuso da tampa (com o-ring) contendo 0,5 ml ~ contas de vidro (esterilizado). Adicionar o pelete re-suspenso para o tubo contendo as esferas de vidro e talão bater-lhes a 4 ° C durante 1 min na sala fria. Faça isso 3x, colocando a amostra em gelo após cada bash. </li><li> Centrifugar a 14000 xg durante 1 min na microcentrífuga. Remover o sobrenadante e colocá-lo em um tubo de poliestireno 5 ml estéril. </li><li> Para aumentar o rendimento adicionar 1 ml de PBS / EDTA / PMSF ao mesmo tubo contêm grânulos de vidro novo. Grânulo bater o tubo a 4 ° C durante 1 min. Faça isso 2x colocando a amostra em gelo affesta de ter. Centrifugar a 14.000 x g durante um minuto sobre a centrífuga e remover o sobrenadante e adicionar ao sobrenadante a partir do passo 2.8. Usando uma seringa de 1 ml e um filtro de 0,20 mM do sobrenadante a partir do tubo de poliestireno estéril, para um novo tubo de Eppendorf de 2 ml. </li><li> Neste ponto, as amostras devem ser ensaiadas para a quantidade de proteína, utilizando o kit de extracção de proteínas Pierce MicroBCA e aliquotas de 200 mg devem ser congeladas a -80 ° C até ser necessário. </li></ol> 3. Preparação de Amostras (dia 4) <ol><li> Prepare 25 ml de solução stock de reidratação (8 M uréia, 2% CHAPS, 2% IPG Buffer, 0,002% de azul de bromofenol) e armazenar em 2,5 mL alíquotas a -20 ° C. Adicionar 7 mg de ditiotreitol (DTT, 154,2 g / mol), imediatamente antes da utilização a uma alíquota de 2,5 ml da solução de re-hidratação. </li><li> Processo descongelado amostras do passo 2.10 usando um 2-D Clean up kit com ressuspensão final em 450 ml de solução estoque de reidratação preparados no passo 3.1. </li></ol> 4. PrimeiroDimensão Isoelectric focagem (IEF) (Dia 4) Todas as etapas desta seção estão usando o IEF Sistema Ettan IGPhor. <ol><li> Configure as primeiras tiras IPG dimensão: os titulares de strip limpos com solução de limpeza tira e depois lave com água Milli-Q, deixar de cabeça para baixo para secar. Atribua a cada amostra para um número compartimento de gel. </li><li> Coloque a amostra a partir da etapa de reidratação na segunda área mais ampla do - end (). Use uma pinça limpa para puxar tiras de gel de embalagens. Retire camada protetora a partir de tiras de gel. Linha tiras lado áspero para baixo em um movimento lento, deslizando para conseguir as tiras molhadas ao longo do caminho de (-) ao final (+) final. </li><li> Coloque papel absorvente úmido com água esterilizada em cima do eletrodo e sob as tiras de gel para evitar o cansaço. Enxágüe pinças em-entre os rounds com água purificada e etanol. Remova todas as bolhas, sobrepor levemente com óleo mineral para evitar saídas secos. Alinhe os detentores tira de gel na máquina. </li><li> Executar 12 horas a 20 ° C durante rehydração, 1 hora a 200 V, 1 hora a 500 V, 1 hora a 1000 V, 0,5 horas a 4000 V, 12 horas a 8000 V, 24 hr espera a 300 V, e pode ser retirado no momento. </li><li> Após IEF é terminado, é recomendável realizar a electroforese de segunda dimensão em gel de SDS-poliacrilamida, a menos que a tira de IPG são congeladas a -80 ° C em Saran Wrap revestida com óleo mineral para análise futura. Alternativamente, a fim de evitar a formação de estrias ponto, devido ao acesso de DTT é possível incluir um segundo passo de equilibração do IPG tiras antes da segunda dimensão com um tampão que contém a iodoacetamida. </li></ol> 5. Segunda-dimensão SDS-poliacrilamida Eletroforese em Gel (dia 5) Todas as etapas desta seção estão utilizando o aparelho de eletroforese Ettan DALTsix. <ol><li> Para montar o aparelho de rodízio gel, limpar completamente todos os componentes e garantir que rodízio gel é o nível ea ligação de borracha cinza é lubrificado com gel de silicone. Coloque o busílis pretober rolha triangular na parte inferior. Em seguida, coloca alternadamente o separador e as placas de vidro com a placa de vidro mais curtos para a frente. Certifique-se que os separadores são na parte de trás e da frente. Preencha o espaço restante com as cargas (cerca de 5 folhas) de modo que o topo é plano. Coloque o painel frontal com a ponta vermelha do lado de fora. Use grampos para apertar cada lado e apertar os parafusos inferiores. </li><li> Preparar o gel: Adicionar 297,3 ml de Duracryl, (&#39;CUIDADO&#39; Duracryl é usar tóxico rosto escudos e luvas), 147 ml de tampão Tris 1,5 M pH 8,8, e 143,3 ml de água Milli-Q para um balão com ponta de vácuo contendo um barra de agitação. Coloque a tampa em cima e misturar a solução a uma velocidade moderada, com o vácuo por 20 minutos. O vácuo é utilizada para de-gás da solução. Fazer uma nova 10% de solução de persulfato de amónio (APS, 218,8 g / mol): 0,2 g de APS a 2 ml de água Milli-Q. </li><li> Adicionando-se a mistura de gel para o rodízio de gel: Quando o vácuo é realizado adicionar 6 mL de 10% de dodecilsulfato de sódio (SDS, 228,38 g / mol)para a parede lateral do balão para evitar colocar mais bolhas na solução. Adicionar APS, mexa, adicione 0,25 mL de N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiletilenodiamina (TEMED, 116,20 g / mol) (&#39; CUIDADO &#39;Temed é usar inflamável rosto escudos e luvas) e agitar. </li><li> Despeje a mistura em gel de rodízio em gel através de um funil inserido na parte traseira do aparelho. Deitar-se a um centímetro abaixo da placa curta. Adicionar 1,5 mL de butanol saturado com água para a parte superior do gel e embrulhar topo com saran wrap para evitar a desidratação. Aguarde 1 hora para garantir a polimerização completa. </li><li> Verificando o gel: Quando o gel é feito (verifique o frasco), desmontar o rodízio gel por uma pia. Verifique se há integridade gel enquanto enxaguar as placas de vidro com água morna, não deixe a água entrar no prato. Despeje a butanol e lavar a parte superior do gel duas vezes com água para se livrar de butanol. Preencha o topo com água e deixe descansar novamente se os géis não são utilizados de imediato. </li><li> Preparação das tiras: Preparar a solução tampão de equilíbrio docongelador (6 M ureia, 75 mM Tris-HCl pH 8,8, 29,9% de SDS, 0,002% de azul de bromofenol). Isto pode ser previamente preparada e armazenada em alíquotas de 10 ml a -20 ° C. Dissolve-se 0,1 g de DTT a 10 ml de uma solução tampão de equilíbrio. Um tubo pode ser utilizado para duas tiras de IPG. Colocar os géis de face para baixo sobre a tira de tampão e deixar repousar durante 30 minutos. Lembre-se que final é qual. </li><li> Preparação da unidade de electroforese (aparelho de separação de 2-D): Adicionar 4,5 L de 1x tampão de electroforese (25 mM Tris Base de Dados [121,1 g / mol], de glicina 192 mM de [288,38 g / mol], e 0,1% w / v de SDS [288,38 g / mol]) para o tanque de funcionamento. Este tampão pode ser utilizada para um máximo de 3x. Vire a unidade de eletroforese em. Verifique o nível de água na máquina de refrigeração de água e encha-o com água, se ele é baixo. Ligue a máquina, o modo de imprensa para verificar a temperatura designado, que deve ser de 10 ° C. </li><li> Adicione 1 L de tampão de corrida e 2x 1 L de 1x de tampão de corrida e armazená-los, a 4 ° C. Certifique-selagem agarose solução: peso de 0,25 g de agarose dissolve-se em 50 ml de tampão 1x execução. Pulso por 15 segundos cada. </li><li> Configurando a unidade de Eletroforese: Use uma pinça para tirar cada faixa e remover o excesso de tampão em ambos os lados com papel toalha limpa. NÃO toque nas tiras. Deitar fora a água no topo do gel e alinhar o início de gel com tampão 1x execução. Use uma pinça limpa e coloque as tiras em cima da placa longa, com o lado do gel de frente para você. Adicionar tampão 1x às tiras para lubrificar. Tiras de slides ainda mais para baixo, usando tiras de plástico. Remova todas as bolhas entre a tira eo gel. </li><li> Adicionar solução de selagem de agarose para o topo da tira para selar. Repetir para o resto das tiras. Colocar as placas de vidro e contendo os géis em gel de berço inferior e no tanque de gel. Verifique se o nível de 1x tampão na câmara exterior é na linha de fundo designado antes de colocar a câmara superior diante. </li><li> Coloque a moldura para câmara de amortecimento superior em cima das placas de vidro e garantir que ele é tudo o way para baixo, pressionando a parte inferior para baixo. Utilizando um funil e adicionar o tampão de corrida 2x dentro da câmara superior para a linha do meio. Utilizando um funil e adicionar tampão de corrida 1x a câmara exterior, até atingir a linha de cima. Coloque a tampa em cima e ligar a unidade Eletroforese eo bloco de poder. </li><li> Correr durante a noite em 52 V, 96 mA, 5 W. Verifique se a corrente está indo, procurando por bolhas no fio de prata perto do topo. Executar o gel até o fio condutor é de 1 cm a partir do fundo. </li><li> As proteínas também podem ser analisados ​​utilizando-se os equipamentos e reagentes de outras empresas tais BioRad ou Hoefer, de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 6. Prata coloração dos géis para Gel Visualization (dia 5-6) <ol><li> Prepara-se uma solução da solução de 1 (800 ml de etanol, 200 ml de ácido acético, e 1000 ml de água Milli-Q da coifa em um balde de plástico). Solução é boa para 6 géis. Ligue todas as máquinas off e tirar toda a parte do meio da unidade de Eletroforese e puvai la em pia. Também colocou o carrinho branco na pia. Retire a bandeja superior contendo o tampão 2x execução. </li><li> Desmontar o aparelho e remover os geles a partir de placas de vidro em solução da solução 1. Os géis podem ser identificados por cortar cantos quando são removidas das placas de vidro, o número de cantos cortados correspondente à ordem de gel no rodízio. </li><li> Colocar o recipiente com a solução da solução e os géis em um balancim para, pelo menos, 1 hora a durante a noite a 4 ° C. </li><li> Transferir o gel para corrigir a solução 2 (20 ml de 50% de glutaraldeído, 600 ml de etanol, 5 g de tetrationato de potássio (302,46 g / mol), 136 g de acetato de sódio (82,03 g / mol), e água Milli-Q para 2.000 ml) e coloque em uma cadeira de balanço para 1 hora. </li><li> Lave os géis 4x durante 15 min cada em água Milli-Q. </li><li> Manchar os géis em solução de nitrato de prata (4 g de nitrato de prata (169,87 g / mol), 500 mL de formaldeído e água Milli-Q para 2000 ml) durante 30 minutos ou até de 48 h. </li><li> Lavar o gel para umamin em água Milli-Q. </li><li> Transferir a solução de revelador (60 g de carbonato de sódio (105,99 g / mol), 300 ml de formaldeído, 15 mg de tiossulfato de sódio (158,11 g / mol), e água Milli-Q para 2000 ml) durante 5-30 min, até o gel é corado. </li><li> Colocar o gel em solução de paragem (100 g de Tris-Base (121,14 g / mol), 40 ml de ácido acético, e água Milli-Q para 2000 ml) durante 10 min. </li><li> Para o armazenamento, a transferência dos géis para solução de glicerol (40 ml de glicerol ou de 400 ml, se o armazenamento a longo termo é desejável, e 1600 ml de água Milli-Q), durante 10 min e em seguida secá-los utilizando um secador de gel. </li><li> Gel pode ser visualizada após coloração usando sistemas de imagem, como um scanner / densitômetro, fotografada usando transiluminador de luz ou Gel imager. O software de análise de imagem, tal como PDQuest análise 2-D da BIORAD pode então ser utilizada para obter informação quantitativa e qualitativa de proteínas numa amostra. </li></ol> 7. Gel Prata Coloração para Análise Espectrometria de Massa </p&gt; <ol><li> Fixar os geles em metanol a 50%, e 5% de ácido acético durante 1 hora. </li><li> Lavar com metanol a 50% durante pelo menos 10 minutos a durante a noite. </li><li> Lavar 3x em água destilada durante 10 min. </li><li> Sensibilizar com tiossulfato de sódio a 0,02% (158,11 g / mol) 2x durante 15 min. </li><li> Lavar 3x em REFRIGERADA 3x água destilada durante 10 min. </li><li> Submerge gel em REFRIGERADA solução de nitrato de prata a 1% (169,87 g / mol), durante pelo menos 20 minutos a 1 hora a 4 ° C </li><li> Lavar 2x durante 1 min, com água destilada. Mude tabuleiro / balde. </li><li> Desenvolver em 0,04% de formaldeído em 2% de carbonato de sódio anidro (105.99 g / mol) e descartar quando fica amarelo muito rápido, tem três lotes e estar pronto para mudar a cada 5 min. </li><li> Lavar com ácido acético a 5%, em seguida, armazenar em ácido acético a 1%. </li><li> Enxágüe 1,5 ml tubos Eppendorf (para segurar obter ponto cut-outs) com USP etanol grau e secar ao ar antes de usar. </li><li> Fórceps limpos, lâminas de barbear e superfícies com 100% de metanol. </li><li> Spray de luvas e superfícies com etanol. </li><li> Pontos especiais de consumo em uma capela de fluxo ou área de ar limpo. As manchas podem também ser excisada utilizando um cortador de ponto automatizado. </li><li> Coloque-as em tubos e navio Eppendorf no gelo ou manter em frigorífico. </li></ol>

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<li>Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+low-abundance+proteins+using+multidimensional+chromatography+and+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags.</a> J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Um método para a preparação de proteínas tem sido descrito que pode extrair a maioria das proteínas de Burkholderia com boa reprodutibilidade. Isto é demonstrado pela obtenção do mesmo perfil de proteína a partir de duas preparações independentes realizadas em dias diferentes, utilizando a mesma cultura bacteriana cresceu em LB ou caldo YEM como mostrado na Figura 1. Extração foi eficiente para as bactérias cultivadas em meio líquido, no entanto, não testei este método para as bactérias cultiva...

A Burkholderia gênero compreende mais de 62 espécies, Gram-negativos isolados de uma ampla variedade de nichos, e é dividido em dois blocos principais 1,2. O primeiro grupo inclui humana, animal e organismos phytotrophic, ea maioria dos estudos têm-se centrado nas espécies patogênicas deste grupo devido à sua importância clínica. Os membros mais patogênicas são B. pseudomallei e B. mallei (que causa melioidosis e mormo respectivamente) 3,4 e patógenos oportunistas (17 espécies definidas do complexo Burkholderia cepacia, BCC) 5, que causam doença na fibrose cística (FC) e doença granulomatosa crônica (CGD) 1. O segundo grupo, com mais de 30 espécies não patogênicas, incluindo bactérias associadas a plantas ou com o meio ambiente, e são consideradas como potencialmente benéfica para o host 2. Numerosos complicações surgem frinfecção bacteriana om com os membros patogénicos do género Burkholderia, tais como a transmissão do agente patogénico entre pacientes, a propagação da doença e tratamento de falha, devido à resistência intrínseca ou adquirida aos antibióticos tornando difícil de eliminar, na maioria dos casos 6-9. Por conseguinte, obter uma compreensão mais clara da base para o estabelecimento de infecção bacteriana é vital para o tratamento de doenças causadas por estes organismos. A fim de obter informações sobre o estabelecimento da infecção, são necessárias amplas investigações sobre os componentes bacterianos associados à patogênese. Os estudos sobre a análise proteômica de organismos Burkholderia usando abordagens proteômicas descrito proteínas que têm sido implicados na patogênese bacteriana, bem como mudanças em seu proteoma perfis 10-16. Métodos de extração de proteínas utilizando sonicação e ciclos de congelamento e descongelamento em tampão de lise contendo alta concentration de ureia, tio-ureia em combinação com um detergente e anfólitos foi aplicado em Burkholderia estudos proteomic 10-13. Embora a ureia é bastante eficaz para a desnaturação da proteína, que pode estabelecer um equilíbrio em solução aquosa, com isocianato de amónio, que podem reagir com os grupos de aminoácidos, formando assim artefactos (reacção de carbamilação) 17. Portanto, recomenda-se a incluir anfólitos transportadores, que actuam como agentes de limpeza de cianato e evitar temperaturas superiores a 37 ° C 17. Além disso, para evitar qualquer interferência química de tampão de lise com a quantificação de proteínas, o mesmo tampão de lise pode ser usado para gerar a curva padrão, de modo que as amostras e os padrões têm a mesma base 10. Outras metodologias envolvem o uso de buffers alcalinas e detergentes com períodos de incubação de calor 17,18, no entanto estas condições podem induzir alterações no proteoma e alguns detergentes não são compatíveis com o proteomics aplicação a menos que medidas de remoção de detergente subsequentes são incluídos 17,18. Após extracção e quantificação adequada, a expressão da proteína global de cada proteína individual pode ser estudada usando abordagens tais como a proteómica bidimensional (2-D) de electroforese em gel. Esta técnica foi descrita pela primeira vez por O&#39;Farell 19 e consiste na separação de proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico, por focagem isoeléctrica na primeira dimensão, e em seguida, de acordo com o seu peso molecular por electroforese em gel de acrilamida na segunda dimensão. Devido à sua resolução e sensibilidade, esta técnica é uma ferramenta poderosa para a análise e detecção de proteínas de fontes biológicas complexas 19,20. Esta técnica de separação está atualmente disponível em abordagens de proteína-centric com a grande vantagem de resolver isoformas da proteína causadas por modificações pós-transcricional ou processamento proteolítico. Alterações quantitativaspode ser detectada através da comparação da intensidade da mancha correspondente após a coloração do gel 20. No entanto, esta técnica não é adequada para a identificação de proteínas muito grandes, as proteínas de membrana, proteínas extremamente ácidas ou básicas e hidrofóbicos, e é uma técnica um tanto laboriosa e demorada 20. Novas abordagens peptídicos centrada (com base em gel não) que são mais robustas e objectivo tornar-se disponíveis e podem ser utilizados para a comparação quantitativa por diferenciais métodos de marcação de isótopos estáveis, tais como etiquetagem de cisteína por afinidade codificados por isótopos de marcação (ICAT) 21, e um grupo amino rotulagem por isótopo marcação de quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) 22. A utilização de uma única técnica proteômica pode dar informações insuficientes, portanto é necessário o uso de duas abordagens proteômicas complementares para a maioria das alterações que avaliam totalmente em proteoma. Contudo, a electroforese em gel 2-D é amplamente utilizado e pode ser aplicado como rotina quantitativo expressão de várias proteínas em organismos diferentes. Aqui nós descrevemos um extração de proteínas de células inteiras e 2-D procedimentos de eletroforese em gel de espécies de Burkholderia que foram adaptados e aperfeiçoados a partir das GE Healthcare 2-D Eletroforese princípios e métodos Handbook 80-6429-60AC 2004 ( <a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a> ). A extracção da proteína foi realizada utilizando um batedor de talão com contas de vidro na presença de PBS contendo EDTA 5 mM (ácido etilenodiaminotetracético) e 1 mM de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo). Este procedimento permite a quantificação de proteínas com degradação mínima e pode ser alterada por abordagens proteômicas como relatado anteriormente 15,23,24. Electroforese em gel de 2-D foi realizada utilizando 24 centímetros de comprimento imobilizadas pH 4-7 gradiente e as proteínas foram separadas de acordo com o seu ponto isoeléctrico. Em seguida, as proteínas foram separadas segundo a sua Molecular peso por gel de SDS-poliacrilamida. Além disso, foi descrito um método de coloração com prata para visualização de proteínas no local, e um método de coloração de prata, que é compatível com a análise de espectrometria de massa. Juntos, estes procedimentos podem permitir a identificação de proteínas importantes de espécies de Burkholderia que poderiam estar envolvidos na patogénese.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Acetona tóxica e corrosiva</td></tr><tr><td>Fisher</td><td></td><td>A18-1</td><td>Inflamável</td></tr><tr><td>PBS Buffer</td><td>Bioscience</td><td>R028</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP118-500</td><td>tóxico</td></tr><tr><td>Contas de vidro (0.1 mm)</td><td>Produtos BioSpec</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Oak Ridge Tubos de centrífuga, policarbonato (50 ml)</td><td>VWR</td><td>21009-342</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de proteínas MicroBCA</td><td>Pierce</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga 2.0 ml cónicos Tubos com tampa de rosca e anel de vedação</td><td>Fisher</td><td>02-681-375</td><td></td></tr><tr><td>Kit de limpeza 2-D</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Invitrogen</td><td>15505-050</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Amersham Biosciences</td><td>17-1314-01</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>MPBiomedical, LCC</td><td>856126</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm</td><td>Amersham Biosciences</td><td>176002-46</td><td></td></tr><tr><td>Duracryl</td><td>Proteomic Solutions</td><td>80-0148</td><td>Muito tóxico, cancerígeno</td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Fisher</td><td>BP179-100</td><td>Inflamável, tóxico, corrosivo</td></tr><tr><td>N, N, N', N'-tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td> <td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio inflamável (SDS)</td> <td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td>Toxicidade aguda, inflamável</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>HC1100-1GL</td><td>Inflamável, tóxico</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Fisher</td><td>A491-212</td><td>Inflamável, corrosivo</td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Fisher</td><td>G151-1</td><td>Muito tóxico, corrosivo, perigoso para o meio ambiente</td></tr><tr><td>Tetrationato de potássio</td><td>Sigma</td><td>P2926</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td> irritante <td>EM Science</td><td>7510</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de prata</td><td>Sigma</td><td>209139</td><td>Corrosivo, perigoso para o meio ambiente</td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma</td><td>252549</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>Tiossulfato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S7026</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>EMD</td><td>9230</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>MPBiomedical, LCC</td><td>808831</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>MPBiomedical, LCC</td><td>800688</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td>Inflamável, tóxico, perigoso para a saúde</td></tr><tr><td>Carbonato de sódio anidro</td><td>EMD</td><td>SX0400-3</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td> tóxico <td>ACROS</td><td>415080010</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment </td></tr><tr><td>Rotor de ultracentrífuga JA-20</td><td>Beckman Coulter</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>Mini Beadbeater</td><td>Biospec Products</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de focagem isoelétrica Ettan IPGphor II e acessórios</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6505-03</td><td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td></tr><tr><td>Ettan DALT Sistema de eletroforese vertical grande</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6485-27</td><td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td></tr></tbody></table>

extração de proteínas e 2-d métodos eletroforese em gel de<em&gt; burkholderia</em&gt; espécies

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

A investigação dos níveis de proteínas intracelulares de espécies de bactérias é de grande importância para a compreensão dos mecanismos patogênicos de doenças causadas por estes organismos. Aqui, descrevemos um processo para a extracção de proteínas a partir de espécies de Burkholderia baseado em lise mecânica com esferas de vidro na presença de ácido tetra-acético de etilenodiamina e de fluoreto de fenilmetilsulfonilo em tampão fosfato salino. Este método pode ser usado para diferentes espécies de Burkholderia, para diferentes condições de crescimento, e é provavelmente apropriada para a utilização em estudos de proteomas de outras bactérias. Após a extracção de proteínas, uma (2-D) técnica de eletroforese em gel de proteômica bidimensional é descrito para estudar mudanças globais nos proteomas desses organismos. Este método consiste na separação de proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico, por focagem isoeléctrica na primeira dimensão, seguido de separação com base no peso molecularpor electroforese em gel de acrilamida na segunda dimensão. A visualização das proteínas separadas é realizada por coloração com prata.

Análise comparativa dos perfis de proteínas extraídas da mesma cultura bacteriana em duas ocasiões diferentes mostraram padrões semelhantes de bandas indicando extração de proteínas de sucesso. Proteínas de peso molecular extraídos variou 10-150 kDa. Figura 1 mostra representativa coloração com Coomassie azul do gel as extracções de proteínas de células inteiras a partir de multivorans Burkholderia (um membro da BCC) isolados clínicos crescidos em LB ou levedura / Manitol (YEM) e caldo colhido ...

Membros do género Burkholderia são patógenos de importância clínica. Nós descrevemos um método para extração de proteínas bacterianas, usando ruptura mecânica, e eletroforese em gel 2-D para a análise proteômica subseqüente.

Extração de proteínas e 2-D métodos Eletroforese em Gel de<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espécies

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar um mapa bidimensional do proteoma bacteriano. Isso é realizado primeiramente cultivando uma cultura bacteriana e coletando as proteínas. Em seguida, as proteínas coletadas são separadas em uma única dimensão de acordo com seu pH.Por meio da focalização isoelétrica após a separação na primeira dimensão, as proteínas são separadas adicionalmente na segunda dimensão de acordo com seu peso molecular. Por fim, o gel da segunda dimensão é corado e as proteínas são visualizadas. Em última instância, podem-se obter resultados que mostram diferenças na expressão proteica por meio da eletroforese bidimensional.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da patogênese bacteriana, como quais proteínas são produzidas sob certas condições e como diferentes isolados bacterianos diferem na produção de proteínas. Essas informações podem auxiliar na identificação de proteínas candidatas que possam estar envolvidas na virulência. Após cultivar 100 mililitros de uma cultura bacteriana de leite frio até a fase estacionária, transfira 35 mililitros para um tubo de centrífuga e centrifugue a 4.500 ×g e quatro graus Celsius por 20 minutos.Resuspenda o pellet em 35 mililitros de PBS frio e repita a centrifugação. Após ressuspende o pellet em um mililitro de PBS frio, transfira a solução para um microtubo estéril de dois mililitros e centrifugue novamente. Repita a lavagem com um mililitro de PBS frio antes de centrifugar a quatro graus Celsius e 14.000 Gs por um minuto. Descarte o sobrenadante e adicione um mililitro de solução P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F. Transfira o pellet dissolvido para um tubo com tampa de rosca de dois mililitros contendo cerca de 0,5 mililitros de esferas de vidro previamente esterilizadas.Em seguida, na câmara fria, para romper as células, utilize um mini homogeneizador de esferas três vezes, por um minuto cada, colocando a amostra em gelo após cada ciclo e centrifugando por um minuto antes de transferir o sobrenadante para um tubo estéril de poliestireno de cinco mililitros. Para aumentar o rendimento, repita a homogeneização duas vezes com uma alíquota adicional de P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F. Recolha as amostras.Em seguida, após quantificar a proteína, armazene alíquotas de 200 microgramas a menos 80 graus Celsius até o momento de uso para realizar a primeira dimensão. A focalização isoelétrica ou IEF começa utilizando solução de limpeza para fitas a fim de limpar os suportes para fitas. Em seguida, enxágue as fitas com água milli Q.Em seguida, deixe-os de cabeça para baixo para secar; após a secagem, atribua cada amostra a um número de suporte para fitas de gel. Carregue uma amostra de proteína previamente preparada de 200 microgramas no poço lateral do suporte e use a pipeta para distribuir a amostra ao longo do suporte, utilizando pinças limpas. Retire as fitas de gel da embalagem.Em seguida, remova a camada protetora das tiras de gel antes de posicioná-las com o lado áspero voltado para baixo, em movimento lento e deslizante, para umedecer as tiras desde a extremidade negativa até a extremidade positiva. Para prevenir a queima, coloque papel de blotting umedecido com água esterilizada sobre o eletrodo e sob as tiras de gel. Remova bolhas de ar e recubra com uma fina camada de óleo mineral para evitar ressecamento.Alinhe os suportes das tiras de gelo na máquina de IEF. Execute as amostras usando o programa listado aqui. Os géis podem ser removidos a qualquer momento durante o último passo.Quando o programa estiver concluído, remova as tiras dos suportes e, a menos que sejam usadas imediatamente, cubra-as com filme plástico e armazene-as a menos 80 graus Celsius até o momento de realizar a eletroforese SDS-PAGE em segunda dimensão. Após montar o equipamento de moldagem de gel para SDS-PAGE, prepare a solução do gel em um frasco com ponta de vácuo e barra de agitação, adicionando tampão Tris 1,5 molar e mistura de água MCU, e desgaseifique a solução em velocidade moderada com o vácuo por 20 minutos. Quando o vácuo terminar, adicione 10% de SDS à solução do gel pipetando pelas laterais do frasco. Para evitar a introdução de bolhas, adicione então persulfato de amônio e TEMED recém-preparados e agite.Despeje o gel e deixe endurecer, depois dissolva DTT na solução de equilíbrio previamente preparada. Retire as fitas do armazenamento a menos 80 graus Celsius, desenrole-as e posicione as fitas IPG com o lado do gel voltado para baixo no tampão, incubando por 30 minutos. Em seguida, adicione 4,5 litros de tampão de eletroforese ao tanque de corrida.Em seguida, utilizando pinças, remova as tiras da solução de equilíbrio e use um papel toalha para drenar o tampão em excesso. Desmonte o equipamento de moldagem do gel e lave as placas de vidro com água morna. Após substituir a água na parte superior do gel pelo tampão de corrida, use pinças limpas para posicionar uma tira sobre a placa longa, com o lado do gel voltado para você.Lubrifique a tira com um x de tampão e use uma tira de plástico para deslizar a tira IPG mais para baixo, encostando-a ao gel, removendo todas as bolhas de ar entre a tira e o gel. Adicione solução selante de agarro ao topo da tira para fixá-la no lugar. Em seguida, após repetir o processo para todas as tiras, abaixe-a no tanque de eletroforese.Após garantir que o nível do tampão 1x na câmara externa esteja no nível designado, fixe a câmara superior. Coloque o suporte da câmara de tampão superior sobre as placas de vidro e pressione para baixo. Adicione o tampão de corrida 2x na câmara superior até a linha média.Em seguida, adicione o tampão de eletroforese 1x à câmara externa até atingir a linha superior. Coloque a tampa e ligue a unidade de eletroforese e a fonte de alimentação. Execute as amostras durante a noite a 52 volts, 96 miliampères e cinco watts.Execute os géis até que as linhas líderes estejam a um centímetro do fundo. Após o tempo de corrida, remova as placas do suporte. Assim que os géis forem retirados das placas de vidro, fixe-os na solução um por pelo menos uma hora ou durante a noite a quatro graus Celsius.Em seguida, transfira os géis para a solução de fixação dois e agite durante uma hora. Lave os géis em água Milli Q quatro vezes, por 15 minutos cada. Depois, use a solução de nitrato de prata para corar os géis por 30 minutos ou até 48 horas.Após lavar os géis por um minuto em água Milli Q, transfira-os para a solução reveladora até que o gel fique corado. Após cerca de cinco a 30 minutos, para interromper a reação, transfira os géis para a solução de parada por 10 minutos. É mostrado aqui um gel corado com Kumasi Blues de extratos proteicos de células inteiras de Ol dia multivorans.Isolados clínicos cultivados em caldo LB ou caldo de manitol com levedura e colhidos na fase estacionária. A análise comparativa dos perfis proteicos extraídos das mesmas culturas bacterianas em duas ocasiões diferentes mostrou padrões de bandas semelhantes, indicando extrações proteicas bem-sucedidas. Nesta figura, a análise por eletroforese em gel bidimensional de 200 microgramas de proteína total de Bural dio, pseudo mostra uma abundância de mais de 500 pontos que podem ser individualmente identificados por espectrometria de massas.Após este procedimento, outros métodos, como citometria, podem ser realizados para determinar diferenças quantitativas e qualitativas entre isolados bacterianos estreitamente relacionados. Além disso, com uma modificação no método de coloração, os pesquisadores podem determinar a identidade de manchas proteicas mediante a excisão de manchas e espectrometria de massas.

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Recentemente, relatou uma nova abordagem para a geração de sondas DNAzyme fluorogênicos que podem ser aplicadas para criar um simples, "mistura-e-ler" teste de fluorescência para a detecção bacteriana. Estas sondas de DNA especiais catalisar a clivagem de um cromóforo-modificado substrato DNA-RNA quimérico, na presença de mistura extracelular em bruto (CEM) produzida por uma bactéria específica, assim, traduzindo a detecção de bactérias em geração do sinal de fluorescência. Neste relatório, irá...

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A co-expressão de proteínas é uma alternativa poderosa para a reconstituição in vitro de complexos proteicos e auxilia na realização de testes bioquímicos e genéticos in vivo. Aqui relatamos o uso da co-expressão de proteínas em Escherichia coli para obter complexos proteicos e ajustar a frequência de mutação das células.

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As proteinases são vitais para a patogênese bacteriana, permitindo a invasão e a evasão imunológica. A extração em uma única etapa de proteínas citoplasmáticas e de membrana de bactérias em sua forma ativa é angustiante. Este artigo em vídeo demonstra a extração de proteínas celulares inteiras de Leptospira para análise de zimografia para detectar e caracterizar gelatinases.

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Este protocolo separa proteínas insolúveis da parede celular e da membrana em frações simples (1-5 proteínas) usando focalização isoelétrica preparativa (IEF) com base no ponto isoelétrico, seguido de separação por peso molecular. As frações resultantes podem ser usadas diretamente para análises imunológicas e proteômicas sem purificação adicional.

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Aprenda extração de proteínas e eletroforese 2-D para análise proteômica de patógenos Burkholderia. Este método permite mapear o proteoma bacteriano e identificar diferenças na expressão proteica.

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