Name: Microinjeção Ferida Ensaio e In vivo Localização de Epidermal Wound resposta Jornalistas em Drosophila Os embriões. (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T21:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprenda a visualizar a resposta epidérmica a ferimentos em embriões de Drosophila usando microinjeção e microscopia confocal. Este método permite analisar a expressão gênica em tempo real durante a cicatrização tecidual.

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Este protocolo foi desenvolvido em colaboração com os membros anteriores do Lab McGinnis, Kim A. Mace e Joseph C. Pearson. Agradecemos aos contínuos esforços do Bloomington Drosophila Stock Center para o seu trabalho de organizar e distribuir os estoques valiosos. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do National Institutes of Health (R01 GM077197 e K12 GM68524) ea família de Herbert Stern. MTJ é actualmente suportado por Grant Número 5G12RR003060-26 a partir do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos e Número Grant 8G12MD7603-27, do Instituto Nacional de Saúde da Minoria e Saúde Disparidades. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do Instituto Nacional contra a minoria de Saúde e Saúde Disparidades ou o National Institutes of Health.

O protocolo ferida embrionário Drosophila pode ser resumido em cinco etapas: (1) coleta de embriões, (2) Preparação de Embriões (3) Embrião ferir, (4) microinjeção de embriões, e (5) Fixação de embriões. 1. De colheita de embriões <ol><li> Colete moscas adultas, 2-3 dias após eclosing, adicionar 50 fêmeas e 25 machos para uma gaiola de colheita de embriões. </li><li> Coloque um ágar suco de maçã fresca, mais placa de levedura, todas as manhãs, durante 3 dias. Notas: Para coleta de embriões ideal, ciclo das moscas em uma programação diurna de 12 horas em uma incubadora de 25 ° C (05:00 luzes &quot;ON&quot; e 17:00 luzes &quot;OFF&quot;); moscas fêmeas responder às mudanças no ciclo de luz e irá depositar grandes quantidades de ovos durante um interruptor das luzes &quot;ON&quot; para luzes &quot;OFF&quot; 10,11. </li><li> Na tarde do dia-3, coloque um suco de maçã fresco mais levedura placa de ágar na gaiola e coletar embriões para 2 horas. Coloque uma nova placa de levedura na gaiola e salvar o2 prato de coleta hr. </li><li> Armazenar a placa de recolha para uma 14 horas adicionais a 25 ° C a idade dos embriões. Notas: Cicatrização de feridas podem ser ensaiadas em qualquer fase de desenvolvimento da Drosophila, os repórteres de transcrição induzida por ferimentos descritos neste documento têm uma atividade ótima entre os estágios 15-16 dezembro. No final de estágio 17, o embrião é velho demais para furar facilmente a cutícula amadurecendo e ativar de forma eficiente os repórteres da ferida ou detectar a transcrição induzida pela ferida. Para permitir que o tempo de coleta eo tempo de ferir a ocorrer durante o horário de pico de laboratório, seguimos um cronograma de colheita de embriões para 2 horas (16:00-18:00), trocar a placa de coleção com um novo prato, às 18:00, a idade o prato de coleta, a 25 ° C, durante 14 horas (overnight), e ferindo os embriões às 08:00 (dia seguinte). </li></ol> 2. Preparação de embriões Notas: Este protocolo inclui o uso de muitas ferramentas e objetos que são nítidas ou feitas de gmoça. Manuseie todos os farelos e objetos de vidro com cuidado para evitar ferimentos. <ol><li> Remova cuidadosamente os embriões a partir de chapas de cobrança com um pincel, adicionando 2-3 ml de água para a chapa e de roda. Água e embriões Transferência de placa para malha de nylon e tubo de coleta. </li><li> Adicionar 4-5 ml de água sanitária para a tampa de uma placa de Petri prato de plástico e mergulhe a extremidade coberta malha do tubo de coleta contendo os embriões em água sanitária por 2 min, o que elimina a casca externa do embrião. Gire manualmente o tubo de coleta de um par de vezes para evitar que os embriões se aglomerem na lixívia. Enxágüe embriões com 10x de água e secar o tubo de coleta de malha coberta contendo os embriões dechorionated sobre uma toalha de papel. </li><li> Use uma agulha de dissecação para transferir ~ 50 embriões a partir de malha de nylon para uma placa de ágar. Nós adicionar corante alimentar verde para a placa de ágar para adicionar contraste e ajuda no alinhamento embrião. Sob um microscópio de dissecação, fazer duas fileiras paralelas de ~ 25 embriões, alinhando a embryOS no slide para que eles estarão em ângulo reto com a agulha de punção sobre o aparelho de microinjeção. Deixe um pouco de espaço (cerca de 1 embrião comprimento) entre os embriões para fins de troca gasosa. As duas linhas paralelas devem ser aproximadamente 5 mm. </li><li> Coloque um slide com fita dupla pau em cima dos embriões alinhados e pressione cuidadosamente o slide para transferir embriões a partir da placa verde para o slide. Em seguida, o ar seco os embriões ~ 25 min para reduzir a pressão interna sobre o embrião e evitar uma explosão quando ferindo. </li><li> Coloque 2-3 gotas de óleo de mistura de hidrocarbonetos halogenados sobre os embriões para evitar uma maior desidratação. </li></ol> 3. Embrião Wounding <ol><li> Coloque o slide embrião no estágio do microscópio injeção. Encontrar os embriões no campo de visão e pratica mover a fase de microscópio invertido. Notas: Antes de trabalhar com a agulha, se concentram em plano médio do embrião ao longo do eixo dorso-ventral. Para permitir o ferimento eficaz doembriões alinhados, começam ferindo a linha mais próxima do aparelho de agulha. Mover a etapa de levar a parte superior da linha de embriões alinhados no campo de visão. </li><li> Cuidadosamente colocar e fixar uma agulha puxado no porta-agulha. Use o micromanipulador para mover a agulha para baixo em direção slide. Alinhar a agulha com o embrião, no mesmo plano focal. Uma vez que a agulha está em foco com o embrião, não mova a agulha com o micromanipulador. </li><li> Mova o palco para perfurar o embrião por completo, em seguida, passar para a próxima embrião na linha. Quando terminar ferindo a primeira linha, use o micromanipulador para mover a agulha totalmente para cima e longe do palco, antes de passar a lâmina; rodar manualmente o slide 180 º e acabou a segunda fila. </li><li> Guarde os embriões sob óleo halocarbono à temperatura ambiente e proceder com a fixação do embrião, se fazendo de hibridização in situ ou coloração de anticorpos (ver Procedimento passo 5). Alternativamente, armazene os embriões para 4-6 hrsob óleo halocarbono e prosseguir com a visualização repórter fluorescente transcricional da ferida (resultados representativos). Notas: Para a visualização do repórter fluorescente, que anestesiar os embriões utilizando 50% de 1-fenoxi-2-propanol 13. Os embriões são retirados do óleo de hidrocarbonetos halogenados e colocado sobre uma nova lâmina. Colocamos contas de vidro em torno dos embriões, adicione algumas gotas de anestésico, e coloque uma lamínula sobre os embriões. </li></ol> 4. Embrião microinjeção Notas: O aparelho de microinjeção que usamos no protocolo não é automatizado para entregar volume específico durante o ensaio. Nós adicionar um corante para a solução de visualizar a microinjecção e tentar normalizar o volume entregue. Se demasiado solução é injectada no embrião, a membrana vitelina vai rebentar. <ol><li> Agulha de carga a partir da retaguarda, com 1 ml de solução química, mais corante (por exemplo, de 0,6 MH 2 O 2). Permitir capilaracção de introduzir a solução química para a ponta da agulha. </li><li> Para quebrar uma agulha, coloque uma lamínula em um ângulo em um slide e um casaco a borda com a mistura de óleo de hidrocarbonetos halogenados. Traga a agulha montada em foco com a borda da lamínula angular e gentilmente mover borda tampa de deslizamento através da ponta da agulha até quebrado. Aplique pressão no aparelho de microinjeção e verifique se a solução química além de corante está fluindo para fora da agulha. </li><li> Coloque o slide contendo embriões alinhados no palco microscópio. Continuar a concentrar-se o embrião e a agulha no mesmo plano. Simultaneamente perfurar e solução química microinject mais corante em cada embrião. Notas: agulhas entupidos ocorrem com freqüência; quebrar uma agulha nova para evitar microinjeção incompleto. A ponta da agulha sem corte não acabou tão limpa quanto uma ponta de agulha em ângulo. Ajustar a lamela para um não-ângulo de 90 ° durante a ruptura é ideal para produzir uma ponta de agulha em ângulo. </li></ol> 5. Formaldeído Fixation Notas: Os produtos químicos utilizados neste fixação Drosophila são prejudiciais. Usar equipamento de protecção individual (por exemplo, luvas, casaco de laboratório e óculos de segurança) ao manusear produtos químicos. Siga as orientações institucionais individuais para descarte de produtos químicos regulamentados. <ol><li> Depois de ferir, esperar 15, 30, 60 ou mais minutos para a ativação da transcrição de genes induzidos por ferida para ocorrer. Para remover embriões a partir de lâminas de injeção, escorra cuidadosamente a mistura de óleo de hidrocarbonetos halogenados dos slides, inclinar a lâmina contra um rack e apagar o final com um Kimwipe. </li><li> Use uma pipeta de vidro para lavar heptano sobre a lâmina e lavar o líquido de lavagem em uma placa de Petri de vidro. Heptano irá dissolver a fita e libertar os embriões. Continuar a enxaguar até que todos os embriões são removidos a partir do slide. Avance para o próximo slide, até que todos os embriões são removidos slides. </li><li> Transfira o heptano e solução embrião do prato de vidro em um sci 20 mlfrasco ntillation. Agitar o frasco para 2-3 min, retire o heptano e adicionar 5 ml de heptano fresco. </li><li> Adicionar 5 ml de fresco, a solução de fixação (ver lista reagentes para a receita). Tampe o frasco e anexar a um agitador de plataforma orbital. Agitar o frasco contendo os embriões durante 25 minutos a 220-230 rpm. </li><li> Após agitação, deixe que as bolhas no pop interface. Remover completamente a fase inferior, aquosa com uma pipeta, evitando puxar para cima os embriões. A camada inferior é constituída por a solução de fixação e deve ser descartado de forma apropriada. </li><li> Adicionar 5 ml de metanol, tampar o frasco e agitar vigorosamente à mão por 20-30 seg, redemoinho e colocá-lo no banco. Embriões Feridos vai ficar no interfase e não vão para o fundo. Notas: Após a fixação da membrana vitelina de um embrião sem ferimentos normalmente estourou durante a etapa de desidratação com metanol. No entanto, a membrana vitelina em um embrião ferida já é quebrada e o passo de desidratação não irá remover o memb vitelinaRane. Mão-devitellinzation é necessário para completar o protocolo de fixação. </li><li> Com cuidado, retire a camada de heptano superior e, em seguida, adicionar 5 ml de metanol fresco. Agitar o frasco e os embriões devem afundar. </li><li> Remover o metanol e solução embrião com uma pipeta de vidro e recolher em um tubo de coleta de malha de nylon em um prato de vidro. </li><li> Remover o metanol e lavar os embriões com uma solução de PBS 1x. </li><li> Transferir os embriões a partir da malha de nylon para uma placa de sumo de maçã. Espalhe os embriões fora ao longo da superfície da placa. </li><li> Transferir os embriões para uma lâmina de vidro fita dupla vara. Cobrir os embriões com 1x PBS. Notas: Os embriões tendem a aglutinar-se por causa da membrana vitelina. Usando um local suco de maçã permite a separação rápida dos embriões agregada. Os embriões devem ser removidos a partir da placa e transferidas para uma lamela de vidro de fita de dupla face, porque os embriões afundar na placa de ágar, quando é aplicada força para remover o embrião amembrana vitelina. </li><li> Empurre cuidadosamente os embriões com uma agulha de dissecação de &quot;pop&quot; a membrana vitelina. O embrião deve afundar no PBS. </li><li> Usar uma pipeta para transferir o vidro 1x PBS mais embriões para um tubo de 1,5 ml. Lavar os embriões com PBS 1x e armazenar a 4 ° C. Prossiga para desidratar os embriões utilizando uma Etanol: Série PBS e continuar com a hibridização in situ ou protocolo imunolocalização 14. </li></ol>

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Uma resposta regulatória transcricional imediato a estímulos externos permite que as células para coordenar uma resposta localizada a estímulos extracelulares, que podem incluir o estresse, dano ou infecção. O controle indevido de uma resposta localizada pode ter efeitos nocivos sobre as células vizinhas, bem como um desperdício de recursos para reparar a lesão. O embrião Drosophila fornece um sistema excelente para conduzir experimentos básicos cicatrização de feridas em um modelo de manter fácil organismo barato e. O potencial para a colaboração entre a investigação em outros organismos modelo e Drosophila oferece uma oportunidade única para explorar muitas questões biológicas. Uma técnica adicional dos repórteres da ferida é a combinação genética de fundos mutantes, fornecendo um método eficiente para testar a contribuição de novos genes para a ativação da via de resposta epidérmica ferida. Temos repórteres transcricional induzida por feridas epidérmicas avdisponív eis tanto no 2 º e 3 º cromossomos 5. Neste estudo utilizamos UAS e sistemas GAL4 de superexpressão 16. Para os estudos com alelos mutantes letais determinamos a base genética usando um cromossomo balanceador fluorescente, por exemplo Kruppel-GFP 17. Analisamos a localização ferida repórter em diversas origens genéticas (Tabela 1). Uma possível modificação da técnica é combinar microinjeção e ferimento. Microinjecção pode ser utilizado para introduzir uma solução química para o embrião. Vários compostos químicos foram testados e verificou-se a regular a actividade dos repórteres epidérmico ferida 9. Este método de ferimento simultânea e microinjecção pode ser útil para aumentar o número de células no embrião de Drosophila que respondem um sinal ferida e pode ser usado directamente para controlar expressão de genes alterações após o ferimento 18. A futura aplicação da técnica de microinjeção será testar novas substâncias químicas para a regulação da resposta epidérmica ferida. Drosophila como sistema modelo para os estudos genéticos oferece uma ampla variedade de protocolos simples para tratar eficazmente questões complexas. As recentes notícias sobre a viabilidade das técnicas de Drosophila destaca o uso de hemocyte migração 19 e infecção parasitária vespa 20 como uma forma de ampliar ainda mais o impacto da comunidade de pesquisa Drosophila. Em adição aos estudos de reparação de feridas, Drosophila fornece um modelo clássico para a regeneração com o sistema de disco imaginal 21,22. Os avanços combinados em estudos de regeneração de discos imaginais e punção / microinjeção ferimento oferece um excelente sistema para descobrir componentes bem conservadas da reparação tecidual.

A manipulação de embriões de Drosophila, utilizando uma técnica de microinjecção é um ensaio bem estabelecido 1. O significado do método epidérmico ferida resposta repórter é combinar o protocolo para a punção / microinjecção com repórteres fluorescentes e visualizar a resposta in vivo a lesão epidérmica em embriões de Drosophila. O objetivo deste método é permitir que um conjunto mais amplo de cientistas usem Drosophila como uma ferramenta para investigar os processos que regulam a resposta transcricional a lesão punção epidérmica. A epiderme de camada única em Drosophila fornece um sistema simples para estudar uma resposta epidérmica ferida após uma lesão punção 2. O embrião de Drosophila é um sistema modelo robusto para dissecar geneticamente as fases de cicatrização de feridas, incluindo a resposta de feridas, inflamação e reepitelização 3. Isto é em parte porque muitos ou a maioria zigóticos mutantes sobreviver ao fim de embryogenesé e desenvolver barreiras epidérmicas mesmo quando padrões de desenvolvimento vai profundamente errado. Caracterização anterior de um factor de transcrição cabeça Granulado bem conservada (Grh), identificou-se que os genes-alvo Grh Dopa descarboxilase (DDC) e hidroxilase de tirosina (PLE) são transcricionalmente activados em torno dos locais de lesão 4. Drosophila como organismo modelo para a resposta de ferida fornece uma linha complementar de investigação para avançar os estudos em mamíferos cicatrização de feridas 5. Estudos subsequentes identificados genes adicionais induzidas por ferida de Drosophila e desenvolveu um &quot;kit&quot; de muitas feridas repórteres fluorescentes para monitorizar a resposta in vivo epidérmico ferida para limpar ferindo 6. As recentes notícias sobre a regulação da cicatrização de feridas Drosophila têm-se centrado no fenótipo fechamento da ferida, permitindo a descoberta de muitas vias que regulam a migração de células 7,8. Com a análise darepórteres fluorescentes ferida, os nossos estudos têm identificado um novo conjunto de genes necessários para a expressão de genes localizados ferida induzível epidérmicas 9. Um dos méritos do método repórter resposta ferida é que os resultados fornecer mais detalhes sobre um mecanismo de como os sinais são transduzidas do local da lesão às células vizinhas. No entanto, um dos pontos negativos do método repórter resposta ferida é que os resultados não ligar diretamente para fenótipos na cicatrização de feridas ou reparo. Uso mais amplo do protocolo punção ferida limpa em telas genéticos e químicos permitirá novos reguladores da resposta transcricional a epidérmicas ferindo ser identificados e promover a tradução de cicatrização de feridas descobertas em modelos de mamíferos de tratamentos de lesões.

<table><tbody><tr><td>levedura</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51475</td><td></td></tr><tr><td>suco de maçã</td><td>Ágar genérico</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>50-824-297</td><td></td></tr><tr><td>alvejante</td><td>Óleo halocarbônico genérico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 700 W</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>óleo halocarbono, 27 W</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>1- fenoxi-2-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484423</td><td></td></tr><tr><td>peróxido de hidrogênio</td><td>Fisher Scientific</td><td>H324</td><td></td></tr><tr><td>metil-&beta;-ciclodextrina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>azul de toluidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>formaldeído, 16%</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18814-20</td><td>heptano químico tóxico</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td>químico tóxico</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td>produto químico tóxico</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90013</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-255-956</td><td></td></tr><tr><td>RNase livre H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2819-100</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila incubadora</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-197</td><td></td></tr><tr><td>gaiola de mosca</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>tubo de coleta de embriões</td><td>Genessee Scientific</td><td>46-101</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-037</td><td></td></tr><tr><td>fita dupla face</td><td>Genérico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pincel</td><td>Genérico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>agulha de dissecção</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965A</td><td></td></tr><tr><td>lamínula de cobertura de vidro</td> para objetos cortantes <td>Thermo Scientific</td><td>3306</td> lâmina de microscópio <td>para objetos cortantes</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>microscópio de dissecação</td> de objetos cortantes <td>Carl Zeiss</td><td>Stemi-2000</td><td></td></tr><tr><td>agulha capilar</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>objeto</td></tr> <tr>cortante<td>extrator de agulha</td><td>Narishige</td><td>PC10</td><td></td></tr><tr><td>porta-agulha de microinjeção</td><td>Narishige</td><td>MINJ4</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MN151</td><td></td></tr><tr><td>microscópio invertido</td><td>Carl Zeiss</td><td>Primo-Vert</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A</td> objeto <td>pontiagudo</td></tr><tr><td>de vidro Pipeta Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-063-172</td><td></td></tr><tr><td>lâmpada de transferência de</td> objeto cortante <td>Fisher Scientific</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>frasco de cintilação</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7</td> agitador orbital <td>de objeto cortante</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>14-259-260</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr> solução <tr>confocal de fixação <td>Leica</td><td>SP2</td><td></td><td>de varredura a laser</td></tr> <tr><td></td><td>(5 ml)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>16% formaldeído</td><td>2,5 ml</td><td></td><td>químico tóxico</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>0,5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EGTA</td><td>0,5 ml</td><td></td><td></td></tr> livre <tr><td>de RNase H2O</td><td>1,5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mistura de óleo halocarbônico</td> <td>(10 ml)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>óleo halocarbônico, 700 W</td><td>5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>óleo halocarbono, 27 W</td><td>5 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microinjeção ferida ensaio e<em&gt; in vivo</em&gt; localização de epidermal wound resposta jornalistas em<em&gt; drosophila</em&gt; os embriões.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

O embrião de Drosophila desenvolve uma camada epidérmica robusto que serve tanto para proteger as células internas a partir de um ambiente externo dura, bem como para manter a homeostase celular. Ferimento de punção com agulhas de vidro proporciona um método directo para desencadear uma resposta rápida de feridas epidérmicas que activa ferida repórteres de transcrição, que podem ser visualizadas através de um sinal repórter localizada em embriões vivos ou larvas. Punção ou laser lesão também fornece sinais que promovem o recrutamento de hemócitos no local da ferida. Surpreendentemente, grave (através de e) ferimento de punção em embriões de fase tardia apenas raramente perturba o desenvolvimento embrionário normal, tal como mais de 90% dos embriões feridos sobreviver à idade adulta, quando são injectados em embriões com um meio oleoso, que minimiza a fuga de imediato de hemolinfa de locais de punção . O procedimento ferida requer micromanipulação de embriões de Drosophila, incluindo alinhamento manual dos embriões em agplacas ar e transferência dos embriões alinhados à Microscopia. O ensaio de resposta epidérmica ferida Drosophila proporciona um sistema rápido para testar os requisitos genéticos de uma variedade de funções biológicas que promovem a cicatrização de feridas, bem como um modo para o rastreio de potenciais compostos químicos que promovem a cicatrização de feridas. O ciclo de vida curto e rotina de cultivo fácil fazer Drosophila um poderoso organismo modelo. Drosophila cura ferida limpa aparece para coordenar a resposta regenerativa da epiderme, com a resposta imune inata, de maneiras que ainda estão sob investigação, o que proporciona um excelente sistema para encontrar conservada regulamentar mecanismos comuns de Drosophila e de mamíferos ferida epidérmica.

Para obter os resultados apresentados no presente método, o quadro de leitura aberta da proteína fluorescente verde (GFP) é fundido a uma / sequência potenciadora induzida pela ferida promotor da dopa descarboxilase (DDC) e DsRed é fundida a uma sequência de ferida potenciador da tirosina hidroxilase ( plo) 4,6. Em um embrião de Drosophila vivo, a maturação da proteína fluorescente repórter ferida é optimizada de 4-6 horas após o ferimento, o qual permite que o tempo para a acumulação de proteína suficiente para visualizar, bem como o tempo para a proteína fluorescente para oxidar no estado fluorescente 15. Para observar a localização repórter, um microscópio de fluorescência composto é suficiente. Para observar um aumento mais elevado da localização repórter, um microscópio confocal é óptima para gerar uma projecção máxima de múltiplas secções ópticas (Figura 1). Confocal imagiologia in vivo de embriões de Drosophila é complicado pela raondulações pid do embrião. . A visão completa do embrião pode ser obtida com 20X objetivo e uma visão mais próxima do local de ferida pode ser obtida com 40X objetiva. A-vista superior da epiderme ferida repórter de localização pode ser trabalhada com 10 sucessivos cortes ópticos 1 Hm. A visão lateral epidérmica ferida repórter de localização pode ser trabalhada com 40 sucessivas 1 mícron secções ópticas. Usando métodos padrão de cruzamento genético, é possível combinar os repórteres ferida com mutações genéticas. Um exemplo apresentado neste artigo é Flotillin-2 (Flo-2), ganho de função (superexpressão gerado com expressão ubíqua em todas as células) porque mutantes de perda de função (alelo nulo gerado com P-elemento de inserção) e de Flo-2 demonstram o produto do gene Flo-2 é necessária e suficiente para inibir a localização do Ddc-GFP ferida repórteres 9 (Figuras 2A e 2B). Usando a microinjection protocolo, é possível testar se a introdução das soluções químicas superactivates ou inibe a localização dos repórteres da ferida. Embriões quimicamente feridas foram feridos e simultaneamente injectados com uma proporção de 1% de corante azul de toluidina e compostos solubilizados 01:04. Corante azul de toluidina permitiu a confirmação visual de compostos solubilizados sendo injetados na cavidade do corpo. Embriões controle foram feridos com uma agulha quebrada contendo 01:04 proporção de 1% corante azul de toluidina e soluto, sem química. Dois exemplos apresentados no presente documento são o peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) e metil-β-ciclodextrina (MβCD), porque ambas as soluções químicas são suficientes para activar globalmente a localização do Ddc-GFP ferida repórteres 9 (Figuras 2C e 2D) . O peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) foi diluído em H2O para 0,6 M. Metil-β-ciclodextrina (MβCD) foi solubilizada em 1 mM de NaOH a 3 mM. Usando o protocolo de fixação de embriões, é possível detectar a activação de transcrição de genes de resposta de ferida em um domínio localizado, em torno de um local de ferida. Um exemplo apresentado neste artigo é a hibridização in situ de sondas de RNA para detectar Ddc e transcrições soas 4,6,9 (Figuras 3A e 3B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. DDC-GFP e ple-DsRed ferida repórter localização. Brightfield e imagens fluorescentes em embriões de tipo selvagem feridos. (A) com melhor vista da DDC-GFP repórter feridas. (B) com melhor vista da ple-DsRed ferida repórter. Todas as imagens foram coletadas em uma Leica SP2 microscópio confocal, com 20X objetiva. Setas marcar local da ferida. As linhas tracejadas no painel de dadoss marcar os contornos de embriões. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Localização do repórter Ddc-GFP feridas em fundos mutantes genéticos e químicos microinjeção de embriões. Claro e imagens fluorescentes de feridos Flotillin-2 (Flo-2) embriões mutantes. (A) perda de função Flo-2 {} KG00210 mutantes, expansão de actividade repórter em todas as células da epiderme. (B) Ganho de função Flo-2 (tatu-GAL4 UAS-Flo2) mutantes, a inibição da actividade repórter em todas as células da epiderme (C) peróxido. de hidrogénio (H 2 O 2 ) microinjeção solução, a expansão da reporter actividade ao longo de todas as células da epiderme. (D) Metil-β-ciclodextrina (MβCD) microinjecção solução, a expansão da actividade repórter em todas as células da epiderme. Todas as imagens foram coletadas em uma Leica SP2 microscópio confocal, com 20X objetiva. Setas marcar local da ferida. As linhas tracejadas nos painéis de dados marcar os contornos de embriões. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3. Detecção de resposta ferida transcritos de RNA de genes. Imagens fluorescentes de hibridação in situ e detecção de ARN em embriões de tipo selvagem feridos. Ddc (A) e PLE (B) transcritos de ARN se acumulam em torno do local da ferida. Todas as imagens foram coletated em um microscópio Leica SP2 confocal, com objetivo de 20X. Setas marcar local da ferida. As linhas tracejadas nos painéis de dados marcar os contornos de embriões. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Tabela 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> Tabela 1. Resumo de repórteres resposta epidérmica ferida. Inserções dos quatro repórteres resposta ferida (DDC, ple, msn, KKV) estão disponíveis em ambos os segundo e terceiro cromossomos. Todos os repórteres de resposta ferida ativar o gene fluorescente (GFP ou DsRed) num número limitado de células epidérmicas que rodeiam o local do ferimento de punção no fundo de tipo selvagem (por exemplo, o fenótipo &quot;local&quot;). Ddc e msn ferida repórteres de resposta para exigir Grh ativação do fluorescengene ce após a lesão punção (por exemplo, &quot;none&quot; fenótipo). Todos os repórteres de feridas requerem Flo-2 para a localização do gene de fluorescência após a lesão punção (por exemplo, o fenótipo &quot;global&quot;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

A epiderme embrionárias de fase muito tardia embriões de Drosophila fornece um sistema in vivo para análise da resposta punção ferida rápido e pode ser combinado com manipulações genéticas ou tratamentos químicos microinjeção para avançar os estudos na cicatrização de feridas para a tradução em modelos de mamíferos.

Microinjeção Ferida Ensaio e<em&gt; In vivo</em&gt; Localização de Epidermal Wound resposta Jornalistas em<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar in vivo um repórter da resposta a lesão epidermal em embrião de drosófila. Isso é realizado primeiramente coletando o estágio de desenvolvimento em que a atividade do repórter pode ser detectada de forma consistente. O segundo passo do procedimento é perfurar o embrião utilizando uma agulha de vidro e um aparelho de microinjeção.O terceiro passo é anestesiar o embrião para a visualização do repórter. O passo final é validar a localização do repórter detectando o padrão de expressão de sondas de RNA. Em última análise, os resultados podem mostrar a ativação específica do repórter da resposta a ferimento epidérmico apenas nas células ao redor do local da lesão por punção por meio de microscopia confocal.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes que envolvem a observação do fechamento de feridas é que podemos visualizar em embriões vivos a expressão gênica induzida por lesão por punção. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de reparo tecidual, como a forma pela qual as células ao redor de uma lesão regulam uma resposta imediata ao dano para promover a reparação. As implicações desta técnica estendem-se para a terapia ou diagnóstico da regeneração tecidual, pois a regulação da resposta à lesão é a etapa inicial.A cicatrização de feridas pode ser analisada em qualquer estágio de desenvolvimento. No entanto, a partir do estágio 17, o cutículo já está muito maduro. Os repórteres conhecidos de ferida não serão ativados.Para demonstrar, embriões de estágio 15 a 16 serão coletados após lesão. Colete moscas adultas com dois a três dias de idade, 50 fêmeas e 25 machos. Transfira-as para uma gaiola de coleta de embriões com uma placa fresca de suco de maçã, ágar e uma pequena quantidade de pasta de levedura.Mantenha a gaiola a 25 graus Celsius todas as manhãs durante os próximos três dias. Substitua a placa por uma nova. Na tarde do terceiro dia, permita que os ovos se acumulem em uma placa nova por duas horas.Armazene esta placa por 14 horas a 25 graus Celsius. Um período de repouso de duas horas deve produzir cerca de 200 embriões no dia seguinte. Adicione alguns mililitros de água à placa e agite-a suavemente.Em seguida, utilizando um pincel, transfira a água e os embriões da placa para um cesto de malha de náilon em um tubo de coleta. Agora, prepare um banho raso de água sanitária e mergulhe os embriões por dois minutos. Este passo remove as CORs, os ovos.Agite suavemente o banho algumas vezes para evitar que os embriões se aglomerem. Após dois minutos, enxágue os embriões com água corrente e enxágue na placa de Petri por cinco segundos cada. Em seguida, transfira a cesta de embriões para uma toalha de papel para secar os embriões.Em seguida, utilizando uma agulha de dissecação, transfira cerca de 50 embriões da malha para uma placa de ágar feita com corante alimentício verde. O corante serve para aumentar a visibilidade dos ovos. Sob um microscópio estereoscópico, organize os embriões em duas fileiras paralelas separadas por cerca de cinco milímetros.Posicione as fileiras separadas por uma distância equivalente à largura de um embrião para permitir a troca de gases. Em seguida, pressione cuidadosamente uma lâmina com fita adesiva dupla face sobre os embriões, de modo que as fileiras fiquem perpendiculares ao comprimento da lâmina. Para reduzir sua pressão interna, deixe os embriões secarem ao ar.Dessa forma, eles não irão estourar quando forem feridos. Após 25 minutos, a primeira lâmina preparada deverá estar seca. Agora, cubra os embriões com duas a três gotas de óleo de halo carbono para evitar desidratação adicional e prossiga imediatamente com o ferimento dos embriões secos.Coloque a lâmina com o embrião na platina do microscópio de injeção. Localize os embriões no campo de visão e pratique mover a platina do microscópio invertido. Em seguida, foque no plano médio do embrião ao longo do eixo dorsal-ventral e traga o embrião superior da primeira fileira alinhada para o campo de visão.Em seguida, coloque e fixe cuidadosamente uma agulha puxada no porta-agulhas. Use o micromanipulador para mover a agulha em direção à lâmina. Alinhe a agulha com o embrião no mesmo plano focal.Agora, não ajuste mais o micromanipulador. Em seguida, mova a platina para perfurar o embrião de um lado ao outro. Depois, passe para o próximo embrião da fileira.Após ferir a primeira fileira, mova completamente a agulha para cima e para longe do estágio. Em seguida, gire a lâmina e continue furando os embriões na segunda fileira. Uma vez feridos, os embriões podem ser fixados imediatamente para hibridização in situ ou coloração com anticorpos.Para examinar os repórteres fluorescentes, espere de quatro a seis horas e transfira o embrião para um novo porta-objetos; coloque esferas de vidro ao redor dos embriões. Em seguida, adicione algumas gotas de 50% de fenoxi-propanol, que é um anestésico, e coloque uma lamínula sobre os embriões para microinjeções. Carregue a agulha de injeção pela extremidade traseira com um microlitro de solução química mais corante, como peróxido de hidrogênio 0,6 molar.Deixe a ação capilar puxar a solução química até a ponta da agulha. Em seguida, quebre a ponta da agulha contra a borda de uma lamínula na mistura de óleo de carbono em halo. Primeiro, coloque a agulha montada em foco com a borda da lamínula inclinada em um ângulo quase, mas não exatamente, de 90 graus.Em seguida, mova suavemente a borda da lamínula ao longo da ponta da agulha até que ela quebre. Então, aplique pressão no aparelho de microinjeção e verifique se a solução está fluindo para fora da agulha. Caso não flua, quebre um pouco mais a abertura da agulha.Agora, realize o mesmo procedimento utilizado apenas para furar os embriões. Desta vez, microinjete a solução simultaneamente ao furo. Idealmente, injete 10 nanolitros.Se for injetada uma quantidade excessiva de solução no embrião, a membrana de Vitale irá romper durante o procedimento de fixação descrito no protocolo textual; preste atenção cuidadosa aos seguintes passos. Utilize uma pipeta de vidro, e não de plástico, para enxaguar o heptano sobre a lâmina e use vidro para concentrar os embriões no centro da placa de Petri de vidro. Posteriormente, agite os embriões no fixador por 25 minutos a 220-230 rpm.Após agitar, aguarde o rompimento das bolhas na interface antes de remover completamente a fase aquosa inferior. Além disso, tenha cuidado para não puxar os embriões. Após a adição do metanol, os embriões feridos devem agrupar-se na interface posteriormente; distribua os embriões ao longo da superfície da placa como mostrado e transfira-os para uma lâmina de vidro com fita dupla face como indicado.Em seguida, empurre cuidadosamente os embriões com a agulha de dissecação para romper a membrana Vitelina e prossiga com a desidratação. Moscas do tipo selvagem foram transformadas com repórteres fluorescentes fundidos a potenciadores da descarboxilase da DOPA ou da hidroxilase da tirosina e submetidas ao ensaio descrito. Em contraluz, foi possível observar o local da lesão, enquanto sob iluminação de fluorescência, foi possível detectar a atividade do repórter da lesão DCD.O repórter da tirosina hidroxilase mostrou um resultado semelhante. Ambas as imagens foram obtidas em um microscópio confocal Leica SP dois com objetivo de 20 x. O procedimento foi realizado em um fluxo de perda de função em dois mutantes.Na linha de base, a atividade do repórter da DOPA descarboxilase expandiu-se por todas as células epiteliais em mutantes com ganho de função do fluxo dois, gerados com expressão ubíqua em todas as células. Observou-se inibição do repórter ao longo das células epiteliais. Em seguida, embriões foram simultaneamente feridos e injetados com um composto solubilizado e corante azul de udina, peróxido de hidrogênio e água, expandindo a atividade do repórter da DOPA descarboxilase nas células epiteliais, assim como uma injeção de metil B ciclodextrina em hidróxido de sódio utilizando hibridização dentro de U.A ativação transcricional dos genes de resposta à lesão foi avaliada pela detecção endógena da DOPA descarboxilase. A expressão de RNA foi observada ao redor do local da lesão e, naturalmente, os transcritos de RNA da tirosina hidroxilase também foram encontrados acumulados no local da lesão. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 60 minutos, se executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante não gastar muito tempo alinhando os embriões e avançar com as próximas etapas do procedimento.

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