Baseado em celular Protocolo Ensaio para a predição prognóstica de escoliose idiopática Usando celular dielétrica Espectroscopia

O objetivo geral do experimento a seguir é prever o prognóstico da escoliose idiopática de acordo com o agrupamento funcional dos pacientes, rastreando sua resposta PBM C'S à ativação do GPCR R usando espectroscopia dielétrica celular. Isso é obtido cultivando pbmc na presença de fito hemaglutinina ou PHA para expandir o número de células. A expansão celular é concluída em um tubo, mantido em posição inclinada.

Como segundo passo, as células são tratadas com OSTEOPONTINA ou OPN, que aumenta ou reduz a atividade da proteína GI. Dependendo dos pacientes após o tratamento, a suspensão celular é transferida para a microplaca. Em seguida, as células são estimuladas com agonistas GI ou GS GPCR para determinar as mudanças de impedância resultantes.

Os resultados fornecem respostas cinéticas para todos os poços e as respostas integradas são então quantificadas com base nas mudanças de impedância. A implicação dessa técnica está muito além do simples diagnóstico. Assim, pela primeira vez, podemos detectar em um estágio inicial como pacientes sintomáticos em risco de desenvolver escoliose e, agora, sabendo quem desenvolverá escoliose ou em que estágio estão, podemos fornecer novas terapias para tratá-los.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a exposição a raios-x, é que esta técnica permite prever a escoliose osteopática progno sem necessidade de medir covid e sem risco à saúde. A coisa mais recente, a técnica agora será a nossa assistente de pesquisa Nita Franco, Descongelamento de alíquota congelada de células mononucleares do sangue periférico em um banho-maria de 37 graus Celsius. Usando uma pipeta estéril, transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mililitros contendo 15 mililitros de meio completo e centrífuga.

As células aspiram o sobrenadante. Em seguida, suspenda suavemente o pellet celular em um mililitro de meio PHA, complete o volume para 20 mililitros com o mesmo meio tampando o tubo frouxamente para permitir a entrada de ar. Incube o tubo durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono para permitir que os linfócitos quiescentes se transformem em linfoblastos de proliferação rápida.

Aperte completamente as tampas e peletize as células por centrifugação. Remover o sobrenadante por aspiração. Suspenda suavemente o pellet celular em um mililitro de meio completo.

Complete o volume para 20 mililitros com o mesmo meio e tampe o tubo frouxamente durante a noite para expandir o número de células. Após duas lavagens com 10 mililitros de RPMI 1640, ressuspenda suavemente o pellet celular em 600 microlitros de RPMI 1640. Meça a concentração e a viabilidade celular usando um contador de células automatizado e um analisador de viabilidade.

Em seguida, adicione um volume apropriado de RPMI 1640 para ajustar a uma concentração celular de 1,5 vezes 10 elevado à quinta célula por 20 microlitros. Transfira 100 microlitros da suspensão para dois tubos estéreis de 1,5 mililitro eend orph. Adicione osteopontina recombinante em um tubo a uma concentração final de 0,5 microgramas por mililitro.

Adicione um volume igual de PBS ao segundo tubo. Misture suavemente cada condição pipetando duas vezes usando uma pipeta estéril ajustada para 100 microlitros. Em seguida, adicione cinco microlitros de RPMI 1640 a cada poço de uma placa de 96 poços e centrifugue a placa a 200 GS por três minutos para remover quaisquer bolhas de ar para transferir as células do tubo para a microplaca.

Pipete suavemente para cima e para baixo uma vez para garantir uma suspensão uniforme das células. Semear 40 microlitros de suspensão celular por poço em duplicata quádrupla para células não tratadas e em duplicata para células tratadas com ROPN ou PBS. Deixe a placa celular sob o capô estéril por cinco minutos para permitir que as células descansem e se assentem uniformemente no fundo do poço.

Para otimizar o efeito da cultura de OPN, as células por 18 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono equilibram as culturas em temperatura ambiente por cerca de 30 minutos. Enquanto isso, prepare um mililitro de somatostatina 100 micromolar e isoproterenol em RPMI 1640. Encha a placa composta dispensando 20 microlitros em poços apropriados.

Cubra a placa composta com um selo curável. Carregue as pontas da pipeta de placa e a placa composta no sistema baseado em CDS. Nomeie a placa no software de instrumento baseado em CDS.

Vá para a lista de protocolos e selecione o protocolo apropriado para iniciar o protocolo. Clique em iniciar. O sistema fluídico integrado adiciona simultaneamente os compostos a todos os poços.

O sistema baseado em CDS coleta automaticamente os dados por 15 minutos após a viabilidade da célula da edição composta ter sido comparável entre todas as amostras com valores consistentes na faixa de 86 e 96%Em contraste, altas variações foram observadas no número de células. Dentre as amostras das 32 amostras utilizadas, duas apresentaram número insuficiente de células e não foram classificadas. Este exemplo mostra a classificação funcional de acordo com o grau de desequilíbrio entre GI e sinalização GI.

A avaliação do efeito da OPN em resposta à estimulação gastrointestinal revelou que a OPN aumentou a resposta nos pacientes 353 e 371. Em contraste, a resposta foi reduzida em mais de 50% nos pacientes 345 e 382 e em menos de 50% no paciente 370 após o tratamento com ROPN. Assim, de acordo com nossos critérios de classificação, pudemos categorizar os pacientes 353 e 371 no GF um, os pacientes 300 de 45 e 382 no GF dois e o paciente 370 no GF três.

Paralelamente, todos os pacientes foram rastreados quanto à sua resposta à estimulação da proteína gastrointestinal e comparados aos indivíduos controle. Como esperado, todos os pacientes foram menos responsivos do que os indivíduos de controle. Pacientes classificados no mesmo grupo funcional exibiram níveis semelhantes de resposta máxima.

A classificação de uma grande coorte de pacientes com SC regularmente acompanhados em nossa clínica especial no Hospital San Justine revelou que os três grupos funcionais foram distribuídos de forma semelhante. Entre os casos moderados, o GF dois foi predominante entre os casos graves. Depois de esperar por este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como classificar o paciente em dois, três grupos funcionais usando espectroscopia dielétrica celular.