Identificação de bactérias metabolicamente ativas no intestino do Generalista Spodoptera littoralis Via DNA Isótopos Estáveis ​​Sondagem Usando ¹³ C-Glicose

O objetivo geral do experimento a seguir é detalhar uma metodologia eficiente empregada para filo Caracterizar geneticamente as bactérias metabolicamente ativas no intestino de um inseto. Isso é conseguido alimentando primeiro o inseto com glicose marcada com C 13 para enriquecer isotopicamente o DNA das bactérias metabolicamente ativas em seu intestino. O próximo passo é extrair o DNA da comunidade bacteriana presente no intestino.

O terceiro passo é separar o DNA das espécies metabolicamente ativas, que incorporaram o C 13. O DNA é então identificado filogeneticamente e quantificado para as espécies presentes por pirosequenciamento. Identificando assim as espécies bacterianas metabolicamente ativas que compõem a comunidade presente no intestino do inseto.

Portanto, o intestino do organismo multicelular é uma invenção engenhosa para explorar as capacidades metabólicas dos microrganismos para dissolver ou solubilizar matéria orgânica complexa para que ela possa finalmente servir como nutrientes para o inseto hospedeiro. Para entender o sistema, temos que analisar primeiro quem está lá fora e, segundo, quem tem quais atividades metabólicas. Se tivermos esses dados, podemos reconstruir o fluxo de metabólitos e produtos de degradação entre os microrganismos degradantes e o inseto hospedeiro.

Este método pode nos ajudar a responder a questões-chave no campo da ecologia microbiana, particularmente na maneira como esses micróbios estão interagindo com seu hospedeiro. Nesse sentido, poderíamos saber mais, esclarecer e definir quais são as funções que esses organismos estão desempenhando para seu hospedeiro. Embora este método possa fornecer informações sobre as bactérias intestinais ativas em geral.

Ao rastrear a glicose ucle, também pode ser realizado para outras fontes de carbono, como a marcação da celose para identificar bactérias ativas envolvidas no processo de digestão do nutriente ocrante. Mantenha op, litros, ovos e placas de Petri adicionam temperatura ambiente até que eclodam. Em seguida, transfira as larvas recém-eclodidas para uma caixa de plástico limpa e crie-as em uma dieta artificial a 23 a 25 graus Celsius sob um regime de dia longo com 16 horas de iluminação e oito horas de escuridão após alguns dias, transfira nove a 15 larvas saudáveis de segundo ínstar da caixa de criação para placas de Petri individuais contendo glicose C 13 fresca.

Dieta artificial enriquecida, pelo menos três repetições de três larvas cada são necessárias por tratamento. Use uma dieta artificial que forneça a mesma quantidade de glicose nativa que uma fonte de alimento natural, como o algodão, para alimentar o grupo de controle. Nas próximas 24 horas.

Renove frequentemente as dietas artificiais. Comece transferindo as larvas com uma pinça macia para uma piscina de água destilada para remover grandes detritos. Em seguida, transfira para um novo prato limpo para anestesiar e matar os insetos.

Coloque-os no gelo e depois abaixe a temperatura para cinco graus Celsius negativos em um refrigerador. Em seguida, desinfete os insetos mortos com etanol a 70% e mergulhe-os em PBS para a dissecação. As ferramentas também devem ser limpas com etanol 70%.

Comece com incisões na cutícula ao longo dos lados direito e esquerdo. Comece na cabeça e termine no ânus. Remova todo o exoesqueleto, os túbulos do mali e o corpo gordo.

Em seguida, substitua o tampão antes de abrir o intestino com o intestino isolado dos outros tecidos. Processe todo o intestino ou seções para intestino, intestino médio ou intestino posterior. Dependendo da questão científica.

Transfira os tecidos intestinais sem PBS para um pequeno tubo estéril e guarde-os no freezer. Antes da extração do DNA, seque as amostras a 45 graus Celsius em um dispositivo concentrador a vácuo por 30 a 90 minutos, dependendo do tamanho do tecido. Em seguida, esmague o tecido seco usando um plástico estéril Pele para extrair o DNA genômico usando um kit para extração de DNA do solo.

Em seguida, determine a concentração do DNA final iludido usando um espectrofotômetro. Verifique uma extração bem-sucedida do DNA metagenômico microbiano do intestino do inseto, preparando um ensaio de PCR diagnóstico usando primers gerais bacterianos 27 F e 1, 492 R. Para diagnóstico. Execute cinco microlitros de cada produto de PCR em um gel 1%agros a 300 volts e 115 miliamperes por cerca de 20 minutos.

O tamanho correto dos amplicons é de 1,5 kilobases. Junte o ADN extraído correspondente a cada réplica experimental. Manter aqueles com e sem glicose C 13 separados.

Normalize as concentrações de DNA para garantir que cada amostra contribua igualmente para seu pool. Uma concentração final de 500 a 5.000 nanogramas de DNA é adequada para o processo de ultracentrifugação. Verifique novamente a concentração prevista com o espectrofotômetro em um tubo estéril de 15 mililitros com tampa de rosca.

Configure o meio de gradiente. Combine o DNA quantificado com 4,8 mililitros de solução de cloreto de césio. Em seguida, complete o volume com seis mililitros de buffer de gradiente.

Transfira cuidadosamente as misturas para tubos de ultracentrífuga de 5,1 mililitros. Usando uma seringa e uma agulha, encha os tubos até a base do pescoço e evite bombear ou formar bolhas de ar. Inclua pelo menos um gradiente em branco sem DNA em cada execução.

Para atuar como um gradiente de referência, selecione pares de tubos e equilibre-os com uma precisão de 10 miligramas. Aplique um topper de tubo em cada tubo e certifique-se de que eles estejam livres de vazamentos, invertendo o tubo e aplicando pressão moderada com a mão. Use um rotor quase vertical com oito poços.

Vede cuidadosamente os poços do rotor e carregue o rotor na ultracentrífuga de acordo com as instruções do fabricante. Gire o DNA a 50.000 RPM a 20 graus Celsius sob vácuo por 40 horas. Selecione a aceleração máxima e a desaceleração sem travagem.

Dois dias depois, remova cuidadosamente os tubos do rotor da centrífuga usando uma pinça. Coloque-os em um rack sem perturbar os gradientes formados e processe os tubos imediatamente. Primeiro, equilibre uma HPLC usando uma taxa de fluxo de 850 microlitros por minuto.

Em seguida, conecte o tubo de ultracentrífuga a um suporte de fixação e perfure a parte inferior do tubo com uma agulha de calibre 23 de uma polegada presa a uma seringa. Portanto, perfure cuidadosamente a parte superior do tubo com um minerador de controle para evitar perturbar a forma, o gradiente e a prática de antemão para garantir um movimento de PSA bem-sucedido. Em seguida, insira a agulha presa ao tubo da bomba na parte superior do tubo, onde não há fluido, e colete as gotas do fundo diretamente em tubos estéreis de 1,5 mililitro Micro fuge coletam uma fração a cada 30 segundos para 425 microlitros por fração.

Neste exemplo, 12 frações são coletadas de cada gradiente. Em seguida, meça a densidade de cada fração separada em uma balança analítica. Prossiga com a recuperação do DNA e pirosequenciamento consultando o protocolo de texto por 24 horas.

10 milimolares C 13 glicose foi suplementada na dieta de litros de ssop. Larva. A mesma quantidade de glicose normal foi adicionada à alimentação dos insetos controle. Em seguida, o DNA foi extraído da comunidade bacteriana do intestino do inseto.

Em um gel de eletroforese, uma forte banda de DNA genômico no topo confirmou uma extração de DNA bem-sucedida, uma PCR diagnóstica. O uso de primers universais bacterianos mostrou a presença de DNA bacteriano, o sequenciamento pirométrico quantitativo foi realizado diretamente nos gradientes SIP representativos para revelar a linhagem da espécie e sua abundância relativa. Um total de 120.045 leituras de alta qualidade foram geradas com um comprimento médio de 404 OTs.

O perfil de pirosequenciamento mostrou um aumento da abundância de certas espécies, incluindo enterococcus e panto na amostra rotulada em comparação com o grupo controle. Portanto, essas bactérias são consideradas metabolicamente ativas e merecem um estudo mais aprofundado. Portanto, ao tentar este procedimento, é importante lembrar de envolver um controle adequado na análise do CYP.

Então, o que subtrairia o impacto do fundo, a contaminação no flash do cabelo e garantiria que a diversidade e abundância de bactérias aparecendo ou desaparecendo não fossem artefato da massa em si. Seguindo este procedimento ou as metodologias como fluorescência in situ Nesse caso, cuidaremos da localização e disposição das bactérias dentro do intestino do inseto.