Name: Identificação de bactérias metabolicamente ativas no intestino do Generalista Spodoptera littoralis Via DNA Isótopos Estáveis Sondagem Usando 13 C-Glicose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T20:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Aprenda a identificar bactérias metabolicamente ativas no intestino de Spodoptera littoralis usando sondagem com isótopos estáveis de DNA e glicose-13C. Este método avança a ecologia microbiana em insetos.

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Agradecemos Angelika Berg de assistência laboratorial. Este trabalho foi apoiado e financiado pela Sociedade Max Planck e da Escola de Comunicação Jena microbiana (JSMC).

1. Insect Criação <ol><li> Compre ou obter ovos garras de Spodoptera littoralis de seu próprio criação. Mantê-los em placas de Petri estéreis à temperatura ambiente (RT) até a eclosão. </li><li> Prepare a dieta artificial para insectos de criação como se segue: <ol><li> Mergulhe 500 g de feijão branco de terra durante a noite em 100 ml de água. </li><li> Adicionar 9,0 g de ácido ascórbico e 75 g de ágar a 1000 ml de H2O destilada e depois reduzi-lo. </li><li> Deixe a mistura a arrefecer e, quando a mesma solidifica (para uma mistura de sólido ceroso branco) armazená-lo a 4 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Transfira a larva a uma caixa de plástico limpo e criá-los na dieta artificial a 23-25 ​​° C, sob um regime de longo dia com 16 horas de iluminação e 8 horas de escuridão. Mude a comida todos os dias até as larvas passam por todos os seis estágios larvais. </li></ol> 2. 13 C-rotulagem de DNA em bactérias do intestino metabolicamente ativo <ol><li> Dissolve-se 186,1 mg de totalmente 13 C-glucose marcada com água destilada e água desionizada (ddH2O) e misture bem com 100 g de uma dieta artificial para o experimento SIP. Certifique-se de uma concentração de 13 C-glucose final de 10 mM na dieta artificial. Este simula a concentração de glucose in situ no intestino de S. littoralis larvas em plantas de algodão de acordo com Shao et al. (submetido). </li><li> Transferência 9-15 segunda larvas saudável a partir da caixa de criação para placas de Petri de plástico estéril (uma larva por placa de Petri) contendo fresco 13 C-glicose cravado dieta artificial. Use dieta artificial contendo a mesma quantidade de glicose nativa (12 C-glicose), tal como descrito, para a alimentação do grupo de controlo. </li><li> Renove a dieta artificial com frequência durante o período de incubação (1 dia). Use condições de criação como no passo 1.3. </li><li> Colete nove larvas de cada tratamento para posterior processamento (extração de DNA). Cadareplicar é constituído por três indivíduos; fazer, pelo menos, três repetições por tratamento. </li></ol> 3. Insect Dissection <ol><li> Limpar e desinfectar as ferramentas de dissecação no início do trabalho com etanol 70% (Ferramentas = tesoura Vannas, fórceps e bisturi com lâminas descartáveis ​​finas). </li><li> Pegue os insetos com uma pinça macios e lavar a pele superficialmente com água destilada. Colocá-los em gelo durante pelo menos 30 minutos para anestesiar eles. </li><li> Enquanto ainda anestesiados lugar deles a 0 ° C durante 1 hora para matar. Desinfetar os insetos mortos superficialmente por imersão em etanol (70%) por um par de minutos. </li><li> Realizar o insecto dissecção em um volume de aproximadamente 15 ml de PBS 1x depositado sobre uma placa de Petri esterilizada (NaCl 1XPBS = 137 mM, KCl 2,7 mM, 4,3 mM de Na 2 HPO 4, 1,47 mM, KH 2 PO 4, ajustar o pH para 7,4 , autoclave). Certifique-se de ter o corpo todo inseto totalmente imersa na solutíon durante todo o período de dissecação. </li><li> Comece a dissecção, fazendo uma incisão na pele ao longo do lado esquerdo do inseto direita e, começará na cabeça e terminar no ânus. Retire toda a pele, túbulos de Malpighi, e gordura corporal. Mude para tampão fresco antes de cortar aberto o intestino. Seção do intestino em primeiro plano, médio e intestino posterior, quando necessário. Armazenar o tecido no congelador (-80 a -20 ° C) até que a extracção do ADN </li></ol> 4. Extração de DNA e amplificação <ol><li> Colocar o tecido de insectos em um tubo de 1,5 ml de centrífuga estéril e secar todas as amostras a 45 ° C num dispositivo de concentrador de vácuo. Esmagar o tecido seco com um pilão de plástico estéril. </li><li> Extrair o DNA genômico utilizando um kit adequado para a extração de DNA do solo. Transferir o tecido seco para o tubo de reacção do kit e seguir as instruções como indicado pelo fabricante. </li><li> Determinar a concentração do ADN eluído final, utilizando um espectrofotómetro. </li><li> Verifya extração com sucesso do DNA metagenômica microbiana do intestino do inseto através da preparação de um ensaio de PCR diagnóstico usando eubacterianas primers gerais 27f (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) e 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3). Definir a reacção de PCR como se segue: <ol><li> Definir uma mistura de reacção de 50 ul contendo 1x tampão, 1,5 mM de MgCl 2, 10 mM de quatro trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTPs), 2,5 U de Taq DNA polimerase, 0,5 mM de cada iniciador e 60 ng do ADN extraído como molde. </li><li> Executar as reacções de PCR utilizando um termociclador como se segue: desnaturação inicial a 94 ° C durante 3 min, seguido por 35 ciclos de: 94 ° C durante 45 seg, emparelhamento a 55 ° C durante 30 seg e extensão a 72 ° C durante 1 min . Usar um passo de extensão final a 72 ° C durante 10 min. </li><li> Verificar a amplificação com êxito por PCR em agarose a 1% da electroforese de brometo de etídio (EB) gel corado (dissolver 1 g de agarose em 100 ml de tampão 1 x TAE e mancha com 1ml EB). Depósito 5 jul of thproduto e PCR + 1ml de 6x corante de carregamento para os bolsos de gel. (1x TAE = 40 mM Tris-Base, 20 mM de ácido acético glacial, 1 mM de EDTA, ajustado a pH 8). </li><li> Executar o gel utilizando tampão 1xTAE a 300 V, 115 mA, durante ca. 20 min em uma câmara de eletroforese. Usando uma câmara de documentação de gel (transiluminador UV ligado a uma câmera digital e computador) observar o gel e comparar o tamanho do seu produto final com o marcador de gene também carregado, o tamanho correto dos amplicons deve ser de aproximadamente 1,5 kb. </li></ol></li><li> Armazenar os produtos de PCR sob condições de congelamento profundo, preferencialmente -80 ° C, até utilização. </li></ol> 5. Separação do CsCl DNA Gradiente Ultracentrifugação <ol><li> Preparar os reagentes para os gradientes de ultracentrifugação como se segue: <ol><li> Prepara-se uma M de cloreto de césio (CsCl), solução 7,163 dissolvendo gradualmente 603,0 g de CsCl em ddH2O e encher-se até um volume final de 500 ml. </li><li> Exatamente desterminé a densidade da solução de CsCl preparado por pesagem de um aliquota de 1,0 ml em um equilíbrio de três dígitos por triplicado. Esta, geralmente, varia entre 1,88 e 1,89 g / ml à temperatura ambiente. </li><li> Preparar o tampão de gradiente (Tris 100 mM, KCl 100 mM e EDTA 1 mM) por combinação de 50 mL de 1 M de Tris-HCl (pH 8,0), 1 ml de 0,5 M de EDTA (pH 8) e 3,75 g de KCl numa final volume de 500 ml, utilizando DDQ 2 O. Filtro (0,22 mM) e esterilizar em autoclave esta solução. </li></ol></li><li> Separação DNA <ol><li> Tendo determinado a concentração de DNA individual dos insectos tratados, medida como no ponto 4.3, reunir os insetos correspondentes a um conjunto de replicação e normalizar a concentração de ADN para assegurar que cada um, contribui igualmente para a amostra combinada. A concentração final de 500-5.000 ng de ADN (medir novamente a concentração final), é adequado para o processo de ultracentrifugação 21. </li><li> Para configurar o meio de gradiente, combinar o DNA quantificado, um buffer de gradiented 4,8 mL de solução 7,163 M de CsCl em conjunto a um volume de mistura de 6,0 ml para um tubo estéril de 15 ml com tampa de rosca (geração de uma mistura de ADN-meio de gradiente). </li><li> Cuidadosamente coloque o gradiente de mistura de ADN-meio preparado para um tubo de ultracentrífuga 5,1 ml (preencher até a base do gargalo do tubo) utilizando uma seringa e agulha. Evitar bombeamento ou formar quaisquer bolhas de ar. Inclua pelo menos um gradiente em branco (usando DDH 2 O em vez de DNA) em cada centrífuga prazo, como um gradiente de referência. </li><li> Pares de tubos de equilíbrio para dentro de 10 mg de peso após cada meio de gradiente necessário é preenchida para o respectivo tubo de ultracentrífuga. Selar o tubo com um &quot;Topper Tube&quot; e garantir que o selo é livre de vazamentos invertendo o tubo e aplicando uma pressão moderada com a mão. </li><li> Use um rotor quase vertical com oito poços para a realização de 5,1 ml tubos de ultracentrifugação para a ultracentrifugação. Selar cuidadosamente os poços do rotor e carregar o rotor para a ultracentrífuga de acordo com a mainstruções do nufacturer. Definir as condições de ultracentrifugação: rotação em 50.000 rpm (cerca de 177.000 xg), a temperatura a 20 ° C, e ultracentrifugação tempo de funcionamento por 40 horas, com vácuo. Selecione a aceleração máxima e desaceleração sem freio. </li><li> Uma vez terminado, remova cuidadosamente os tubos do rotor de centrífuga com a pinça. Colocá-los em um rack, sem perturbar os gradientes formados dentro dos tubos. Processe as amostras de fraccionamento de gradiente, logo que possível, para minimizar qualquer difusão. </li></ol></li><li> Recuperação de DNA a partir de gradientes isopícnica separados por fracionamento <ol><li> Usar um sistema de bomba de HPLC com uma precisão de realizar o fraccionamento de gradiente, o qual separa os gradientes igualmente formados a partir do tubo de ultracentrífuga método de deslocamento superior. Ligue a bomba de HPLC (100% gradiente de fluxo) para a garrafa cheia de 1 L de deslocamento DDH 2 O e firmemente anexar a tubulação da bomba aberta com um 23 G 1 em agulha de seringa. Adicionar suficiente bromophenol corante azul para o DDH 2 O para dar-lhe uma cor azul escuro. Isto facilita a visualização de interface entre o meio de gradiente e o deslocamento de ddH 2 O. </li><li> Definir a bomba a uma taxa de fluxo de 850 mL / min e equilibrar o sistema até que uma gota da cor azul ddH2O emerge para fora da agulha de uma seringa. </li><li> Cuidadosamente fixar o tubo de ultracentrífuga para uma posição de fixação e perfurar o fundo do tubo com uma seringa de 23 G 1 em agulha longa. Ligar a bomba para o tubo de ultracentrífuga, inserindo a agulha ligada ao tubo da bomba para a parte superior do tubo, e recolher gotas a partir do fundo directamente em tubos estéreis de microcentrífuga de 1,5 ml. Coletar uma fração a cada 30 seg, no valor de cerca de 425 mL por fração e um total de 12 frações por gradiente. Note que a última fracção (fracção 12) contém geralmente o deslocamento ddH2O e deve ser descartado. </li><li> Após o fracionamento, measure a densidade de todas as fracções separadas, utilizando uma balança analítica, como mencionado na etapa 5.1.2. </li><li> Precipitar o DNA a partir de cada fracção (em 425 uL) adicionando primeiro uma glicogénio ul (20 ug / ul em ddH2O, autoclavado) como um transportador para a precipitação de uma baixa quantidade de ADN. Misture bem por inversão. </li><li> Adicionar dois volumes (850 uL) de uma solução de (PEG) (dissolver 150 g de polietileno glicol 6000 e 46,8 g de NaCl em ddH2O para um volume total de 500 ml de polietileno-glicol. Filtro, esterilizar e autoclave. A solução de PEG é 30 % PEG 6000 e 1,6 M de NaCl), e misturar novamente invertendo dez vezes. </li><li> Deixar os tubos a temperatura ambiente durante pelo menos duas horas (se for necessário, durante a noite) para precipitar o ADN. </li><li> Centrifugar os precipitados a 13.000 xg durante 30 min à temperatura ambiente. A pelota visível devem formar. </li><li> Cuidadosamente remove-se o sobrenadante com uma pipeta e lava-se o sedimento com 500 ul de etanol a 70%. Centrifugar sob o mesmocondições para 10 minutos novamente. </li><li> Descartar o sobrenadante cuidadosamente e ar secar o sedimento à TA durante 15 min. </li><li> Redissolver o sedimento de DNA seco em 30 uL de ddH2O e misturar bem batendo ligeiramente no tubo. Quantificar o DNA em cada fração gradiente como no passo 4.3 loja as amostras a -20 ou -80 ° C, se o armazenamento de longo prazo é necessária. </li></ol></li></ol> 6. DNA Caracterização por Pyrosequencing <ol><li> Assegure-se que o ADN nativo não marcado (12 C) ocupa o intervalo de densidade de 1,705 g / ml a 1,720 g / ml, enquanto que o ADN de C-13 marcado tem uma densidade de cerca de 1,720-1,735 g / ml. Note-se que tanto o nativo e 13-C marcado de DNA extraído a partir de amostras ambientais pode abranger várias fracções do gradiente. Esperar que o ADN de luz para ser associada com as fracções 9-11 e o ADN pesado para ser associada com as fracções 4-6. </li><li> Combine frações chave para criar um único &quot;compilado&quot; ac fracção representativacordões para a atribuição de pico específico do ADN resolvido densidade. Alternativamente, outros meios para examinar as fracções separadas usando a espectrometria de massa isotópica razão isotópica (IRMS) 22 ou um método de impressão digital, como eletroforese desnaturante (DGGE) 23, pode ajudar a escolher frações apropriadas antes do seqüenciamento. </li><li> Realize pyrosequencing dos genes 16S rRNA amplificados por PCR a partir das frações pesadas, médias e leves compilados de cada gradiente individual. Usando este método, a identificação da linhagem e abundância relativa de espécies de bactérias metabolicamente activas no SIP amostras incubadas é possível. Realizar pyrosequencing como se segue: <ol><li> Realizar amplicão pyrosequencing usando um instrumento FLX Roche 454 com reagentes de titânio. </li><li> Prepare amplicons com código de barras para multiplexação usando o primer fusão definir Gray28F (5 - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) e Gray519r (5 - GTNTTACNGCGGCKGCTG -3) 24,25 estendido com the respectiva cartilha adaptador A / B e identificadores multiplex-específica da amostra (média). </li><li> Aplicar uma PCR de um passo com 30 ciclos, utilizando uma polimerase Hot Start Taq, para gerar a biblioteca de sequenciação. </li><li> Sequenciar o amplicons com base no protocolo de fornecedor, e estender a lê a frente (Gray28F) como descrito no <a href="http://www.researchandtesting.com/">http://www.researchandtesting.com/</a> . </li></ol></li></ol> 7. Análise de Dados pyrosequencing <ol><li> Analisar a seqüência cru lê gerado pelo 454 pyrosequencing com os &quot;insights quantitativos em ecologia microbiana&quot;, software QIIME oleoduto 26. Executar o processamento da seguinte forma: <ol><li> Inicialmente, converter o arquivo sff 454-máquina gerado para FASTA, QUAL e arquivos Flowgram com o script process_sff.py. </li><li> Validar o arquivo de mapeamento (baseado em check_id_map.py) e atribuir multiplexado lê para sam biológicacípios com o script split_libraries.py. Apare a baixa qualidade termina com um tamanho de janela de correr de 50 e um parâmetro de qualidade média de corte de 25, eliminar também as sequências ambíguas curtas (o comprimento &lt;200 pb) do conjunto de dados. </li><li> DeNoise dos dados 454 utilizando o denoise_wrapper.py. </li><li> Em seguida, agrupar a alta qualidade lê em unidades taxonômicas operacionais (Otus) usando o método de múltipla OTU escolher (pick_otus.py com 97% de similaridade de seqüência cut-offs). </li><li> Escolha uma seqüência representante de cada OTU usando pick_rep_set.py. </li><li> Atribuir taxonomia para o conjunto representativo seqüência com base em assign_taxonomy.py. Use o classificador Ribosomal Database Project (RDP) com uma confiança mínima para atribuição recorde de 0,80. </li><li> Alinhe a seqüência de representação instituído contra os prealigned principais seqüências 16S GreenGenes usando o algoritmo PyNast (align_seqs.pycom o mínimo seqüência identidade por cento conjunto de 75). </li><li> Além disso, esgotar quimeras de uma análise mais aprofundada, executando identify_chimeric_seqs.py. </li><li> Remova todas as posições de gap (não úteis para inferência filogenética) com o modelo lanemask (filter_alignment.py) antes da construção de uma árvore filogenética (make_phylogeny.py). </li><li> Finalmente, gerar tabelas OTU com make_otu_table.py, descrevendo a ocorrência de filotipos bacterianos dentro de cada amostra. Use a tabela de OTU para construir o mapa de calor para comparar a abundância ea atividade bacteriana. </li><li> Se necessário, calcular o alfa e beta diversidade dentro e entre as amostras, respectivamente. Da mesma forma, curvas de rarefação (gráficos de diversidade em função da profundidade de seqüenciamento) e Análise de Coordenadas Principais (PCoA) parcelas representando as relações entre comunidades microbianas pode também estar preparado. </li></ol></li></ol>

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Não temos nada a divulgar.

O intestino da maioria dos insetos abriga uma comunidade microbiana rica e complexa, normalmente 10 7 -10 9 células procariotas apresentar lá, superando as próprias células do hospedeiro, na maioria dos casos. Assim, o inseto intestino é um &quot;hot spot&quot; para diversas atividades microbianas, representando vários aspectos das relações microbianas, de patogênese para obrigar mutualismo 27. Embora muitos estudos têm descrito uma incrível variedade de comunidades microbianas do intest...

Associações simbióticas Insect-bacterianos são conhecidos por um grande número de espécies de insetos 7. Nestas associações simbióticas, microrganismos desempenham um papel importante no crescimento e desenvolvimento de insectos. Os micróbios têm sido mostrados para contribuir para a reprodução de insectos 1, feromona biossíntese 3, nutrição, incluindo a síntese de aminoácidos essenciais, 4, e a digestão de alimentos inacessível ao hospedeiro. Apesar da grande variedade de associações gut-bacteriana, muito menos se sabe sobre o papel funcional que desempenham em favor do inseto. Só no caso de as térmitas, a digestão simbiótica de lignocelulose realizada por procariotas, protozoários e fungos, tem sido amplamente estudada 8,9. Em contraste com isso, pouco se sabe sobre a associação simbiótica presente no intestino dos insetos generalistas, ou seja, o curuquerê, Spodoptera littoralis. Além disso, devido à sua mudança freqüente de plantas hospedeiras, em geralist insetos e seus intestino comunidades bacterianas associadas estão permanentemente expostos a novos desafios vinculados a seus hábitos alimentares consumir plantas com uma infinidade de fitoquímicos. Ao lado desta, o ambiente do intestino em lepidópteros, representa por si só um ambiente hostil para o crescimento de bactérias por causa do elevado pH do intestino 10. Particularmente, no caso de S. littoralis, que varia de 10,5 no intestino anterior, ca. 9 no intestino médio para um pH de cerca de 7 no intestino posterior 11. Por outro lado, a comunidade bacteriana associada com o intestino de S. littoralis é simples. Tang, Freitak, et al. 12 relataram um máximo de 36 filotipos pertencentes a um total de 7 espécies de bactérias diferentes, como os únicos membros da comunidade bacteriana associada a esse inseto. Além disso, qualquer processo de criação complicado é necessário para o crescimento dos insectos no laboratório. Além disso, este e o curto ciclo de vida do insecto facilitar multi-gestudos enerational, transformando esta espécie em um sistema modelo ideal para o estudo de interações gut-micróbio. Com o advento das tecnologias de seqüenciamento baseadas na PCR, o número de estudos que tratam de intestino biota de vários organismos (ou seja, os seres humanos, insetos, ou organismos marinhos) tem aumentado. Além disso, os resultados são independentes do isolamento e cultivo das bactérias intestinais abrigado como no passado. Quase 99% das bactérias não são cultiváveis ​​e a simulação das condições ambientais prevalecentes no intestino é difícil 12. Usando PCR, os fragmentos de genes de rRNA 16S (um gene marcador filogenético amplamente utilizado entre as bactérias) pode ser amplificado de forma selectiva um molde de ADN mista de comunidades bacterianas do intestino, sequenciados, e clonado. Com essas informações, o usuário é capaz de identificar as espécies de bactérias depois de recuperar as informações da seqüência de bases de dados públicas 13,14. No entanto, a sequenciação de abordagens para descrever bacterianacomunidades continuam a ser insuficientes, devido à falta de informações sobre a contribuição metabólica intrínseca de cada espécie dentro da comunidade. Stable-isótopo sondagem (SIP) é uma técnica sem cultura promissor. Ele é frequentemente usado em microbiologia ambiental para analisar filogenias microbianas associadas a determinadas atividades metabólicas. Isto é conseguido através do rastreamento de isótopos estáveis, marcado átomos de substratos em biomarcadores microbianos, tais como os ácidos gordos derivados de fosfolípidos, DNA e RNA de 5. Ao considerar os ácidos nucleicos, a metodologia baseia-se na separação de 13 de ADN marcado com C ou de ARN a partir do ADN não marcado por ultracentrifugação em gradiente de densidade de 6. Devido a esta ligação directa entre o marcador de ADN e actividade metabólica, uma análise molecular jusante dos ácidos nucleicos identificam as espécies e fornece informações sobre as actividades metabólicas. Além disso, a combinação de ADN-SIP e pyrosequencing como aplicado porPilloni, von Netzer, 15 et al., Permite uma identificação simples e sensível em particular da espécie bacteriana presente na 13 fracção pesada de ADN marcada com C. Até agora, esta técnica tem sido aplicada para descrever as comunidades bacterianas envolvidas em processos biogeoquímicos em solo sob aeróbicos e anaeróbicos condições 16,17 18,19. Além do uso em ciências ambientais, a técnica tem sido aplicada em ciências médicas como relatado por Reichardt, et al. 5, que descreveu as atividades metabólicas dos diferentes grupos filogenéticos da microbiota intestinal humana em resposta a um carboidrato digerível. Aqui usamos 13 C-glucose em &quot;rótulo&quot; o ADN das espécies de bactérias metabolicamente activas no intestino. A glicose é um açúcar utilizado pela maioria das espécies bacterianas, ao longo da via generalizada Entner-Doudoroff (ED), embora excepções são conhecidas 20. Estejustifica o uso de 13 C-glicose como uma sonda metabólica confiável que fornece uma ligação entre metabólitos de interesse e a fonte de carbono ao longo de caminhos estabelecidos. Dependendo da causa científica, outros substratos, ou seja, 13 C-metano, 13 CO 2, ou plantas cultivadas sob uma atmosfera de 13 CO 2, podem ser usadas para tratar as actividades metabólicas. Neste ponto, apresentamos o protocolo aplicado na caracterização metabólica da comunidade bacteriana do intestino de um inseto generalista, ou seja, S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Além disso, a técnica foi acoplada a pyrosequencing, que por sua vez permite a identificação da comunidade bacteriana do intestino de insectos, com alta resolução e precisão. Como o substrato principal, 13 C-glucose marcada foi utilizado durante os experimentos.

<table><tbody><tr><td>Fórceps de Acabamento Espelhado Dumont #5</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11251-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tesoura de Mola Vannas</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>15000-00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Concentrador de Vácuo Speed 5301</td><td>Eppendorf Alemanha</td><td>5305 000.304</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pilão de plástico</td><td>Carl Roth GmbH Co. Alemanha</td><td>P986.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoVue</td><td>GE HealthCare, Reino Unido</td><td>28-9569-58</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mastercycler pro/thermocycler</td><td>Eppendorf Alemanha</td><td>6321 000.515</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Câmara de Eletroforese em Gel Horizontal Padrão Agagel</td><td>Biometra</td><td>Descontinuada</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga (Optima L-90K)</td><td>Beckman</td><td>A20684</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotor de ultracentrífuga (NVT 90)</td><td>Beckman</td><td>362752</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bomba HPLC</td><td>Agilent</td><td>1100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de polialômero Quick-Seal</td><td>Beckman</td><td>342412</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Transiluminador UVstar 15&nbsp;</td><td>Biometra</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

identificação de bactérias metabolicamente ativas no intestino do generalista<em&gt; spodoptera littoralis</em&gt; via dna isótopos estáveis ​​sondagem usando<sup&gt; 13</sup&gt; c-glicose

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

Guts da maioria dos insetos são habitadas por comunidades complexas de bactérias não patogênicas simbióticas. Dentro dessas comunidades microbianas é possível identificar comensais ou bactérias mutualistas espécie. Os últimos, têm sido observados para servir várias funções ao inseto, ou seja, ajudar na reprodução de insetos 1, aumentando a resposta imune 2, produção de feromônio 3, bem como a nutrição, incluindo a síntese de aminoácidos essenciais 4, entre outros. Devido à importância dessas associações, foram feitos muitos esforços para caracterizar as comunidades de baixo para os membros individuais. No entanto, a maioria desses esforços foram ou baseados em métodos de cultivo ou contado com a geração de fragmentos de genes 16S rRNA que foram seqüenciados para a identificação final. Infelizmente, estas abordagens apenas identificadas as espécies de bactérias presentes no intestino e, desde que não informatião sobre a actividade metabólica dos microrganismos. Para caracterizar a espécie de bactérias metabolicamente activas no intestino de um insecto, que utilizado isótopo estável sondagem (SIP) in vivo utilizando 13 C-glucose como um substrato universal. Esta é uma técnica de cultura livre de promissor que permite a ligação de Filogenias microbianas para a sua actividade metabólica específica. Isto é possível por rastreamento de isótopos estáveis, marcado átomos de substratos em biomarcadores microbianos, tais como o ADN e ARN 5. A incorporação de 13 C isótopos para DNA aumenta a densidade do ADN marcado em comparação com a não marcado (12 C) uma. No final, o ADN de 13 C-rotulado ou RNA é separado por ultracentrifugação de gradiente de densidade a partir de 12-C sem rótulo semelhante um 6. A análise molecular subsequente dos isotopómeros ácidos nucleicos separados proporciona a ligação entre a actividade metabólica e a identidade das espécies. Aqui, apresentamos o protocolo usado para caracterizar as bactérias metabolicamente ativas no intestino de um inseto generalista (nosso sistema modelo), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). A análise filogenética do DNA foi feito utilizando pyrosequencing, o que permitiu alta resolução e precisão na identificação do intestino do insecto comunidade bacteriana. Como substrato principal, 13 C-glucose marcada foi utilizada nas experiências. O substrato foi alimentado aos insectos por meio de uma dieta artificial.

Para alcançar rotulagem suficiente das bactérias metabolicamente activas presentes no intestino do insecto, o insecto pode ser exposto ao 13 substrato rico em C, durante um período previamente optimizado suficiente para permitir a separação da fracção mais pesada marcado facilmente do não marcado mais leve. No nosso caso, 13 C-glucose foi suplementado na dieta artificial a uma concentração final de 10 mM durante 1 dia (Figura 1A). A mesma quantidade de glicose normal (Figur...

A comunidade bacteriana activa associada ao intestino de Spodoptera littoralis, foi determinada por-estável-sondagem isótopo (SIP) acoplado a pyrosequencing. Usando essa metodologia, a identificação das espécies de bactérias metabolicamente ativas dentro da comunidade foi feito com alta resolução e precisão.

Identificação de bactérias metabolicamente ativas no intestino do Generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA Isótopos Estáveis ​​Sondagem Usando<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glicose

Guts of most insects are inhabited by complex communities of symbiotic nonpathogenic bacteria. Within such microbial communities it is possible to ...

O objetivo geral do experimento a seguir é detalhar uma metodologia eficiente utilizada para caracterizar filogeneticamente as bactérias metabolicamente ativas no intestino de um inseto. Isso é alcançado primeiramente alimentando o inseto com glicose marcada com C 13, a fim de enriquecer isotopicamente o DNA das bactérias metabolicamente ativas em seu intestino. O próximo passo é extrair o DNA da comunidade bacteriana presente no intestino.O terceiro passo consiste em separar o DNA das espécies metabolicamente ativas, que incorporaram o C 13. O DNA é então identificado filogeneticamente e quantificado quanto às espécies presentes por meio de pirosequenciamento. Assim, identificam-se as espécies bacterianas metabolicamente ativas que compõem a comunidade presente no intestino do inseto.Assim, o intestino de um organismo multicelular é uma invenção engenhosa para explorar as capacidades metabólicas de microrganismos na dissolução ou solubilização de matéria orgânica complexa, de modo que possa, finalmente, servir como nutrientes para o hospedeiro inseto. Para compreender o sistema, precisamos analisar primeiro quem está presente no ambiente e, em segundo lugar, qual organismo possui quais atividades metabólicas. Se tivermos esses dados, podemos reconstruir o fluxo de metabólitos e produtos de degradação entre os microrganismos degradadores e o hospedeiro inseto.Este método pode nos ajudar a responder perguntas-chave na área de ecologia microbiana, particularmente quanto à forma como esses microrganismos interagem com seu hospedeiro. Nesse sentido, poderíamos saber mais, esclarecer e definir quais são as funções que esses organismos desempenham para seu hospedeiro. Embora este método possa fornecer informações sobre as bactérias intestinais ativas em geral.Ao rastrear a glicose marcada, o método também pode ser aplicado a outras fontes de carbono, como marcar a celulose para identificar bactérias ativas envolvidas no processo de digestão do nutriente orgânico. Mantenha os ovos e as placas de Petri em temperatura ambiente até a eclosão. Em seguida, transfira as larvas recém-eclodidas para uma caixa plástica limpa e criadas em dieta artificial a 23 a 25 graus Celsius sob regime de fotoperíodo longo com 16 horas de iluminação e oito horas de escuro. Após alguns dias, transfira de nove a 15 larvas saudáveis do segundo estágio larval da caixa de criação para placas de Petri individuais contendo glicose C13 fresca.Dieta artificial com adição de substância, são necessários pelo menos três repetições com três larvas cada por tratamento. Utilize uma dieta artificial que forneça a mesma quantidade de glicose nativa que uma fonte alimentar natural, como o algodão, para alimentar o grupo controle. Ao longo das próximas 24 horas.Renove com frequência as dietas artificiais. Comece transferindo as larvas com pinças macias para uma poça de água destilada para remover detritos grandes. Em seguida, transfira para um novo recipiente limpo para anestesiar e matar os insetos.Coloque-os sobre gelo e, em seguida, reduza a temperatura para menos cinco graus Celsius em uma caixa térmica. Em seguida, desinfete os insetos mortos com etanol a 70% e imerja-os em PBS para a dissecação. As ferramentas também devem ser limpas com etanol a 70%.Inicie com incisões na cutícula ao longo dos lados direito e esquerdo. Comece pela cabeça e finalize no ânus. Remova todo o exoesqueleto, os túbulos de Malpighi e o corpo gorduroso.Em seguida, substitua o tampão antes de abrir o intestino com o intestino isolado dos outros tecidos. Processe o intestino inteiro ou seções para o intestino médio ou intestino posterior. Dependendo da questão científica.Transfira os tecidos intestinais sem PBS para um tubo estéril pequeno e armazene-os no congelador. Antes da extração de DNA, seque as amostras a 45 graus Celsius em um concentrador a vácuo por 30 a 90 minutos, dependendo do tamanho do tecido. Em seguida, triture o tecido seco usando um bastão plástico estéril para extrair o DNA genômico utilizando um kit para extração de DNA de solo.Em seguida, determine a concentração do DNA eluído final utilizando um espectrofotômetro. Verifique a extração bem-sucedida do DNA metagenômico microbiano do intestino do inseto preparando um ensaio de PCR diagnóstico com os iniciadores bacterianos universais 27 F e 1.492 R. Para diagnóstico, execute cinco microlitros de cada produto de PCR em um gel de agarose 1% a 300 volts e 115 miliampères por cerca de 20 minutos.O tamanho correto dos amplicons é de 1,5 quilobases. Reúna o DNA extraído correspondente a cada réplica experimental. Mantenha separados os que contêm e os que não contêm glicose C 13.Normalize as concentrações de DNA para garantir que cada amostra contribua igualmente para o seu grupo. Uma concentração final de 500 a 5.000 nanogramas de DNA é adequada para o processo de ultracentrifugação. Verifique novamente a concentração esperada com o espectrofotômetro em um tubo estéril de 15 mililitros com tampa de rosca.Prepare o meio em gradiente. Combine o DNA quantificado com 4,8 mililitros de solução de cloreto de césio. Em seguida, complete o volume com seis mililitros de tampão de gradiente.Transfira cuidadosamente as misturas para tubos de ultracentrifugação de 5,1 mililitros. Com uma seringa e agulha, encha os tubos até a base do pescoço, evitando bombeamento ou formação de bolhas de ar. Inclua pelo menos um gradiente em branco sem DNA em cada corrida.Para atuar como um gradiente de referência, selecione pares de tubos e equilibre-os dentro de 10 miligramas. Aplique uma tampa a cada tubo e certifique-se de que não haja vazamentos invertendo o tubo e aplicando pressão moderada com a mão. Utilize um rotor quase vertical com oito poços.Selar cuidadosamente os poços do rotor e carregar o rotor no ultracentrífugo de acordo com as instruções do fabricante. Centrifugar o DNA a 50.000 RPM a 20 graus Celsius sob vácuo durante 40 horas. Selecionar aceleração máxima e desaceleração sem frenagem.Dois dias depois, remova cuidadosamente os tubos do rotor da centrífuga usando pinças. Coloque-os em um suporte sem perturbar os gradientes formados e processe os tubos imediatamente. Primeiro, equilibre um HPLC usando uma taxa de fluxo de 850 microlitros por minuto.Em seguida, fixe o tubo de ultracentrifugação em um suporte com braço e perfure a parte inferior do tubo com uma agulha de 23 graus e uma polegada acoplada a uma seringa. Perfure cuidadosamente a parte superior do tubo com um miner de controle para evitar perturbar a forma, o gradiente e a prática anterior para garantir um movimento bem-sucedido de PSA. A seguir, insira a agulha conectada ao tubo da bomba na parte superior do tubo, onde não há fluido, e colete as gotas diretamente em tubos Micro fuge estéreis de 1,5 mililitro; colete uma fração a cada 30 segundos, com 425 microlitros por fração.Neste exemplo, são coletadas 12 frações de cada gradiente. Em seguida, meça a densidade de cada fração separada em uma balança analítica. Prossiga com a recuperação do DNA e com o sequenciamento em pirosequenciador consultando o protocolo descrito no texto durante 24 horas.10 milimolar de glicose C13 foi suplementada na dieta de litros de ssop.Larva. A mesma quantidade de glicose normal foi adicionada ao alimento dos insetos controle. Em seguida, o DNA foi extraído da comunidade bacteriana do intestino dos insetos.Em um gel de eletroforese, uma faixa intensa de DNA genômico no topo confirmou uma extração de DNA bem-sucedida, um PCR diagnóstico. O uso de primers universais bacterianos revelou a presença de DNA bacteriano; sequenciamento pirosequencial quantitativo foi realizado diretamente nos gradientes representativos de SIP para revelar a linhagem das espécies e sua abundância relativa. Um total de 120.045 leituras de alta qualidade foi gerado com um comprimento médio de 404 OTs.O perfil de pirosequenciamento mostrou um aumento na abundância de certas espécies, incluindo Enterococcus e Panto, na amostra marcada em comparação com o grupo controle. Portanto, essas bactérias são consideradas metabolicamente ativas e merecem estudo adicional. Assim, ao realizar este procedimento, é importante lembrar de incluir um controle adequado na análise de CYP.Assim, isso subtrairia o impacto do fundo, a contaminação no flash do cabelo e garantiria que a diversidade e abundância bacterianas que aparecem ou desaparecem não sejam artefatos da própria massa. Após este procedimento, metodologias como a hibridização fluorescente in situ poderiam ser utilizadas e realizadas para responder perguntas adicionais. Nesse caso, buscar-se-ia a localização e o arranjo das bactérias no interior do intestino do inseto.

identification-metabolically-active-bacteria-gut-generalist

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

DNA estável-isótopo sondagem é um método de cultivo independente para identificar e caracterizar as comunidades ativa de microorganismos que são capazes de utilizar substratos específicos. Assimilação do substrato enriquecido em isótopo pesado leva a incorporação de átomos marcados em biomassa microbiana. Ultracentrifugação em gradiente de densidade recupera DNA marcado para jusante análises moleculares.

DNA-Stable Isotope Probing (DNA-SIP)

Profiling isotópica estável por análise de massa de gás cromatografia espectrometria de fluxo metabólico intermediário é descrito no...

Profiling isotópicas estáveis ​​de fluxo metabólico intermediário na fase de desenvolvimento e Adultos Caenorhabditis elegans</em

13 C-isótopo rotulagem é uma técnica útil para determinar o metabolismo da célula central para vários tipos de microorganismos. Depois que as células foram cultivadas com um substrato específico rotulados, GC-MS medição pode revelar vias metabólicas funcionais com base em padrões de rotulagem única no proteinogénicos aminoácidos.

Confirmação via metabólica e descoberta através 13 C-rotulagem de proteinogénicos Aminoácidos

Análises de conteúdo de intestino mais comuns de macroinvertebrados são visuais. Exigindo intenso conhecimento sobre diversidade morfológica de organismos de presas, eles falta suave rapina encorpada e, devido à forte cominuição de rapina, são quase impossíveis para alguns organismos, incluindo anfípodes. Nós fornecemos abordagens genéticas detalhadas, a novela de macroinvertebrados presas identificação na dieta de anfípodes.

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Identificação de bactérias metabolicamente ativas no intestino do Generalista Spodoptera littoralis Via DNA Isótopos Estáveis ​​Sondagem Usando 13 C-Glicose (Vídeo) | JoVE Journal

Identificação de bactérias metabolicamente ativas no intestino do Generalista

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