Name: Duração da Refeição como Medida de Respostas Nociceptivas Orofacial em Roedores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprenda a medir a duração da refeição como marcador quantitativo de dor orofacial em roedores. Este método não invasivo utiliza módulos computadorizados para monitorar comportamento alimentar contínuo em ratos.

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Neste modelo, os ratos ou ratos receberam comida e água ad libitum. O Texas A&M University Baylor College of Odontologia Institutional Animal Care and Use Committee aprovou todos os protocolos experimentais. Abaixo as configurações específicas são mostradas em itálico e são utilizadas especificamente para o modelo de artrite TMJ de rato. Os camundongos também podem ser utilizados neste modelo e podem ser utilizados modelos alternativos de dor dentária e dor miogênica orofacial, bem como42,43.
1. Configurações de software
<ol><li>Carregue o software Animal Monitor para as unidades alimentadoras no computador.</li>
	<li>O software Animals Monitor agora é aberto clicando no ícone e, na seleção do menu de arquivo, escolha a opção "configuração" pull down.</li>
	<li>Na janela "Configuração do Monitor Animal" desmarque a caixa intitulada "Entrada Entregue de Pelota"(Figura 1A). Nota: Esta caixa geralmente é verificada na fábrica por padrão. Desmarque essa opção. Uma vez que o investigador desmarque esta opção, os resultados estão sendo registrados pela remoção de uma pelota do cocho, em vez de quando uma pelota está sendo dispensada. Nota: Quando a caixa "Nomeação automática de arquivos" for verificada, o software nomeará automaticamente os arquivos(Figura 1A). Esta caixa geralmente é verificada na fábrica por padrão.</li>
	<li>Defina as luzes do temporizador para acender às 6:00 (6:00) e para desligar às 20:00 (20:00). Nota: o hardware das unidades alimentadores foi modificado para que as luzes dentro das caixas não sejam controladas pelo software, mas sejam conectadas em vez de um temporizador isolado de 24 horas. Assim, o "House Light" indicado no software de configuração não estava funcional nesses exemplos.</li>
	<li>Selecione o menu de puxar para baixo e escolha Experimentar. Aparece uma janela com o título "Caixa 01 -"(Figura 1B).</li>
	<li>Insira o nome do arquivo sob o qual os dados serão salvos nesta janela. Nota: se nenhum nome de arquivo for inserido, os arquivos de dados serão automaticamente nomeados pelo software. Detalhes do experimento podem ser adicionados nesta janela e salvos com os arquivos de dados. As informações na janela também podem ser salvas e usadas para experimentos subsequentes.</li>
	<li>Digite um número maior do que o tempo total do experimento na caixa de entrada intitulada "Comprimento do experimento (dias):". Nota: Isso garantirá que o software salve os dados até que o experimento seja concluído, um erro pode ser na definição desse valor muito curto, o que impedirá o software de registrar os dados mesmo que os animais ainda estejam nos módulos de alimentação.</li>
	<li>Digite 24 na caixa de entrada intitulada "Número de Horas em um Dia". Nota: o comprimento pode ser modificado às especificações do experimentador.</li>
	<li>Digite 10 na caixa intitulada "Critérios de término do período de refeição (min):" Nota: para ratos foi definida uma refeição utilizando-se um critério final de refeição de 10 minutos com base em estudos anteriores48 (ou seja, uma refeição foi apoiada antes e depois por um período de 10 minutos sem pelotas sendo tomadas) e o tamanho mínimo da refeição foi definido em três pelotas por refeição neste pacote de software.</li>
	<li>Digite 45 na caixa intitulada "Pellet Size (mg)". Se um indivíduo quisesse usar a entrada de ratos 20 dentro desta janela.</li>
	<li>Para ratos adicione 45 mg de pelotas de sopa de roedores ao funil do distribuidor alimentador. Nota: para ratos adicione 20 mg de pastilhas de roedores ao funil de comida.</li>
	<li>Na seção "Fase" da janela Experimentar, entre o termo Dia no campo "Nome" e no campo "# de Horas" tipo 24(Figura 1B). Nota: abaixo da seção "Fase" há dois grandes campos abertos. O primeiro grande campo aberto será povoado pelo texto inserido nos campos anteriores "Fase" e "Nome".</li>
	<li>O próximo grande campo aberto terá o cabeçalho "Fase do Dia" Entre no campo intitulado "Nome" da palavra Luz e entre no campo intitulado "Por cento" o número 60. Nota: este texto inserido irá povoar o campo grande abaixo.</li>
	<li>Em seguida, entre no campo intitulado "Nome" a palavra Escuro e entre no campo intitulado "Por cento" o número 40. Nota: com essas entradas 60% do dia serão atribuídas à fase de luz e 40% serão atribuídas à fase escura. Quando o software calcular os padrões de refeição, essas informações serão usadas. Essas configurações típicas para animais fêmeas ciclistas que são mantidos em um ciclo claro/escuro 14:10.</li>
	<li>Selecione o botão "Definir todas as caixas como esta". Salve essas informações e, em seguida, acerte OK.</li>
	<li>A tela "Start Boxes" é exibida, selecione os alimentadores para ativar e aperte OK (Figura 1C).</li>
	<li>Em seguida, as janelas de run-time do Monitor Animal aparecerão com os dados do padrão da refeição(Figura 1D). Nota: monitore e grave o "# de Pelotas Dispensadas" desta janela para determinar a saúde atual do rato. Um rato macho saudável pesando cerca de 300 g normalmente come entre 300-800 45 mgs de pelotas por dia.</li>
	<li>Os arquivos são gerados diariamente e salvos automaticamente que têm um . Extensão CSV. Abra esses arquivos para recuperar dados de padrão de refeição, como consumo de alimentos, número de refeição, duração da refeição, tamanho da refeição ou intervalo intermeal. Os intervalos para esses padrões de refeição podem ser calculados durante todo o dia ou para uma fase do dia, como a fase Escura e Luz. Como observado acima, as configurações são para um ciclo claro/escuro de 14:10. Os dados brutos de quando cada pelota foi removida do cocho também são registrados como crus . Arquivo CSV. Nota: Nas versões mais antigas do software, um tamanho mínimo de refeição de 3 pelotas não é utilizado nos cálculos para geração do . Arquivo CSV.  Além disso, para obter a duração média da refeição usando o software mais antigo você deve subtrair 10 minutos dos valores na coluna Duração média da refeição do . Arquivo CSV. Quando o software estiver operando, o operador pode selecionar manualmente a opção de puxar o menu de arquivos e selecionar diariamente "salvar dados brutos". Isso salvará os dados brutos para um período de 24 horas em vez de todo o experimento. Esses dados brutos podem ser processados por software alternativo a critério do usuário. Nota: nos resultados mostrados usamos software alternativo para incluir um tamanho mínimo de refeição de 3 pelotas.</li>
</ol>2. Ensaio de duração da refeição
<ol><li>Coloque ratos individuais nas câmaras atenuadas pelo som equipadas com alimentadores de pelotas ativados por computador de fotobeam. Nota: nestas unidades de alimentação há garrafas de água graduadas e panelas de resíduos em que uma folha de papel absorvente espesso é colocada. No funleiro do alimentador podem ser adicionadas 45 mg de pastilhas de roedores para ratos ou pelotas de 20 mg de roedores para ratos. As pelotas de chow são distribuídas em um cocho de alimentação em forma de V e na parte inferior deste cocho há um feixe de fotos. Uma pelota distribuída no cocho será detectada quebrando este feixe de fotos. Uma vez que um rato remove esta pelota do alimentador através do feixe de fotos é restaurado e isso sinaliza o computador para soltar outra pelota. A restauração do fotobeam também aciona o computador para registrar a data e a hora e mantém uma contagem de execução das pelotas dispensadas. Esta contagem de pelotas é então analisada para determinar a ingestão de alimentos, número de refeição, duração da refeição, tamanho da refeição ou intervalo intermeal durante qualquer parte do dia usando o software Med Assoc. Inc. Mais uma vez o cru. O arquivo de dados CSV pode ser analisado pelo software externo39,40,49-51.</li>
	<li>Registo o número total de pelotas comidas, a quantidade de água consumida e o peso dos animais para discernir a saúde geral dos ratos durante a experimentação.</li>
	<li>Enxágüe garrafas de água e encha com água doce diariamente e adicione comida ao funil alimentador quando necessário.</li>
	<li>Despeje a panela de lixo e o papel absorvente espesso sob a gaiola diariamente e sopre a poeira de mover parte do alimentador diariamente usando ar de alta pressão. Nota: é necessário equipamento de proteção pessoal (por exemplo, vestidos, luvas, máscaras e máscaras).</li>
	<li>Remova pisos, panelas de resíduo e garrafas de água após a conclusão do experimento e lave esses componentes. Além disso, remova os eletrônicos de alimentação da lavagem de caging à mão ou em uma lava-louças.</li>
</ol>3. Indução da Artrite TMJ
<ol><li>Coloque os animais nos alimentadores pelo menos 4 dias antes da experimentação. Nota: esses dados serão relatados como pré-dias para obter um comportamento de alimentação de linha de base. Em seguida, os animais são removidos do alimentador para tratamento. Um tipo de tratamento foi induzir um TMJ artrítico. Para este modelo, os ratos são injetados com adjuvante completa de Freund (CFA) às 08:00 (ou seja, início da fase de luz) depois que os ratos são anestesiados com isoflurano (fluxo de 5%).</li>
	<li>Injete 250 mg de CFA em 50 L bilateralmente no espaço periarticular de cada TMJ. Nota: no exemplo (Figura 2) 250 mgs de CFA em 50 L foram injetados em cada TMJ, mas doses tão baixas quanto 10 mgs em volumes tão pequenos quanto 15 μl são eficazes em períodos mais curtos de tempo52.</li>
	<li>Controle de injeção ratos TMJ com 50 L de 0,9% salino. Nota: todos os animais foram móveis dentro de 5 minutos ou menos após a indução da anestesia. No caso de uma dose menor de CFA ser dada em menor volume, os ratos de controle receberiam esse mesmo volume de soro fisiológico.</li>
</ol>

Não há nada para revelar.

Pacientes com dor orofacial relatam aumento da dor com aumento do tempo de mastigação, de tal forma que, o ciclo de mastigação alonga quanto mais tempo o indivíduo vem mastigando45,53-56. Nosso ensaio comportamental permite testes semelhantes em ratos e camundongos ao medir a duração da refeição39. Um estudo recente não publicado sugeriu que os testes de filamento de von Frey tiveram maior sensibilidade do que as medidas de duração da refeição, mostrando uma mudança significativa por um período mais...

Modelos animais têm sido utilizados para estudar dor e nocicepção associadas a danos orofaciais e ou inflamação1,2, mas a falta de modelos animais adequados resulta em uma compreensão incompleta dos mecanismos. Embora os modelos atuais nos ajudem a entender vários mecanismos envolvidos na dor orofacial aguda e crônica, existem pontos fortes e fracos nesses modelos animais.
Muitos modelos medem respostas nociceptivas comportamentais por curtas durações. O preparo facial é uma resposta comportamental conhecida após a constrição dos nervos faciais3. Outros estudos mediram a esfregação facial com o antebraço ipsilateral ou o lábio traseiro, bem como, o vacilo da cabeça após a administração de injeções de formalina na articulação temporomandibular (TMJ) ou lábio4-7. As latências de retirada da cabeça são outro modelo para medir o comportamento nociceptivo onde um medidor de analgesia de movimento de cauda modificado é usado para quantificar a resposta nociceptiva (ou seja, retirada da cabeça) após aplicar calor na almofada de vibrissae raspada de um rato8. A atividade muscular digastrica e masseter também foi registrada como uma correlação de dor após injeções de glutamato no TMJ9. Outro estudo mediu mudanças nos parâmetros do sono para avaliar respostas nociceptivas em ratos do sexo masculino e feminino com TMJ inflamado, esses parâmetros incluíram latência do sono, movimento rápido dos olhos (REM), porcentagem de sono não-REM e percentual de sono REM10. A maioria dos modelos animais que medem respostas nociceptivas comportamentais utilizam um curto período de tempo, ou seja, minutos para horas por dia11-14. Além disso, a maioria dos testes de modelos animais ocorre durante a fase de luz e em um animal noturno, como um rato, isso pode causar estresse que pode confundir os resultados nociceptivos15-18. Os ensaios acima medem a resposta nociceptiva em condições orofaciais variadas, mas por curta duração e, portanto, só podem ser usados para estudar distúrbios agudos. Um ensaio alternativo tem usado a expressão facial como medida de nocicepção de duração moderada, mas essa metodologia pode ser subjetiva19.
Para avaliar a nocicepção orofacial persistente ou crônica, alguns utilizaram a aplicação de um filamento von Frey na superfície da pele para avaliar a sensibilidade mecânica de animais submetidos à constrição nervosa ou inflamação TMJ3,20. Liverman et al. 2009 mediram as respostas de abstinência usando monofilamentos classificados após injeções de CFA no músculo masseter de ratos 21,22. Yamazaki et al. 2008 injetaram o TMJ com CFA e, em seguida, ao longo de 14 dias quantificaram comportamentos nociceptivos para estimulação mecânica ou térmica ou fria aplicada sobre a região do TMJ. Infelizmente, esses ensaios comportamentais nociceptivos envolvem a contenção animal, que produz hormônios do estresse, aprendizado ou comportamentos alternativos que podem interferir nos desfechos medidos.
Modelos para medir o nociception em dentes utilizam o reflexo de abertura da mandíbula, mas este método pode ser não confiável23 ou impreciso24. A atividade eletromiográfica tem sido usada para medir a nocicepção do dente25,mas este método normalmente exige que o animal esteja inconsciente, embora em um estudo a nocicepção do dente tenha sido investigada em ratos em movimento livre26. Em 2008, Khan estudou a relação entre nocicepção dentária e função mastigatória usando um medidor de tensão sensível27, mas este modelo de duração da mordida requer a restrição do animal da atividade normal 28. A força da mordida é uma medida confiável de dor dentária em humanos, mas porque os ratos requerem treinamento e/ou contenção para medir a força da mordida uma fonte de estresse é introduzida que pode produzir achados com significado fisiológico questionável29-31
Algumas limitações de contenção e estresse podem ser superadas usando um desenho operante para avaliar comportamentos nociceptivos. Um modelo operante usa evitar uma temperatura desconfortável para avaliar e caracterizar nocicepção orofacial32-35. Este modelo de conflito de recompensas é baseado em uma recompensa de leite adoçado para induzir o roedor a posicionar seu rosto voluntariamente contra uma sonda térmica aquecida ou resfriada34,36. No entanto, o teste requer treinamento em animais, mas uma força do ensaio é que os dados são coletados de forma automatizada.
Outro modelo animal usou disfunção de roer induzida pela nocicepção como índice de nocicepção orofacial37. No entanto, o roedor está confinado a um tubo e sua única fuga é roer através de um dowel para sair. Uma vantagem deste modelo é que ele mede a função da mandíbula após lesão aguda ou crônica da mandíbula em camundongos. No entanto, o roedor está confinado, o que adiciona um comportamento de competição alternativa confuso, ou seja, fuga, o que seria estressante e, portanto, poderia influenciar os resultados do ensaio de não-concepção.
A duração da refeição tem sido usada para medir a nocicepção em animais com artrite TMJ38-41,exposição à polpa dentária42e dano muscular43. Um roedor que experimentou nocicepção orofacial comeu mais lentamente depois que o animal iniciou uma refeição. Pacientes que experimentam dor de TMJ também demoram mais para mastigar seus alimentos e o comprimento do ciclo diminui quando a dor do TMJ é diminuída44-46. Espera-se que o alongamento da duração da refeição quando a dor do TMJ esteja presente seja um "comportamento de guarda", operacionalmente definido como comportamento nociceptivo47.
A duração da refeição mede a nocicepção TMJ usando um método não invasivo por até 19 dias em ratos machos e fêmeas e 6 dias (período mais longo testado) em camundongos machos e poderia ser descrito como um marcador biológico de nocicepção38-41. Em apoio à medida que a duração da refeição mede as respostas nociceptivas, a nocicepção pode ser reduzida por intervenção farmacológica fazendo com que a duração da refeição do animal volte ao normalde 38,40,41. Isso também foi confirmado quando neurônios nociceptivos foram destruídos usando capsaicina; após a destruição nervosa, a duração da refeição dos animais não foi aumentada após a injeção de CFA no TMJ 40.
Abaixo está o protocolo sobre como obter e analisar estatisticamente os dados de duração da refeição.

<table><tbody><tr><td>Software de Monitor Animal</td><td>Med Assoc. Inc</td><td>SOF-710</td><td>East Fairfield, VT</td></tr><tr><td>Pellets de Precisão Sem Poeira, Roedores, à Base de Grãos&nbsp;</td><td>Bio-Serv</td><td>F0165</td><td>45 mg pellets, 50,000/caixa</td></tr><tr><td>Pellets de Precisão Sem Poeira, Roedores, À Base de Grãos&nbsp;</td><td>Bio-Serv</td><td>FO163</td><td>20 mg pellets</td></tr><tr><td>Adjuvante completo de Freund</td><td>Chondrex, Inc.</td><td>7001</td><td>Nenhum loger fornece a concentração de 5 mg/ml.&nbsp; Pode usar CFA de outras fontes, desde que o investigador use consistentemente essa fonte</td></tr></tbody></table>

duração da refeição como medida de respostas nociceptivas orofacial em roedores

Meal Duration as a Measure of Orofacial Nociceptive Responses in Rodents

Um alongamento na duração da refeição pode ser usado para medir um aumento da hiperalgesia mecânica orofacial com semelhanças com o comportamento de guarda dos seres humanos com dor orofacial. Para medir a duração da refeição, ratos sem restrições são continuamente mantidos em módulos de alimentação atenuados e informatizados por dias a semanas para registrar o comportamento alimentar. Estas câmaras atenuadas ao som são equipadas com distribuidores de pelotas de chow. O dispensador tem um cocho de pelotas com um feixe de fotos colocado na parte inferior do cocho e quando um roedor remove uma pelota do alimentador por este feixe não está mais bloqueado, sinalizando o computador para soltar outra pelota. O computador registra a data e a hora em que as pelotas foram retiradas do cocho e a partir destes dados o experimentador pode calcular os parâmetros da refeição. Ao calcular os parâmetros da refeição, uma refeição foi definida com base em trabalhos anteriores e foi fixada em 10 minutos (ou seja, quando o animal não come por 10 minutos que seria o fim da refeição do animal) também o tamanho mínimo da refeição foi fixado em 3 pelotas. A duração da refeição, o número da refeição, a ingestão de alimentos, o tamanho da refeição e o intervalo entre as refeições podem então ser calculados pelo software por qualquer período de tempo que o operador desejar. Dos parâmetros de alimentação que podem ser calculados a duração da refeição tem se mostrado um marcador biológico contínuo não invasivo de nocicepção orofacial em ratos machos e ratos e ratos fêmeas. As medidas de duração da refeição são quantitativas, não exigem treinamento ou manipulação animal, requerem participação cortical e não competem com outros comportamentos induzidos experimentalmente. Esses fatores distinguem este ensaio de outros métodos operísticos ou reflexos para gravação de nocicepção orofacial.

A duração da refeição é uma correlação comportamental da dor orofacial e as medidas de duração da refeição foram aplicadas em animais com artrite TMJ(Figura 2) e cárie dentária(Figura 3). Em um experimento, os ratos tiveram artrite TMJ após administrar uma alta dose de 250 mg de CFA e este tratamento induziu um aumento significativo na duração da refeição por 19 dias(Figura 2). Uma dose menor de CFA (10 mg) injetada em cada junta TMJ produziu um aumento menor na duração ...

Um alongamento na duração da refeição representa o comportamento orofacial nociceptivo em roedores semelhante ao comportamento de guarda dos seres humanos com dor orofacial. Comer é um comportamento que não requer treinamento ou manipulação animal, requer participação cortical, e não está competindo com outros comportamentos induzidos experimentalmente, distinguindo este ensaio de reflexos alternativos ou medidas operárias.

Duração da Refeição como Medida de Respostas Nociceptivas Orofacial em Roedores

A lengthening in meal duration can be used to measure an increase in orofacial mechanical hyperalgesia having similarities to the guarding behavior of ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar que as medidas de duração das refeições são um correlato quantitativo da dor na mandíbula e nos dentes. Isso é realizado primeiramente colocando as ratas nas gaiolas alimentadoras para obter uma medida de referência da duração das refeições. Após a obtenção das medidas de referência, um agente indutor de dor é injetado na articulação temporomandibular ou na articulação do joelho como controle.Após a injeção, o animal é devolvido à gaiola alimentadora e o comportamento alimentar é observado até retornar aos níveis basais. Por fim, os dados são coletados e analisados para demonstrar que os animais com dor na mandíbula apresentam durações maiores das refeições. Existem muitas vantagens em utilizar a duração das refeições e os padrões alimentares para analisar a dor em modelos roedores, mas consideramos que duas das principais vantagens deste modelo, em comparação com outros tipos de modelos, são o fato de não precisarmos restringir os animais, nem de o animal precisar ser treinado.Alguns anos atrás, observamos que não havia um bom método para medir a dor orofacial em um modelo animal. Isso nos levou a explorar a possibilidade de que a a

meal-duration-as-measure-orofacial-nociceptive-responses

Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Poupado do Nervo modelo animal de lesão é descrita aqui como um modelo do rato da dor neuropática periférica seguintes denervação parcial do nervo ciático por a lesão do tibial e nervo peroneal comum ramos, deixando o nervo sural restante intacto. Modificação comportamental resultante da alodinia mecânica é quantificada por filamentos de von Frey.

Poupado da lesão do nervo Model (SNI) de alodinia mecânica induzida em camundongos

Este vídeo demonstra a indução de dor neuropática orofacial em um modelo de rato pela ligação do nervo infraorbital. Isso resulta em danos e inflamação nos nervos, causando sinalização anormal da dor e mimetizando condições de dor crônica, que podem ser usadas para estudar o ensaio de dor orofacial.

Induzindo dor neuropática orofacial em um modelo de rato por meio de ligaduras nervosas infraorbitais

Apresentamos um sistema operante user-friendly, de alto rendimento para a avaliação dos comportamentos de dor em Despertai, roedores conscientes. O Dispositivo de Avaliação de Dor Orofacial (OPAD) pode avaliar a dor através de um paradigma de recompensa / conflito proporcionando assim uma forma mais humana de testes. Este protocolo irá produzir dados mais relevantes clinicamente e translacional a partir de roedores.

O uso do dispositivo de Avaliação de Dor Orofacial operante (OPAD) para medir as mudanças no comportamento nociceptivo

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Avaliação da hiperalgesia induzida por morfina e analgésicos Tolerância em ratos usando térmicas e mecânicas nociceptivos Modalidades

Neste artigo nós fornecemos detalhes para os métodos de produção e controle de qualidade de uma proteína de fusão recombinante IL4-10. Também mostramos como testar a eficácia desta proteína para resolver a dor em um modelo do rato da dor inflamatória.

Desenvolvimento de proteínas recombinantes para tratar a dor crônica

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Desenvolvimentos recentes na pesquisa da dor destacam o potencial da fotoneuromodulação usando diodos emissores de luz verde (GLED) como tratamento não farmacológico. O GLED modula as vias da dor, oferecendo alívio eficaz da dor. Este artigo tem como objetivo padronizar e refinar os protocolos de exposição ao GLED, melhorando a consistência entre os estudos e avançando na aplicação clínica dessa terapia.

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