A Brasão Cama Ensaio de Sementes para explorar Geneticamente

O objetivo geral deste procedimento é montar um ensaio de leito de revestimento de sementes para investigar como o endosperma controla a germinação de sementes em uma rabbit opsis em resposta a diversas condições ambientais, tanto em nível genético quanto in vitro. Isso é realizado primeiramente utilizando uma agulha de seringa e pinça truncada para dissecar cuidadosamente a semente, o revestimento e o embrião da semente de Arab Opsis. Na segunda etapa, os revestimentos de semente dissecados são transferidos suavemente para o meio de germinação.

Em seguida, as camadas de sementes são montadas em uma única camada circular. Na etapa final, os embriões são dispostos no centro da camada montada de cascas de sementes, também em uma única camada circular.

O endosperma desempenha um papel essencial no controle da germinação de sementes em nossas sementes de abúlpia. E o ensaio de dobramento do código da semente é um procedimento genético in vitro para identificar os componentes moleculares das vias de sinalização que atuam no endosperma para o controle da germinação de sementes. Em geral, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque é difícil dissecar rapidamente o embrião sem danificá-lo.

A idade do material definido também é importante, pois com o tempo ele perde a capacidade de controlar a determinação celular. Comece despejando de 50 a 60 microlitros de sementes secas maduras de Arabidopsis em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione um mililitro de etanol a 70% ao tubo e agite as sementes à temperatura ambiente em um vórtex ou em agitação a 1200 RPM. Após 10 minutos, centrifugue o tubo por três segundos a 4.000 Gs para concentrar as sementes no fundo do tubo.

Em seguida, use uma ponta de sucção a vácuo para aspirar cuidadosamente o etanol, deixando as sementes no fundo do tubo. Agora, adicione um mililitro de água destilada estéril às sementes e agite-as por mais 10 minutos. Após centrifugar as sementes novamente, aspire o sobrenadante e adicione outro mililitro de água destilada estéril ao tubo, garantindo que o fluxo de água mantenha as sementes suspensas de maneira homogênea por todo o tubo.

Em seguida, coloque o tubo em um suporte para deixar as sementes sedimentarem no fundo do tubo. Após cerca de 30 segundos, aspire cuidadosamente a água para semear as sementes. Primeiro, despeje 30 mililitros de meio de germinação recém-preparado a 50 graus Celsius em uma placa de Petri de 100 milímetros. Re-suspenda as sementes em 200 microlitros de água destilada estéril e, em seguida, use a ponteira de uma micropipeta de um mililitro para transferi-las para a superfície do meio de germinação.

Aspire a água ao redor das sementes e, em seguida, deixe a placa de Petri e as sementes descobertas dentro da cabine de fluxo laminar para secagem adicional. Após duas horas, feche a placa de Petri, mantendo as sementes na capela por mais 90 minutos. Agora, coloque um microscópio estereoscópico dentro da capela.

Despeje 30 mililitros de meio de germinação em outro recipiente de ágar de 100 milímetros, e então coloque dois papéis retangulares Watman nº 3 autoclavados justapostos sobre a superfície do meio. O passo mais difícil deste procedimento é a dissecação de c, porque A, a semente é muito fina, portanto é necessário ter muito cuidado para evitar danificar o embrião ao cortar a semente segurada com, usando um par de pinças estéreis de ponta romba Dumont número cinco.

Transfira as sementes para os papéis, mantendo então a pinça fechada. Pressione suavemente uma semente individual contra o papel. Agora, use a ponta de uma agulha de seringa de insulina de 29 graus para cortar o tegumento da semente ao longo do eixo semi-principal mais longo, o mais próximo possível do local onde as coletas se unem à radícula.

Em seguida, use a pinça para pressionar a semente contra o papel. Novamente, aplique pressão na ponta das Cains mais próxima à ponta da radícula para liberar o embrião da casca da semente e montar um ensaio de cama de casca de semente. Primeiro, coloque um pedaço de malha de náilon estéril medindo 3,5 por cinco centímetros em outra placa de 100 milímetros recém-preparada com meio de germinação.

Em seguida, use a seringa para empurrar suavemente os embriões e as túnicas das sementes para as bordas metálicas da pinça e transfira os tecidos vegetais para a malha de náilon. Use a pinça e a seringa para montar uma única camada circular das túnicas das sementes, certificando-se de que as túnicas estejam o mais próximas possível umas das outras e de que as aberturas nas túnicas estejam voltadas para cima. Em seguida, posicione os embriões em uma única camada circular no centro da cama de túnicas, garantindo que os embriões também estejam o mais próximos possível entre si.

Por fim, incubar os ensaios com sementes em substrato úmido sob luz contínua a 20 a 21 graus Celsius, em concordância com resultados anteriores. Sementes de um mutante opsys de coelho incapazes de sintetizar gierilina ou mutantes deficientes em GA não conseguem germinar 80 horas após a inibição da semente. Em contraste e em maior concordância com resultados anteriores, a remoção do tegumento da semente desencadeia o crescimento do embrião mutante deficiente em GA, a menos que ácido OB CIC ou um BA esteja presente no meio, sugerindo que o endosperma de mutantes deficientes em GA libera um BA em direção ao embrião para bloquear sua germinação.

Nesta imagem, 80 horas após a inibição da semente, é mostrado um ensaio de cama de testa com embriões mutantes deficientes em GA sobre uma camada de 80 testas de sementes mutantes deficientes em GA. De acordo com nossa hipótese, as testas de sementes mutantes deficientes em GA bloqueiam o crescimento dos embriões mutantes deficientes em GA. Aqui, é apresentado um ensaio de cama de testa com embriões mutantes deficientes em GA cultivados sobre uma camada de testas de sementes mutantes deficientes em GA que também não possuem capacidade de sintetizar ABA; 80 horas após a inibição da semente, como esperado, as testas mutantes são incapazes de bloquear o crescimento dos embriões mutantes deficientes em GA.

Da mesma forma, embriões mutantes deficientes em GA cultivados sobre uma camada de testas de sementes mutantes deficientes em GA, sem o fator deli RGL dois, também foram incapazes de bloquear o crescimento de embriões mutantes deficientes em GA após este procedimento. Outros métodos, como a análise de expressão gênica a partir de testas de sementes e embriões dissecados de sementes, podem ser realizados para investigar a interação genética utilizando o banho com testa de semente. Assim, uma vez dominada a técnica, ela deverá permitir que pesquisadores na área de germinação de sementes explorem como a testa de semente controla o crescimento embrionário em resposta a sinais ambientais em nosso s.