Name: A identificação de DNA Mutações em Purificada-Tronco Hematopoéticas / células progenitoras (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprenda a identificar mutações de DNA em células-tronco hematopoéticas purificadas usando o modelo de camundongo transgênico LacI. Este ensaio de mutagênese in vivo permite analisar a frequência e tipo de mutações espontâneas ou induzidas por genotoxinas.

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Gostaríamos de agradecer a David R. Rodriguez, MA para o design gráfico e fotografia neste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do GCCRI, o NIH / NIA (5R21AG033339) eo Apoio Grant Cancer Center (P30CA054174) à facilidade UTHSCSA Citometria de Fluxo Core e da Facilidade UTHSCSA avançada Ácidos Nucleicos Core.

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

O ensaio de mutagénese in vivo aqui descrita baseia-se no modelo de ratinho transgénico LacI originalmente gerado por 18 Kohler et al. Este modelo utiliza um vector de fago λ portador de um gene repórter de lacl. Os dois sítios cos do vector que flanqueiam permitir uma recuperação relativamente simples e subsequente empacotamento em partículas de fago infecciosas, utilizados para infectar E. coli. Uma placa azul será gerado por infectadas com fago E. c...

Na maioria dos tecidos, células diferenciadas têm uma duração de vida limitada. Para manter a integridade funcional, células estaminais de tecidos específicos de longa duração produzir continuamente células progenitoras que, por sua vez dão origem às células totalmente diferenciadas requeridas para a função daquele tecido particular. As células-tronco também reabastecer seu próprio compartimento através de um processo chamado de auto-renovação. Assim, as células-tronco são responsáveis ​​por manter a integridade funcional do tecido eles residem dentro, portanto, é imperativo que eles são equipados com mecanismos robustos para detectar e potencialmente reparar o DNA danificado. Se não, eles podem adquirir múltiplas perturbações genômicos (potencialmente perigosos), que podem ser herdadas por seus descendentes. A compreensão de como as células-tronco salvaguardar seu genoma durante o tempo de vida de um organismo é uma questão importante e pode nos ajudar a entender por que a instabilidade genômica está relacionada com o câncer e outras doenças relacionadas com a idade (revisada em 1,2). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Controlando integridade genómica de um tecido ao nível das células estaminais ou de populações de células progenitoras no início pode ser conseguida quer eliminando haste com defeito (ou progenitora) por meio de células de morte celular, senescência ou diferenciação e / ou por reparação eficiente ADN de danificado. Estudos recentes demonstraram que é possível medir a certos tipos de reparação do ADN directamente nestas populações raras 3-6. Verificou-se que, por exemplo, no sistema hematopoiético, quebras duplas ADN cadeia pode ser reparada por recombinação homóloga (HR) ou a extremidade não-homóloga de união (NHEJ), sendo este último um processo de reparação de baixa fidelidade e, portanto, o aumento do risco de fazer erros. Ambos estão sendo utilizados em células estaminais hematopoiéticas (HSCs) de 4,5, no entanto, em murganhos, parece que é predominantemente NHEJ no HSCs enquanto que as células progenitoras iniciais utilizam RH 4. Uma observação semelhante foi feita por células-tronco na pele 6. Curiosamente, em humano HSCs HR, não NHEJ,parece ser o mecanismo de reparo de escolha para a vertente breaks duplos 3. Se essa diferença funcional entre as duas espécies é real ou apenas representa uma diferença tecnológica ou experimental continua a ser visto. Um repertório de células-tronco para reparar o DNA danificado é susceptível de incluir outros mecanismos de reparo do DNA, como a reparação por excisão de bases (BER), reparo por excisão de nucleotídeos (NER) e reparação incompatibilidade (MMR). BER e NER são responsáveis ​​pela reparação de lesões únicas ou múltiplas pares de bases no DNA fita simples, enquanto descasamentos correções MMR base-base e alças de inserção / exclusão; estes tipos de danos no DNA não pode ser reparado por NHEJ ou RH. Apoiando esta noção de diversos estudos do sistema hematopoiético que indicam uma ligação entre as alterações em uma destas vias e anormalidades no compartimento HSC 7-9, bem como um risco aumentado de desenvolvimento de síndrome mielodisplásica 10-16, uma doença que se origina naHSC e que está associada com o aumento da instabilidade genómica como a doença progride 17. Até o momento, não foram relatados medidas de BER, NER e MMR diretamente em HSCs. Além de elucidar os vários processos que controlam a integridade do tecido a um nível mecanístico, é imperativo para ser capaz de medir a extensão de ADN mutado, de modo que as consequências das aberrações em que um destes processos pode ser testada, por exemplo, normal versus geneticamente células-tronco modificadas ou no velho contra jovens. No entanto, o desenvolvimento de um ensaio relevante é difícil devido à escassez de células estaminais de tecidos específicos e a falta de condições de cultura que preserva &quot;stemness&quot;. Além disso, um tal ensaio deve ser modificável para manipulações genéticas e ambientais. Uma possível solução para estas limitações e exigências é a utilização de modelos de rato, que são especificamente projectados para detectar mutações no DNA. Mulmodelos de ratinhos transgénicos tiple para a detecção de mutações têm sido desenvolvidos. Por exemplo, o LACI ratinhos transgénicos 18 transportar um vector de fago λ recuperável que codifica o sistema LacI repórter, em que o gene codifica um supressor de LacI do operador Lac e serve como o repórter mutação. Após a mutação do gene LacI, o operador Lac é activado e β-galactosidase produzida. cliva β-galactosidase do substrato cromogénico X-gal (5-bromo-4-cloro-e-indolil-β-D-galactopiranósido), o que a torna azul. Os cos locais de acompanhamento do vetor LacI permite a recuperação fácil por proteínas do fago lambda e posterior infecção de E. coli. Após incubação de E. infectado coli em agarose que contém o substrato X-gal, as placas podem ser marcados. As placas azuis conter um mutante putativo Lac-I transportando fago, enquanto placas claras porto não mutantes. A freqüência de placas azuis (entre ªe as claras) indica que a frequência de mutação na população de células original é o DNA foi extraído a partir de. Além disso, o fago λ hospeda o alvo LacI pode ser facilmente sequenciada utilizando técnicas de PCR para análise relativamente alto rendimento. Seqüenciamento múltiplos genes mutantes LacI irá revelar informações importantes sobre o espectro de mutação, o que pode apontar para possíveis deficiências nas vias de reparo de DNA específicas ou eventos genotóxicos específicos. O sistema transgênico LacI foi padronizado em vários laboratórios 19 e os reagentes estão disponíveis comercialmente. Uma grande desvantagem do sistema LacI é a capacidade limitada para detectar grandes deleções ou rearranjos e, portanto, outros métodos, por exemplo, FISH multi-color em metáfase precisam ser usados ​​para complementar essa deficiência. Dentro do vector de fago λ do modelo do rato LacI, existe um gene muito menor, CII, Disponível para análise de mutação. O seu tamanho e ao facto de que os mutantes podem ser seleccionados torna este um ensaio de trabalho intensivo e mais barato menos 20 do que a análise do gene LacI. No entanto, o gene LacI está mais extensivamente estudado para a mutagénese 21 e a sensibilidade do gene de mutações foi bem caracterizada de modo a que existe um claro entendimento dos resíduos de aminoácidos que produzem uma resposta fenotípica sobre um substrato cromogênico 22-25. Outros modelos de ratinho para a detecção de mutações incluem a utilização do ΦX174 ou os transgenes LacZ. O modelo de camundongo transgênico ΦX174, com o Um original de: T → G: mutação reversão C ensaio 26 ou no ensaio de mutação para a frente 27, que permite a detecção de um espectro de substituição de pares de base, representa um sistema menos oneroso do que o modelo LacI. No entanto, a tela mutacional no ensaio para a frente não é trivial e a especificação mutaçãotro do transgene ΦX174 não é tão bem caracterizados como a do LACI. Em modelos de ratos portadores transgenes LacZ, o repórter mutacional LacZ é recuperado utilizando E. células hospedeiras de E. coli que são sensíveis à galactose e meio contendo galactose 28. Uma desvantagem deste sistema é que a recuperação do alvo LacZ também envolve a digestão com endonuclease de restrição seguida por ligação e a electroporação de E. coli hospeda, tornando assim difícil para adaptar o sistema para um pequeno número de células. Embora não seja uma exigência absoluta para o trabalho com populações de células tronco / progenitoras (sempre se pode começar com mais ratos), se um grande número de células são necessárias (por exemplo, milhões ou mais) ele vai rapidamente tornar-se impraticável e de custo proibitivo. Além disso, o tamanho relativamente grande de LacZ, enquanto proporciona um repórter sensível mutacional, é pesado e mais dispendioso para a análise de sequência de ADN e determminação de espectros de mutações. Uma grande vantagem deste modelo no entanto, é a sua capacidade de detectar grandes deleções e inserções, bem como os rearranjos cromossómicos. Uma vez que todas as células nos modelos de ratinho transgénicos LacI, LacZ ΦX174 e transportar o sistema repórter, qualquer destes modelos de rato pode ser utilizado para medir a mutagénese em qualquer tipo de células de interesse, incluindo as células estaminais e progenitoras, contanto que eles possam ser colhidos de forma fiável e em número suficiente. Porque nós tivemos uma vasta experiência com o modelo do rato LacI eo ensaio de mutação LacI, decidimos prosseguir este sistema ainda mais para a análise de mutagênese em tronco hematopoiéticas e populações progenitoras. O tecido hematopoiético é bem caracterizada em termos de fenótipo da superfície celular de seus componentes individuais, incluindo repovoamento de células-tronco de longo prazo, que são identificáveis ​​como a população extremamente rara de Lin - IL7R <sup&gt; - Sca-1 + c-kit + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - células 29. . Mohrin et al 4 demonstraram que o ligeiramente maior população de LSK/Flk2 - células ainda são bons representantes para HSCs e significativamente diferente do mais primitivo progenitor mielóide comprometido população (CMP), quando se trata de estudar o reparo do DNA. Além disso, quando o LSK HSC enriquecido (Flk-2 + e Flk-2 -), as células foram comparados com o Lin - IL7R - Sca-1-c-kit + + (células progenitoras LS-K), há ainda uma diferença significativa nas NHEJ capacidade 5 entre o menos puro, caule enriquecida com células população LSK e as células progenitoras. Em nosso estudo utilizamos HSC-enriquecido LSK (Flk-2 + e Flk-2 -) células porque descobrimos que pelo menos 2 x 10 5 células são necessários para resultados consistentes e confiáveis ​​neste ensaio mutagênese, o número de células é extremamente difícilobter quando se classifica a LSK/Flk2 - população CD150 + CD48 ou mesmo o LSK/Flk2 - população (em termos de ratos, custos e praticidade). Este protocolo, com base no originalmente desenvolvida por Kohler et al. 18 descreve em pormenor a forma como a frequência de mutação espontânea de ADN pode ser determinada em células LSK e populações de células mielóides diferenciados, bem como células de medula óssea e do baço não separada definida.

<table><tbody><tr><td>LacI camundongos transgênicos&nbsp;</td>Kit de isolamento de DNA RecoverEase da <td>BioReliance Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, incluindo o coquetel de ribonuclease RNace-It</td><td>Agilent Technologies (Stratagene)</td><td>720202</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de embalagem Transpack, incluindo os tubos transpack laranja e azul e o SCS-8 E. coli</td><td>Agilent Technologies (Stratagene)</td><td>200221</td><td></td></tr><tr><td>padrões de tamanho de DNA - escada lambda</td><td>Bio Rad</td><td>170-3635</td><td></td></tr><tr><td>0.025 mM Membranas de tamanho de poro&nbsp;</td><td>Fisher (Millipore)</td><td>VSWP 025 00</td><td></td></tr><tr><td>245 mm2 Placas de Bioensaio (bandejas)&nbsp;</td><td>Fisher (Corning)</td> <td>07-200-600</td><td></td></tr><tr><td>Caldo NZY (pó)</td> <td>Fisher (Teknova)</td> <td>N1144</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>N, N-Dimetilformamida</td><td>Fisher</td><td>AC34843-5000</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Research Products Intl Corp (RPI)</td> <td>B71800-10.0</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>3-115-852</td><td></td></tr><tr><td>PCR Extender Taq Polimerase kit</td><td>5 PRIME</td><td>2200500</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP kit de limpeza</td><td>Beckman/Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr></tbody></table>

a identificação de dna mutações em purificada-tronco hematopoéticas / células progenitoras

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Nos últimos anos, tornou-se evidente que a instabilidade genômica é estreitamente relacionada com muitos transtornos do desenvolvimento, câncer e envelhecimento. Tendo em conta que as células-tronco são responsáveis ​​por garantir a homeostase e reparação tecidual ao longo da vida, é razoável supor que a população de células-tronco é fundamental para a preservação da integridade genômica dos tecidos. Portanto, o interesse significativo surgiu na avaliação do impacto de fatores endógenos e ambientais sobre a integridade genômica em células-tronco e seus descendentes, com o objetivo de compreender a etiologia das doenças com base em células-tronco. Ratinhos transgénicos LacI transportar um vector de fago λ recuperável que codifica o sistema LacI repórter, em que o gene LacI serve como o repórter mutação. O resultado de um gene mutante LacI é a produção de β-galactosidase que cliva um substrato cromogénico, transformando-azul. O sistema repórter LacI é i realizadon todas as células, incluindo as células tronco / progenitoras e podem ser facilmente recuperados e usados ​​para infectar posteriormente E. coli. Após incubação de E. infectado coli em agarose que contém o substrato correcta, as placas podem ser marcados; placas azuis indicam um gene mutante LacI, enquanto placas claras porto de tipo selvagem. A freqüência de azul (entre limpar) placas indica a frequência de mutantes na população célula original do DNA foi extraído. Sequenciação do gene mutante LacI vai mostrar a localização das mutações no gene e o tipo de mutação. O modelo de ratinho transgénico LacI está bem estabelecido como um ensaio de mutagénese in vivo. Além disso, os ratos e os reagentes para o ensaio estão disponíveis comercialmente. Aqui nós descrevemos em detalhes como este modelo pode ser adaptado para medir a freqüência de ocorrência espontânea mutantes de DNA em células-tronco enriquecido Lin - IL7R - Sca-1 + c-kit + + (LSCélulas K) e outras subpopulações de o sistema hematopoiético.

<html> O ensaio de mutagênese vivo mede um evento raro (PFUs mutante), entre muitos eventos (todos PFUs). Ao realizar o ensaio com pequeno número de células, é possível que o resultado é consideravelmente influenciado por resultados falsos positivos e falsos negativos. Para abordar esta questão foi realizado um experimento de diluição em série com células da medula óssea não fraccionada, colhidas a partir de três animais diferentes. Medimos a frequência de mutantes na medula óssea destes animais com 1,4...

Descrevemos aqui um ensaio in vivo de mutagénese para pequenos números de células hematopoiéticas purificados utilizando o modelo de ratinho transgénico Lacl. O gene LacI pode ser isolado para determinar a frequência, a localização eo tipo de mutantes de DNA espontaneamente surgido ou após a exposição ao genotoxinas.

A identificação de DNA Mutações em Purificada-Tronco Hematopoéticas / células progenitoras

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

identifying-dna-mutations-purified-hematopoietic-stemprogenitor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O ensaio de células formadoras de colônia (CFC) é um ensaio in vitro em que células progenitoras hematopoéticas formar colônias em meio semi-sólido. Uma combinação de morfologia da colônia, morfologia celular e citometria de fluxo são utilizados para avaliar a capacidade dos progenitores a proliferar e se diferenciar ao longo dos diferentes linhagens hematopoiéticas.

Formadoras de Colônias celular Assay (CFC) para células hematopoiéticas humanas

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Este protocolo fornece diretrizes passo a passo para a criação de experimentos competitivos de transplante de medula óssea de camundongos para estudar a função das células-tronco/progenitoras hematopoiéticas sem purificação prévia de células-tronco por classificação de células.

Transplantes competitivos para avaliar hematopoéticas aptidão Stem Cell

Quantificação de doador-derivado de células é necessária para monitorar a enxertia após transplante de células-tronco em pacientes com hemoglobinopatias. Uma combinação de classificação de celulares baseados em citometria de fluxo, ensaio de formação de colônia e posterior análise do tandem curta repetições podem ser utilizadas para avaliar a proliferação e diferenciação dos progenitores no compartimento eritroide.

Deteção de doador Residual eritroide progenitoras após transplante de células-tronco hematopoéticas para pacientes com hemoglobinopatias

Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Nós descrevemos o uso do transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) para avaliar o potencial maligno das células hematopoiéticas geneticamente modificados. TCTH é útil para avaliar várias células hematopoiéticas malignas na vivo , bem como gerar uma grande coorte de ratos com Síndromes Mielodisplásicas (MDS) ou leucemia para avaliar novas terapias.

Uso de transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a origem da síndrome mielodisplásica

Os padrões de mutação somática nas células refletem a exposição mutagênica prévia e podem revelar relações de linhagem de desenvolvimento. Aqui apresentamos uma metodologia para catalogar e analisar mutações somáticas em células hematopoiéticas individuais e progenitoras.

Caracterizando a carga mutacional e a composição clonal do sangue humano

O presente protocolo descreve um procedimento de cultura otimizado de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) para o enxerto robusto de células editadas por genes in vivo.

Edição de Genes CRISPR/Cas9 de Células-Tronco Hematopoiéticas e Progenitoras para Aplicações de Terapia Gênica

Novas estratégias para modelar fielmente mutações somáticas em células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) são necessárias para melhor estudar a biologia das células-tronco hematopoiéticas e as neoplasias hematológicas. Aqui, um protocolo para modelar mutações heterozigotas de ganho de função em HSPCs combinando o uso de CRISPR/Cas9 e transdução dupla de doador de rAAV é descrito.

Engenharia de Mutações de Ganho de Função Heterozigotas Oncogênicas em Células-Tronco Hematopoiéticas Humanas e Progenitoras

Apresentamos aqui uma técnica baseada em citometria de fluxo que permite medir simultaneamente o número de divisões celulares, o fenótipo celular de superfície e o parentesco celular. Essas propriedades podem ser testadas estatisticamente usando uma estrutura baseada em permutação.

Avaliação Simultânea de Parentesco, Número de Divisão e Fenótipo por Citometria de Fluxo para Células-Tronco Hematopoéticas e Progenitoras

Aqui, apresentamos um protocolo que integra a tecnologia CRISPR/Cas9 com o ensaio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) para identificar genes candidatos que são cruciais para a capacidade proliferativa anormal de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras.

Avaliação de genes anormais relacionados ao crescimento de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras combinando a tecnologia CRISPR/Cas9 com contagem de células

Aprenda a identificar mutações de DNA em células-tronco hematopoéticas purificadas usando o modelo de camundongo transgênico LacI. Este ensaio de mutagênese in vivo permite analisar a frequência e tipo de mutações espontâneas ou induzidas por genotoxinas.

A identificação de DNA Mutações em Purificada-Tronco Hematopoéticas / células progenitoras

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