Name: Perfil dos Conteúdos triacilglicerídeos em Bat Tegumentar Lipídeos por cromatografia em camada delgada preparativa e MALDI-TOF Espectrometria de Massa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda a isolar e identificar triacilglicerídeos em secreções sebáceas de morcegos usando cromatografia em camada delgada e espectrometria de massa MALDI-TOF. Este método ajuda a analisar perfis lipídicos que funcionam como sinais químicos em interações biológicas.

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Foi prestada assistência por Scott Treece, Katelyn Arter, Jeremy Ragsdell, Tony Lamark James, Amy Fischer, Hannah Blair, e Cheyenne Gerdes durante o desenvolvimento de métodos de laboratório. Gostaríamos de agradecer ao Laboratório de Medina-Bolívar (Luis H. Nopo-Olazabal; Instituto de Biociências Arkansas) para obter assistência com TLC densitometria digitalização. MALDI-TOF MS utilizado para este projeto foi fornecido através da NSF EPSCoR, RII: Iniciativa ASSET Arkansas P3 Center (EPS-0701890), no Instituto de Biociências de Arkansas. O financiamento foi fornecido por um dos Estados Unidos Pesca e Wildlife Service / Arkansas State Wildlife Grant, a Sociedade Nacional de Espeleologia e The Center for North American Bat Pesquisa e Conservação da Universidade Estadual de Indiana.

CUIDADO: Obtenha com antecedência todas as licenças estaduais e federais necessárias para manuseio, transporte e armazenamento de morcegos. Aprovações também deve ser obtida com o cuidado com os animais e uso comitê institucional, bem como de sua comissão de biossegurança institucional. Se os morcegos vivos (ou tecido do sistema nervoso) devem ser tratadas, tratadores de animais devem ser vacinados contra a raiva. Morcegos utilizados no estudo foram coletadas a partir do Ozark St. Francis National Forest, AR, durante o verão de 2010 de acordo com métodos padrão (de Arkansas State University Comissão de Biossegurança Institucional aprovação # 135349-1) 28. 1. Tecido Tratamento e Lipid Extraction <ol><li> Limpe todos os instrumentos com metanol antes e entre a coleta de tecidos de diferentes indivíduos. Aparar o cabelo (cerca de 1,0 g) de pele com uma tesoura e coloque em um frasco de Erlenmeyer de 125 ml. Sebo de exemplo de superfície de asa, esfregando a pele com 4-6 bolas de algodão umedecidas com clorofórmio: Dissolvente metanol (C: M, 3:2 v / v), e colocá-las num frasco separado. </li><li> Extrair o tecido com 10 ml de C: H (2:1 v / v) contendo 0,5% de hidroxitolueno butilado (BHT), para evitar a oxidação 29. Só use solventes para HPLC. </li><li> Após 2 horas, adicionar cerca de 0,5 g de sulfato anidro de cada um dos balões, misturar brevemente, e recolher-se o solvente por filtração através de papel de filtro. </li><li> Repita os passos 1.2 e 1.3, duas vezes. Uma vez com 1:1 C: M e, sequencialmente, com 1:02 C: M. Piscina filtrados juntos. </li><li> Evapora-se os filtrados combinados sob uma corrente de N 2, a determinação do peso seco, e dissolve-se o resíduo lipídico em 3:02 C: M (com 0,5% de BHT) a uma concentração de 10 mg / ml. Loja amostra em frascos de vidro a -20 ° C. Em geral, é melhor para analisar amostras dentro de um mês após a coleta da amostra e para minimizar os ciclos de congelamento e descongelamento. </li></ol> 2. Lipid A separação por cromatografia preparativa de camada fina <ol><li> Prepara-se previamente lavado com solvente 1,5 ml microcetubos ntrifuge por enchimento com 3:2 C: M, lavagem com acetona, e secagem ao ar. Isto é feito para remover plastificantes que podem interferir com a análise de espectrometria de massa posterior. Guarde tubos de amostra em um recipiente livre de poeira e lidar com estes tubos apenas com luvas para evitar a contaminação de oleosidade da pele. </li><li> Ative a placa de TLC pelo primeiro pré-desenvolvê-lo com 3:2 C: M. Adicionar solvente suficiente para a câmara de CCF, a uma profundidade de 1 cm, em seguida, colocar a placa na câmara (perto com tampa de vidro) e permitir que o solvente para executar completamente a parte superior da placa. Isso leva cerca de 45 min. </li><li> Remover a placa e seca numa hotte até evaporar, (cerca de 15 min), em seguida, colocar num forno durante pelo menos 10 minutos a 120 ° C. Coloque uma marca do lápis, na parte superior da placa para manter a orientação quando as amostras são aplicadas. Coloque um lápis linha recta, a 1,5 cm do rebordo inferior do prato, para marcar a linha de base em que a amostra e os padrões será colocado. </li><li> Prepare TLC câmara cortando umpedaço de papel de filtro suficientemente grande para alinhar as duas paredes curtas e uma longa parede. Colocar o revestimento de papel de filtro na câmara. Vai totalmente molhado quando o solvente é adicionado à câmara. </li><li> Preparar 100 ml de fase móvel do solvente, o que é de hexano: éter dietílico: ácido acético (H: E: A; 80:20:2 v / v / v). Despeje solvente para dentro da câmara para dar uma profundidade de cerca de 1 cm. Cubra com a tampa de vidro, usando um retentor de massa de silicone ao longo do bordo superior da câmara. Permitir que a câmara se equilibre durante a noite antes da utilização. </li><li> Aplicar a amostra manualmente para o prato preparado com um tubo capilar ou pipeta, como uma sequência contínua de cerca de 1,5 cm de uma ponta a 1,5 cm para o outro bordo. Um aplicador automático de amostras é preferível, uma vez que irá carregar a amostra em uma raia mais homogênea. Use as pistas externas da placa de TLC de detectar cerca de 20 mL de mistura de esteróis, FFAs, tags e padrões de ésteres de esteróis (uso de 10 mg / ml; misturas premade pode ser obtido). </li><li> Colocar a placa de TLC carregado naa câmara equilibrada, perto com a tampa, e desenvolver a placa até que o solvente corre para a extremidade superior. Isto leva cerca de 45 minutos com a fase móvel, descrita aqui. Remover a placa da câmara e permitir que o excesso de solvente a evaporar-se a partir da placa numa hotte durante cerca de 1 min. </li><li> Pulverize com 0,05% de rodamina 6G em etanol 95%. Visualize bandas lipídios sob uma lâmpada ultravioleta de longo comprimento de onda. Marque com um lápis a posição f R para as bandas fluorescentes resolvidos na amostra e os padrões. Um registro fotográfico pode ser tomada neste momento. </li><li> Identificar a banda correspondente à norma TAG e removê-lo da placa por raspagem da sílica com uma espátula para um grande pedaço de papel glassine pesar. Transferência de sílica para um tubo de microcentrífuga lavado com solvente de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 1,0 ml de 3:2 C: solvente M para o tubo de amostra, sonicado durante 1 min, o pellet a sílica através de centrifugação, e em seguida transferir-se o solvente para um novo tubo pré-pesado. Repita ªe passo anterior, reúnem-se os filtrados e evapora-se o solvente sob uma corrente de N 2. </li><li> Armazenar o resíduo seco contendo marcas sob N2 no escuro a 4 ° C, enquanto as amostras de tecido adicionais são separados por TLC. Rodamina 6G está presente em amostras, mas é insolúvel em hexano e é removido durante a dissolução da amostra imediatamente antes de análise por MS. </li></ol> 3. Análise TAG por MALDI-TOF MS <ol><li> Prepara-se uma α-ciano-4-hidroxi-cinâmico (CHCA) solução de matriz fresco por dissolução de 10 mg de CHCA em 1 ml de solvente (etanol 49,5%, 49,5% de acetonitrilo, e 1% de solução aquosa de 0,1% de TFA). </li><li> Prepare hormona adrenocarticotropic (ACTH; 18-39 clipe, 2465,1989 Dinamarca) para a resolução do instrumento e teste de sensibilidade por mistura de 1 ml de ACTH (1 mg / mL) com 39,5 mL de 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) para se obter um 10 pmol / ul solução estoque. Este pode ser armazenado a -20 ° C para uso futuro. </li><li> Prepare um novo solut ACTH trabalhandoion (1 pmol / uL), tendo um ul do / solução de estoque 10 pmol ul, de mistura com 9 ul de TFA a 0,1%, e, em seguida, a mistura (1:1) com 10 ul da solução de matriz CHCA obter um fmol 500 / concentração ul. </li><li> Prepare normas TAG em 10 mg / ml em 03:02 C: M para MALDI calibração de instrumentos (por exemplo, tricaprina [470,361 Da], tricaprilina [554,455 Da], trilaurina [638,549 Da], tripalmitina [722,642 Da], tripalmitolein [800,689 Da] , trimiristina [806,736 Da], trioleína [884,783 Da], tri-11-eicosenoin [968,877 Da], e trierucin [1.052,971 Da]). </li><li> Prepare trioleína a 10 mg / ml em 03:02 C: M para uma calibração padrão TAG externo lock-massa. </li><li> Dissolve-se as amostras TAG armazenados em hexano a uma solução de 10 mg / ml. </li><li> Prepare um 0,5 M (77,06 mg/1.0 ml) solução estoque de ácido 2,5-dihidroxibenzóico (DHB), com 90% de metanol para uso como matriz da amostra e padrão. Também preparar uma solução 1,0 M (2,0 g/50.0 ml) de NaOH. Cubra o tubo com a solução DHB usando FOI alumínio<html> l para proteger da luz. </li><li> Mix (em tubos pré-lavado) 10,0 mL matriz DHB, 10,0 mL de amostra ou padrão, e NaOH 5,0 mL 1,0 M. Misturar e centrifugar brevemente o tubo de mistura para trazer para a parte inferior. </li><li> Ponto 1.0 l de padrão, a amostra ou ACTH em uma placa de MALDI alvo de aço inoxidável e coloque em um dessecador até secar. Coloque a placa-alvo para o instrumento para aquisição de dados. </li><li> Realizar análises de MALDI-TOF MS em modo reflectrão positivo. Sintonize e calibrar o instrumento como descrito pelo fabricante do instrumento usando o ACTH e soluções padrão TAG. </li><li> Adquirir espectros para cada amostra visto na placa-alvo (de acordo com as especificações do instrumento; parâmetros para este trabalho foram 5 taxa de disparo de laser Hz, ~ 100 tiros por local para a obtenção de um espectro de média). Depois de alisar e subtraindo-se o fundo de espectros MALDI, picos de íon processo manualmente com o motor de busca on-line LIPID MAPS (/ Tools / ms / glycerolipids_batch &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.lipidmaps.org / tools / ms / glycerolipids_batch). </li><li> Copiar e colar o espectro lista para a lista de íons precursores e caixa de intensidade. Limitar a pesquisa a composição desejada acil. Identificar TAG pela massa / carga (m / z) as proporções de iões presentes no espectro para cada amostra. Se o éster metílico de ácidos gordos (FAME) percentagens estão disponíveis a partir de análise por GC / MS separado, adicionar estes dados para obter probabilidades de TAGs presentes. </li></ol> INSTRUMENTO: O espectrômetro de massa utilizado neste estudo é um Waters MALDI Micro MX (equipado com um nm 20 Hz N 2 do laser 337). Instrumento MALDI Qualquer fabricante com capacidade de modo reflectrão positivo pode ser usado. As configurações gerais utilizadas são de tensão de pulso, 2.000 V; reflectrão, 5.200 V; fonte, 15.000 V, com aquisição de dados usando o software MassLynx (ver. 4.0). Estas condições operacionais fornecem resolução de massa maior do que 12.000.

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<li>Fuchs, B., Süß, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-+A+review+of+the+current+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Este artigo apresenta um método simples e robusto para a separação de classes de lipídios amplas isoladas de tegumento de mamíferos por CCP e determinar perfis TAG por MALDI-TOF MS, sem demorada derivação das moléculas lipídicas. As etapas críticas na produção de espectros de TAG com MALDI-TOF MS qualidade incluem: 1) extração com sucesso do composto com a contaminação ou oxidação mínimo, 2) separação suficiente e isolamento por cromatografia e 3) de alta resolução e precisão massa por MALDI-TOF MS. Este trabalho demonstra o método por meio da extração e separação da fração lipídica neutra do plagiopatagium do morcego vermelho oriental obter TAG perfis MS. Embora o presente estudo utilizou uma espécie de morcegos (Mammalia: Chiroptera) estes métodos pode ser estendido para estudar lipídios tegumentar de qualquer espécie de mamífero. Bat tegumento se caracteriza por ser predominantemente colesterol, com menores quantidades de TAGs, FFAs, squalene e esterol / ésteres de cera. Rácios sebo lipídicas em bastões diferem dos seres humanos, em que o esqualeno é presente em baixas quantidades (em oposição a um máximo de 16% em seres humanos), ao passo que o colesterol ocorre em proporções maiores (1-7% em seres humanos, mas 26-62% em bastões) 22 , 31. Cabelos humanos contêm cerca de 3% TAGs, enquanto índices de até 28% são encontrados no cabelo morcego vermelho Oriental. A extração de amostras de lipídios de morcegos é semelhante para outras espécies. Enquanto neste estudo bolas de algodão embebidas em solvente são utilizados para remover o sebo, pode-se também inverter um tubo ou frasco de amostra contendo solvente sobre a superfície da cobertura de várias vezes. Produtos de fita especializados também fornecer meios alternativos para extrair lipídios de superfície 32. Uma parte crítica de uma extração de lipídios é adequado para minimizar a contaminação de oleosidade da pele. Isso é facilmente realizado, mantendo um frasco com metanol e pulverizando tudo copos e utensílios, limpando utensílios com um tecido entre todas as amostras e com luvas de exame. Oxidação of acilos poliinsaturados é impedida por meio da adição de BHT, e deve ser usada, independentemente da temperatura As amostras são armazenadas a. Análise biomolécula geralmente requer uma etapa de cromatografia para separar moléculas de interesse a partir de contaminantes. TLC é usado neste método, o que evita os requisitos de instrumentação para cromatografia gasosa ou líquida e requer menos experiência técnica para alcançar resultados consistentes e reproduzíveis. Dependendo da classe de lípido de interesse, diferentes fases móveis podem ser incorporados. Além disso, o uso de placas de HPTLC e densitometria de varrimento pode ser usado para obter resultados quantitativos. Enquanto as variações dos métodos de TLC são numerosos demais para listar aqui, algumas fases móveis comuns usados ​​em lipídios TLC incluem clorofórmio: metanol: água para a separação de fosfolipídios e glicolipídios ou isooctano: éter etílico para a separação de lipídios não polares 28. Em termos de separação TAGs de outras classes de lipídios, o H: E: Um modosistema lvent funciona de forma consistente e fornece resultados comparáveis. Uma outra vantagem para a utilização de TLC é que as bandas de interesse pode ser perfilado rapidamente usando MALDI-TOF MS sem derivatização prévia dos analitos. Neste estudo, a sílica é removido da placa de TLC, e o analito é eluído a partir dele por sonicação em um solvente e subsequente centrifugação para separar o adsorvente e a evaporação do solvente de eluição. Alternativamente, a matriz pode ser aplicado directamente sobre as bandas de analitos separados em placas de TLC e em seguida analisadas directamente por MALDI-TOF MS 33. Profiling bem sucedido por MALDI-TOF MS se baseia na preparação de amostras e de capacidades suficientes do operador com ajuste e calibração de instrumentos. O instrumento deve ser calibrado diariamente com os padrões que cobrem molecular apropriado faixa de peso para as moléculas de interesse. A sensibilidade e resolução adequada (por exemplo, ≥ 10.000) do material também deve ser confirméd diariamente com ACTH. Os componentes lipídicos sebáceas presentes na superfície de tegumento de mamífero pode desempenhar um papel na colonização por bactérias patogênicas / fúngicas. Portanto, o conhecimento da composição química entre espécies e indivíduos podem fornecer pistas sobre os processos das doenças humanas e animais selvagens. Diferenças intra-específicas entre indivíduos doentes e saudáveis ​​podem representar sinais clínicos que ajuda na detecção da doença e diagnóstico. Além disso, se os compostos específicos que inibem o crescimento microbiano são presentes, estes podem ser identificados para utilização no tratamento e prevenção de doenças.

Tecidos tegumentar mamíferos incluem a epiderme, estruturas de queratina (por exemplo, cabelo e unhas), e glândulas exócrinas. Tipo sebáceo glândulas exócrinas são associadas com folículos capilares, que são referidos coletivamente como a unidade pilossebáceo 1. As glândulas sebáceas liberam um exsudato oleosa sobre a superfície da pele conhecido como sebo. O sebo é composto em grande parte de glycerolipids (por exemplo triacilglicéridos [tags]), acilos graxos livres (FFAs), ésteres de esteróis / cera, e esqualeno. Composição química do sebo é 2 espécie-específico. Além de ser parte do sistema imune inato e fornecendo função antimicrobiana 3, lipídios sebáceas afetar processos fisiológicos importantes, incluindo a perda por evaporação de água através da pele 4, a integridade celular e regulação do gene 5, e absorção da droga 6. Composições de lípidos sebáceos também podem servir como marcadores da doença. Proporções e quantidades de sebáceo b alteradosclasses de lipídios de estrada são sinais clínicos de doenças como a acne vulgaris 7, 8 caspa, dermatite seborréica 8, 9 asteatose, entre outros 10. Tecidos epidérmicos e de cabelo incluem perfis de variáveis ​​contendo esteróis e derivados, tags, FFAs, ceramidas, fosfolipídios e outros componentes lipídicos menores. Porque os lípidos integumentary pode funcionar em processos de doença, determinar diferenças na composição química dos TAG entre indivíduos saudáveis ​​e doentes pode ser útil para o diagnóstico clínico da doença. Os lípidos são geralmente definidos como sendo compostos orgânicos insolúveis em água, com substituintes ou não polar ou apolar-polar 11. Estruturas lipídicas podem ser longas cadeias de hidrocarbonetos oxigenados, alcanos (incluindo os ésteres de cera, AGL, álcoois, cetonas e aldeídos), ou estruturas de anel complexas, tais como o colesterol 12. Há oito principais classes de lipídios com base na estrutura (FFAs, glycerolipids [GL], glycerophospholipids [GP], sphingolipids [SP], lipídios esteróis [ST], lipídios prenol [PR], saccharolipids [Sl], e policetídeos [PK]), que apresentam uma grande variedade de propriedades químicas, dependendo do classe 13. Devido à grande variação nas propriedades químicas de classes de lipídios, profiling direto sem derivação antes de moléculas lipídicas é desejada. Um método emergente na investigação de lípidos é a cromatografia de camada fina (TLC), combinadas com matriz assistida por dessorção / ionização por laser espectrometria de tempo-de-voo de massa (MALDI-TOF MS) 14. MALDI-TOF MS é usado extensivamente na pesquisa proteômica para identificar proteínas e associá-los às sequências de aminoácidos específicos devido aos altamente precisos íon peptídeo de massa &quot;impressões digitais&quot; gerados a partir de proteínas digeridas com tripsina 15. MALDI-TOF MS, também pode ser utilizado para o perfil de outras classes de biomoléculas, incluindo lípidos, tais como etiquetas de 16-18. MALDI requer o uso de uma matriz, tipcamente um composto orgânico que contém estruturas de ligação dupla aromáticos e conjugadas. As moléculas da matriz serve para transferir cuidadosamente a energia do laser para os analitos, promover a transferência de protões, e de produzir iões de carga única em fase gasosa 19-21. Os iões são submetidos a um campo de alta voltagem sob alto vácuo e acelerado em um analisador de massa TOF, onde os iões são, subsequentemente, separados por diferenças de velocidades que são proporcionais às respectivas relações de massa-para-carga. Mesmo muito grandes biomoléculas pode ser ionizado com pouca fragmentação, produzindo espécies de íons moleculares de carga única para análise de espectro simplificado. A capacidade de analisar as moléculas lipídicas directamente sem derivatização antes promoveu a adopção pronta de MALDI-TOF MS de pesquisa lipidomas 18. Este trabalho apresenta um método de rotina para isolar e analisar os lipídios tegumentar do cabelo, secreções sebáceas e plagiopatagium do morcego vermelho oriental (Lasiurus borealis). Isto é usado para determinar variações interespecíficos em morcego lipídios tegumentar para elucidar o processo da doença da síndrome do nariz branco (WNS) 22. WNS é uma doença fúngica de morcegos e é causada pela espécie psicrófilos recém descritos Geomyces destructans 23-25. WNS causou a morte de mais de 5 milhões de morcegos na América do Norte em cavernas e ameaça a extinção de espécies de morcegos vulneráveis, com os potenciais impactos econômicos de bilhões de dólares em danos para a indústria agrícola 26,27. Para investigar as etapas G. destructans infecção, lipídios foram extraídos dos cabelos e da asa tecidos de morcegos vermelhos orientais e separados em classes de lipídios amplas por TLC para isolar a fração TAG para posterior análise por MALDI-TOF MS. TAGs conter cadeias acilo curtas e são facilmente detectados por MALDI-TOF MS com pouca interferência da matriz.

<table><tbody><tr><td>Hidroxitolueno butilado</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>101162</td><td><a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">www.mpbio.com</a></td></tr><tr><td>TLC Placas Flexíveis</td><td>Whatman</td><td>4410-222</td><td><a href="http://www.whatman.com" target="_blank">www.whatman.com</a></td></tr><tr><td>ACTH</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>A8346-5X1VL</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Triolein</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>44895-U</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>TLC Lipid Standard</td><td></td><td>TLC 18-1</td><td><a href="http://www.nu-chekprep.com" target="_blank">www.nu-chekprep.com</a></td></tr><tr><td>MALDI TAG Standard</td><td>Nu-Check Prep., Inc.</td><td>Código NIH 53B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MALDI TAG Padrão</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>17810-1AMP-S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Frascos de vidro com tampa de teflon</td><td>U.S. National Scientific Co.</td><td>B7800-2</td><td><a href="http://www.nationalscientific.com/" target="_blank">www.nationalscientific.com/</a></td></tr><tr><td>DHB</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>50862-1G-F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CHCA</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>C8982-10X10 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sebutape</td><td></td><td>CuDerm S100</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

perfil dos conteúdos triacilglicerídeos em bat tegumentar lipídeos por cromatografia em camada delgada preparativa e maldi-tof espectrometria de massa

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

O tegumento de mamíferos inclui glândulas sebáceas que secretam uma substância oleosa sobre a superfície da pele. A produção de sebo faz parte do sistema imune inato que protege contra micróbios patogênicos. A produção de sebo anormal e composição química também são um sintoma clínico de doenças específicas da pele. O sebo contém uma mistura complexa de lipídios, incluindo triacilglicéridos, que é específica da espécie. As propriedades químicas gerais expostos por diversas classes de lípidos dificultar a determinação específica da composição de sebo. As técnicas analíticas para lipídios normalmente requerem derivatizações químicos que são aumentam os custos de preparação de amostras de trabalho intensivo e. Este artigo descreve como extrair lipídios de tegumento de mamíferos, classes separadas de lipídios amplas por cromatografia em camada fina, e perfil dos conteúdos triacilglicerídeos utilizando assistida por matriz dessorção a laser / espectrometria de massa por ionização time-of-flight. Este método robusto permite uma determinação diretados perfis triacilglicerídeos entre espécies e indivíduos, e que pode ser facilmente aplicado a qualquer grupo taxonómico de mamíferos.

O método de extracção para o isolamento de lípidos totais do tecido descrito por Folch 30 é um procedimento simples, o qual está adaptado aqui. Depois de extracção de tecidos e evaporação do solvente, os lípidos frequentemente aparecem como uma película amarelada. A cor amarela mais provável é de contaminantes de proteínas, que podem ser removidas através da realização de uma extracção líquido-líquido. Este processamento da amostra adicional não é necessário neste procedimento porque TLC preparativo separa a fração TAG de tais contaminantes. A adição de sulfato de sódio anidro puro em todas as fases de filtragem ajuda a reduzir a contaminação da água que afeta precisas determinações de peso lipídico. Analisa lipídico tegumentar mamíferos através de TLC preparativa com H: E: A como a fase móvel geralmente resolver quatro bandas distintas correspondentes a (a partir de origem) esteróis, FFAs, tags e ésteres de esteróis / ésteres de cera / esqualeno (Figura 1). Na ocasião, ao utilizar analiticamentecal de alto desempenho (HP) TLC com o H: E: A fase móvel, os ésteres de esteróis, ésteres cerosos, esqualeno e irão separar-se e aparecem como três bandas distintas. Sob as condições utilizadas no presente estudo, os ésteres de esterol / ceroso não são separados. Se estas bandas são de interesse, a fase móvel pode ser comutada para isooctano: éter etílico (95:5 v / v), e a placa de HPTLC podem ser analisados ​​por densitometria de varrimento. Outros fatores podem causar má separação. Estes são geralmente eliminados colocando-se o papel de filtro na câmara, aplicando lubrificante para uma vedação estanque na tampa, equilibrar a câmara durante a noite, e manter limpas as câmaras de TLC, para obter separações de qualidade consistente e dados de TLC. Espectros representativas massa MALDI-TOF obtidos para TAG isolados do bastão vermelho Médio são mostrados nas Figuras 2 e 3. Estes espectros conter picos de íon de TAG na faixa de massa entre m / z 850-910, que é típico para TAGs isoladas de mamífero não aquáticos. A adição de NaOH 1,0 M promove isoladamente carregada iões de Na + que são mais estáveis ​​do que os iões de H +. Em adição para a estabilidade, a ausência de iões de H + e K + aumenta a facilidade de análise de espectro. O m / z 850-910 íon picos correspondem às 16:00, 18:00, 18:01, 18:02 e grupos FA sendo os constituintes acil dominantes em TAGs (Tabela 1). Possíveis grupos FA de tags podem ser inicialmente determinado pelo total de iões de m / z presente em MALDI-TOF MS espectros, e as diferenças entre as espécies e indivíduos deduzidas. No entanto, se são necessárias as relações específicas do conteúdo de acilo, seguida de MS / MS ou cromatografia em fase gasosa (GC / MS) deve ser usado. Outras informações sobre os rácios de acilo pode ser deduzida por observação dos picos na região diacylglycerides do espectro (Figura 4). Diacylglycerides são produzidos a partir de fragmentação TAG na fonte MALDI e pode ser encontrado na m / z 590-650 região. Fragmentação TAG pode ser aumentada pelaomitindo a adição de NaOH 1,0 M 16. Bastão vermelho Médio tecido asa caracteriza-se por um pico dominante em m / z 879,7 e tecido cabelo com um pico dominante em m / z 881,8 (Figura 2 e 3, respectivamente). Picos a m / z 907,8, 879,7, e 855,7 (POP, OPP) estão aproximadamente no mesmo intensidade (~ 50%) no tecido do cabelo com o pico a 853,7 ser ~ 40%. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Composição </td><td fo:width="1in"> Composição Elemental </td><td fo:width="1in"> Observado Massa </td></tr><tr><td> TAGs Na + </td><td></td><td> TAGs Na + </td></tr><tr><td> SSO </td><td> C 57 H 108 O 6 </td><td> 911,8 </td></tr><tr><td> OOS, LSS </td><td> C 57 H 106 O 6 </td><td> 909,8 </td></tr><tr><td> OOO, LnSS, LSO </td><td> C 57 H104 O 6 </td><td> 907,8 </td></tr><tr><td> LOO, LLS </td><td> C 57 H 102 O 6 </td><td> 905,8 </td></tr><tr><td> LLO, OOLn </td><td> C 57 H 100 O 6 </td><td> 903,7 </td></tr><tr><td> LLL </td><td> C 57 H 98 O 6 </td><td> 901.7 </td></tr><tr><td> LLLn </td><td> C 57 H 96 O 6 </td><td> 899,7 </td></tr><tr><td> LLnLn </td><td> C 57 H 94 O 6 </td><td> 897,7 </td></tr><tr><td> Lnlnln </td><td> C 57 H 92 O 6 </td><td> 895,7 </td></tr><tr><td> OSP </td><td> C 55 H 104 O 6 </td><td> 883,8 </td></tr><tr><td> LSP, OOP, Sopo </td><td> C 55 H 102 O 6 </td><td> 881,8 </td></tr><tr><td> LOP, LNSP, LSPo </td><td> C 55 H 100 O 6 &lt;/ Td&gt; <td> 879,7 </td></tr><tr><td> LLP, LNOP, Lopo </td><td> C 55 H 98 O 6 </td><td> 877,7 </td></tr><tr><td> LnLP, LLPo, LnOPo </td><td> C 55 H 96 O 6 </td><td> 875,7 </td></tr><tr><td> LnLnP, LnLPo </td><td> C 55 H 94 O 6 </td><td> 873,7 </td></tr><tr><td> LnLnPo </td><td> C 55 H 92 O 6 </td><td> 871,7 </td></tr><tr><td> PPS </td><td> C 53 H 102 O 6 </td><td> 857,8 </td></tr><tr><td> POP, OPP </td><td> C 53 H 100 O 6 </td><td> 855,7 </td></tr><tr><td> OOM, PPL, Popos, Popo </td><td> C 53 H 98 O 6 </td><td> 853,7 </td></tr><tr><td> PPLN, ppol, PoPoO, Myoo </td><td> C 53 H 96 O 6 </td><td> 851,7 </td></tr><tr><td> LLM, LnOM </td><td> C 53 H 94 </sub&gt; O 6 </td><td> 849,7 </td></tr><tr><td> PPP, Ssla </td><td> C 51 H 98 O 6 </td><td> 829,7 </td></tr><tr><td> PPPo, OSLA </td><td> C 51 H 96 O 6 </td><td> 827,7 </td></tr><tr><td> PPoPo, PMyO </td><td> C 51 H 94 O 6 </td><td> 825,7 </td></tr><tr><td> LnLnLa </td><td> C 51 H 86 O 6 </td><td> 817,6 </td></tr><tr><td> MMS, batida, PPM </td><td> C 49 H 94 O 6 </td><td> 801,7 </td></tr><tr><td> SLaPo, MOPP, PPMy </td><td> C 49 H 92 O 6 </td><td> 799,7 </td></tr><tr><td> PoPoM, OOCa </td><td> C 49 H 90 O 6 </td><td> 797,7 </td></tr><tr><td> MMP </td><td> C 47 H 90 O 6 </td><td> 773,7 </td></tr><tr><td> MMPo, OCAP </td><td> C 47 H 88 O6 </td><td> 771,7 </td></tr><tr><td> OCaPo </td><td> C 47 H 86 O 6 </td><td> 769,6 </td></tr><tr><td> MMM, PPCA, PMLA </td><td> C 45 H 86 O 6 </td><td> 745,6 </td></tr><tr><td> PoPCa, PoMLa </td><td> C 45 H 84 O 6 </td><td> 743,6 </td></tr><tr><td> Popoca </td><td> C 45 H 82 O 6 </td><td> 741,6 </td></tr><tr><td> LaLaP, MMLa, MCAP </td><td> C 43 H 82 O 6 </td><td> 717.6 </td></tr><tr><td> LaLaPo </td><td> C 43 H 80 O 6 </td><td> 715,6 </td></tr><tr><td> OO </td><td> C 39 H 72 O 5 </td><td> 643,5 </td></tr><tr><td> OL </td><td> C 39 H 70 O 5 </td><td> 641,5 </td></tr><tr><td> LL </td><td> C 39 H 68 O 5 </td><td> 639,5 </td></tr><tr><td> SP </td><td> C 37 H 72 O 5 </td><td> 619,5 </td></tr><tr><td> OP </td><td> C 37 H 70 O 5 </td><td> 617,5 </td></tr><tr><td> LP </td><td> C 37 H 68 O 5 </td><td> 615.5 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Composição de ácidos graxos, composição elementar e massa isotópica de adutos sodiated de triacilglicéridos e diacylglycerides Ln = ácido. Linolênico (18:03), L = ácido linoléico (18:02), O = ácido oléico (18,1), S = ácido esteárico (18:00), P = ácido palmítico (16:00), Po = ácido palmitoléico (16:01), M = ácido mirístico (14:00), My = ácido miristoleico (14:1) La = láurico ácido (12:00), Ca = ácido cáprico (10:00). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig1.jpg" /> Figura 1. Camada fina cromatograma de separação ampla classe de lípidos por hexano: éter etílico: ácido acético(80:20:2 v / v / v) como a fase móvel. A banda entre esterol e FFA não foi identificado por um padrão, mas pode ser um álcool gordo ou cera de diéster. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig2.jpg" /> Figura 2. TAG região expandida do espectro de massa MALDI-TOF de TAGs sodiated. (M / z 700-950) de morcego vermelho oriental (L. borealis) tecido asa Peaks identificados em m / z 853,7 (OOM, PPL, Popos, Popo) e m / z 879,7 (LOP, LNSP, LSPo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig3.jpg" /> Figura 3. TAG região expandida do espectro de massa MALDI-TOF de TAGs sodiated (m / z 700-950) de morcego vermelho oriental (L. borealis) tecido cabelo.Picos identificados em m / z 905,8 (LOO, LLS) e m / z 907,8 (OOO, LnSS, LSO). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig4.jpg" /> Figura 4. DAG região do espectro de massa MALDI-TOF de fragmentos DAG sodiated (m / z 530-730). Tecido do morcego vermelho oriental (L. borealis) asa Peaks identificados em m / z 643,5 (OO) e m / z 615,5 (LP) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

Tegumento dos mamíferos contém lipídios solventes extraível que podem fornecer composições química característica de espécies individuais. Este trabalho apresenta um método de rotina para separar classes de lipídios amplas isoladas de tecidos tegumentar utilizando cromatografia em camada delgada e determinar o perfil triacilglicerídeos pelo laser de dessorção / espectrometria de massa por ionização assistida por matriz de tempo de vôo.

Perfil dos Conteúdos triacilglicerídeos em Bat Tegumentar Lipídeos por cromatografia em camada delgada preparativa e MALDI-TOF Espectrometria de Massa

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar e identificar os teores de triglicerídeos presentes nas secreções sebáceas de morcegos. Primeiro, extraia a fração lipídica da superfície dos tecidos integumentares em condições que minimizem contaminação e oxidação. Separe os lipídios por cromatografia em camada delgada para obter a fração de triglicerídeos.Agora processe os dados espectrais com o software do instrumento e analise-os com bancos de dados químicos on-line. Em última instância, a cromatografia em camada delgada preparativa e a espectrometria de massas por dessorção/ionização a laser assistida por matriz com tempo de voo são utilizadas para determinar as diferenças nos perfis de composição de triglicerídeos entre os grupos experimentais e controlados. Este método pode ser usado para ajudar a identificar lipídios secretados que podem funcionar como sinais químicos nas interações entre hospedeiro e patógeno.Embora estejamos utilizando este método para investigar os sinais clínicos da síndrome do nariz branco, esse método pode ser aplicado a outros sistemas de mamíferos, incluindo a análise de sinais sexuais ou possíveis diferenças interespecíficas na composição do leite. Limpe todos os instrumentos com metanol antes e entre a coleta de tecidos de diferentes indivíduos. Corte cerca de um grama de pelos da pele e coloque em um frasco erlenmeyer de 125 mililitros.Para coletar o sebo das superfícies das asas. Umedeça bolas de algodão com solvente de clorofórmio-metanol. Esfregue a pele e coloque-as em um frasco separado.Agora, extraia o tecido com 10 mililitros de clorofórmio-metanol contendo 0,5% de BHT para prevenir oxidação, após duas horas adicione cerca de 0,5 gramas de sulfato de sódio anidro e filtre em papel de filtro para coletar o solvente. Repita a extração sequencialmente com clorofórmio-metanol na proporção de um para um e um para dois. Em seguida, reúna os filtrados e evapore o material sob corrente de nitrogênio.Determine o peso seco e dissolva o resíduo lipídico até uma concentração de 10 miligramas por mililitro. Armazene a amostra em frascos de vidro a menos 20 graus Celsius por até um mês para remover plastificantes que podem interferir na posterior análise por espectrometria de massas. Encha tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro com três para dois de clorofórmio metanol.Em seguida, lave com acetona e seque ao ar; armazene os tubos de amostra em um recipiente livre de poeira e manuseie esses tubos apenas com luvas, para evitar contaminação por óleos da pele. Ative a placa de CLC pré-eluindo-a inicialmente com uma mistura de clorofórmio-metanol na proporção de três para dois.Adicione solvente à câmara de CCF até uma profundidade de um centímetro. Em seguida, coloque a placa na câmara e deixe o solvente subir completamente até o topo da placa. Retire a placa e seque-a em uma capela até que o solvente evapore.Em seguida, aqueça a placa por pelo menos 10 minutos a 120 graus Celsius. Agora, marque a placa com um traço de lápis na parte superior. Trace uma linha reta com lápis a 1,5 centímetro da borda inferior da placa para marcar a linha de base onde serão colocadas a amostra e as substâncias padrão.Em seguida, corte um pedaço de papel-filtro grande o suficiente para forrar as duas paredes curtas e uma parede longa da câmara de CCF. Insira o forro de papel-filtro na câmara. Despeje 100 mililitros de fase móvel recém-preparada na câmara até uma profundidade de cerca de um centímetro.Aplicar um selo de graxa de silicone ao longo da borda superior da câmara. Cobrir com a tampa de vidro e equilibrar durante a noite. Aplicar a amostra manualmente ou com um aplicador automático de amostras, fazendo um traço contínuo.Utilize as faixas externas da placa de TLC para aplicar cerca de 20 microlitros da mistura de padrões. Coloque a placa de TLC carregada na câmara previamente equilibrada. Feche a tampa e desenvolva a placa até que o solvente alcance a borda superior.Após aproximadamente 45 minutos, remova a placa e deixe o solvente em excesso evaporar em uma câmara de fluxo laminar. Asperja com iodo seis G a 0,05% em etanol a 95%. Em seguida, visualize as bandas lipídicas sob uma lâmpada de ultravioleta de comprimento de onda longo com um lápis. Marque a posição de Rf das bandas fluorescentes resolvidas na amostra e nos padrões.Faça um registro fotográfico. Em seguida, identifique a faixa correspondente ao padrão de marcação. Transfira-a para um grande pedaço de papel de vidro e papel manteiga, e depois para um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro lavado com solvente.Adicione um mililitro de solvente de clorofórmio-metanol na proporção de três para dois à amostra e sonique por um minuto. Peliculize a sílica por centrifugação e, em seguida, transfira o solvente para um novo tubo previamente pesado. Repita a extração com um mililitro, reúna os filtrados e, então, evapore o solvente sob fluxo de nitrogênio.Armazene o resíduo seco contendo as marcas sob nitrogênio, no escuro e a quatro graus Celsius, enquanto amostras adicionais de tecido são separadas por TLC Rho Domine. Seis G está presente nas amostras, mas é insolúvel em hexano e é removido durante a dissolução da amostra. Imediatamente antes da análise por MS, prepare a solução-trabalho de 500 fmol por microlitro de A CTH e os padrões de marcas de 10 miligramas por mililitro conforme descrito no protocolo do texto.Além disso, prepare a solução estoque 0,5 molar de DHB com metanol a 90% para uso como matriz de amostra e padrão. Cubra o tubo com papel alumínio para protegê-lo da luz. Agora, combine 10 microlitros de matriz de DHB, 10 microlitros de amostra ou padrão e cinco microlitros da mistura de hidróxido de sódio 1 molar, e centrifugue brevemente o tubo para levar a mistura até o fundo do ponto.Deposite 1 µL da amostra padrão ou de um CTH sobre uma placa-alvo de aço inoxidável para MALDI e coloque em dessecador para secar. Em seguida, coloque a placa-alvo no instrumento para aquisição de dados. Realize a análise de MS por toff MALDI no modo reflexivo positivo.Ajuste e calibre o instrumento conforme descrito pelo fabricante do instrumento, utilizando as soluções-padrão de A CTH e marcadores. Adquira os espectros de cada amostra depositada na placa-alvo após suavização e subtração do fundo dos picos de íons do processo Aldi Spectra manualmente com o mecanismo de busca online lipid maps, copie e cole a lista de espectros na lista de íons precursores e na caixa de intensidade. Limite a busca à composição de AAL desejada. Identifique os marcadores pelas razões massa/carga dos íons presentes no espectro de cada amostra.Se as porcentagens de ésteres metílicos de ácidos graxos estiverem disponíveis a partir de uma análise GCMS separada, adicione esses dados para obter as probabilidades das etiquetas. A análise lipídica tegumentar de mamíferos por TLC preparativa com HEA como fase móvel geralmente se resolve em quatro bandas distintas correspondentes a esteres FFAs, etiquetas e ésteres estéreos, cera EERs e esqualeno. Esses espectros de massa múltiplos foram obtidos para as etiquetas isoladas do morcego vermelho-do-leste.Típico para uma preparação de mamíferos não aquáticos. Os espectros contêm picos de íons na faixa de massa entre razão de carga de oito 50 a nove 10. As cadeias de ácidos graxos são os constituintes e marcadores predominantes dos AAL.Informações adicionais sobre as proporções de AAL podem ser deduzidas pela observação dos picos na região dos glicerídeos D AAL do espectro, que representam a fragmentação da etiqueta. O espectro MALDI exibe três regiões distintas de etiqueta onde a razão de carga principal é baseada no número de átomos de carbono. O tecido da asa do morcego vermelho oriental é caracterizado por picos dominantes nessas três regiões nas razões de carga principal 8 53 0,7 8, 79 0,7 e 907,8.Lembre-se de que, ao trabalhar com morcegos vivos ou eutanasiados, você deve obter todas as permissões necessárias para o manejo, armazenamento e transporte desses animais. Além disso, é necessário obter autorização do comitê institucional de cuidado e uso de animais, bem como do comitê institucional de biossegurança. Se estiverem sendo manipulados morcegos vivos ou tecido nervoso de morcegos, lembre-se de que todos os manipuladores devem estar vacinados contra a raiva.Além disso, ao trabalhar com certos patógenos de morcegos, como os *Geomyces destructans*, é necessário um laboratório com nível de biossegurança dois.

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