Name: Baseado em celular Protocolo Ensaio para a predição prognóstica de escoliose idiopática Usando celular dielétrica Espectroscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-16T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprenda a prever o prognóstico da escoliose idiopática usando espectroscopia dielétrica celular em PBMCs. Este ensaio não invasivo classifica pacientes em grupos funcionais para intervenção precoce.

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Este trabalho foi financiado por doações do La Fondation Yves Cotrel de l&#39;Institut de France, Paris, França (ao Dr. Moreau), The Canadian Institutes of Health Research (PP2 conceder-99466 com o Dr. Moreau) e da Quarta Dimensão Spine LLC , New York, EUA (bolsa de pesquisa do Dr. Moreau).

Todo o procedimento é realizado sob o capô biológica estéril e todas as soluções e equipamentos que entram em contato com as células devem ser estéreis. 1. Preparação de soluções essenciais <ol><li> Preparar as soluções de acordo com a Tabela 1. </li><li> Mantenha a solução de sal equilibrada (BSS), à temperatura ambiente e todas as outras soluções a 4 ° C até ao momento da utilização. </li><li> Meios de frio aquecer a 37 ° C em banho-maria durante alguns minutos antes de usar. </li></ol> 2. Preparação e armazenamento de PBMC <ol><li> Recolha de 10 ml de sangue total em tubos de recolha tratados com EDTA para preparar duas alíquotas de PBMC usando 5 ml para cada alíquota. </li><li> Transferência de 5 ml de sangue total a partir do tubo de recolha tratados com EDTA a um tubo de 50 ml. </li><li> Adicionar um volume igual de BSS e misture amostra por pipetagem suave para cima e para baixo. </li><li> Colocar 3 ml de Ficoll em dois tubos Falcon de 15 ml. </li><li> Camada cuidadosamente 4,5 mldiluído de mistura de sangue sobre o Ficoll em cada tubo. </li><li> Deixe os tubos descansar por até 5 min para favorecer uma clara separação do sangue e Ficoll. </li><li> Centrifugar os tubos a 400 xg durante 30 minutos à temperatura ambiente sem travão. </li><li> Cuidadosamente remover os tubos da centrífuga de forma a não perturbar a disposição em camadas. As PBMCs são visíveis na interface BSS / Ficoll. </li><li> Colheita da camada turva de PBMC na interface dos dois tubos com uma pipeta e transferido para um novo tubo de 50 ml. </li><li> Adicionar 20 ml de meio completo. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 288 xg durante 7 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Retirar o sobrenadante por aspiração. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de meio suplementares. </li><li> Adicionar um volume igual de meio de congelamento. </li><li> Transferência da suspensão de células para um frasco de congelação. </li><li> Colocar o frasco de congelação num recipiente cryofreezing com isopropanol. </li><li> Armazenar o recipiente de congelamento a -80 ° C durante a noite. </li><li> Transfer as PBMC congelados alíquota a azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo. </li></ol> 3. Ensaio Funcional 1. Dia 1 <ol><li> Coloque alíquota a partir de azoto líquido, em banho de água a 37 ° C durante um minuto ou até descongelar. </li><li> Transferência da suspensão de células para um tubo de 50 ml com uma pipeta estéril. </li><li> Adicionar 15 ml de meio completo e as células para baixo girar a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Retirar o sobrenadante por aspiração. </li><li> Gentilmente suspender pellet celular em 1 ml de mídia PHA. </li><li> Completar o volume para 20 ml com a mesma mídia. </li><li> Tapar o tubo solto para permitir a entrada de ar. </li><li> Deixar o tubo durante a noite a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 para permitir que os linfócitos quiescentes para se transformar em linfoblastos rapidamente proliferadas. </li></ol> 2. Dia 2 <ol><li> Pegue o tubo para fora da incubadora, parafuso das tampas completamente e girar as células para baixo a 200 xg por 5 minà temperatura ambiente. </li><li> Retirar o sobrenadante por aspiração. </li><li> Suavemente suspender sedimento celular em 1 ml de meio completo. </li><li> Completar o volume para 20 ml com a mesma mídia. </li><li> Tapar o tubo solto para permitir a entrada de ar. </li><li> Deixar o tubo durante a noite a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 para expandir os números de células. </li></ol> 3. Dia 3 <ol><li> Obter o tubo para fora da incubadora, as tampas de parafuso completamente e girar para baixo as células a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Retirar o sobrenadante por aspiração. </li><li> Lave as células duas vezes com 10 ml de meio RPMI-1640 por centrifugação a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Suavemente ressuspender o sedimento celular em 600 ul de meio RPMI-1640. </li><li> Medir a concentração de células e viabilidade, utilizando um contador de células automático e analisador de viabilidade. </li><li> Adicionar o volume apropriado de meio RPMI-1640 para se ajustar a uma concentração celular de 1,5 x 10 5 cells/20 ul. </li&gt; <li> Tratar as células com OPN recombinante (rOPN) ou de veículo (PBS) em 1,5 ml de Eppendorf. <ol><li> Transferir 100 uL de suspensão de células para dois tubos de 1,5 ml esterilizados Eppendorf. </li><li> Adicionar rOPN em um tubo para uma concentração final de 0,5 ug / ml. </li><li> Adicionar um volume igual de PBS no segundo tubo. </li><li> Misture delicadamente cada condição pipetando cima e para baixo duas vezes, utilizando um conjunto pipeta estéril de 100 ml. </li></ol></li><li> Prepare a pequena amostra de 96 poços de microplacas. <ol><li> Adicionar 5 mL de meio RPMI-1640 a cada poço. </li><li> Centrifugar a placa a 200 xg durante 3 minutos para remover quaisquer bolhas de ar. </li></ol></li><li> Semente as células não tratadas, bem como as células tratadas com rOPN ou PBS. <ol><li> Antes da transferência de células a partir de tubo de microplacas, pipetar suavemente para cima e para baixo uma vez, para assegurar uma suspensão uniforme de células. </li><li> Adicionar 40 ul de suspensão de células por poço em quadruplicado para as células não tratadas, em duplicado para rOPN PBS ou células tratadas. Refer a Figura 1 para o design. Este desenho permite que 12 pacientes a ser testado na mesma microplaca. </li><li> Deixar a placa de células sob o capô estéril durante 5 minutos para permitir que as células de repouso e se estabelecer de forma uniforme para o fundo do poço antes de colocar na incubadora. </li></ol></li><li> Incubar a placa durante 18 horas a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 para optimizar o efeito de OPN. </li></ol> 4. Dia 4 <ol><li> Executar a placa com os compostos. <ol><li> Pegue a placa de fora da incubadora e deixá-lo à temperatura ambiente por cerca de 30 min. </li><li> Prepare 1 ml de 100 mM de somatostatina e isoproterenol em meio RPMI-1640 por adição de 10 ul de solução de reserva (10 mM) em 990 ul de meio RPMI-1640. </li><li> Encha o prato composto por dispensar 20 l em poços apropriados como indicado na Figura 2. </li><li> Cubra o prato composto com um selo de pré-cortados perfurável para evitar alteração na concentração de composto devido à evaporação antesou durante a incubação no sistema à base de CDS. </li><li> Placa de carga da pilha, pontas de pipeta e placa de composto para o sistema baseado em CDS. </li><li> Nome da placa no software do aparelho baseado em CDS. </li><li> Selecione o protocolo apropriado. O protocolo editado para a classificação com PBMC é chamado de &quot;células Agonist não aderentes pequena amostra Placa RT 15 min &#39;. Vá para a caixa de protocolo e selecione este protocolo na lista de protocolos </li><li> Iniciar o protocolo clicando em &#39;Start&#39;. </li><li> O sistema de fluidos integrada adiciona simultaneamente os compostos de todos os poços por injecção de 5 uL por cavidade para se conseguir uma concentração final de 10 pM num volume total de 50 ul. </li><li> O sistema baseia-CDS recolhe automaticamente os dados para 15 minutos após a adição do composto. </li></ol></li><li> A análise dos dados <ol><li> Selecione baixas e altas faixas de freqüências para usar quando o cálculo dos valores extraídos para a nãoAs células aderentes. </li><li> Selecione a correção de deriva para corrigir a mudança linear em medidas de impedância da linha de base ao longo do tempo. </li><li> Selecione filtragem de dados para reduzir as variações na medição da resposta cinética devido ao ruído eletrônico e além composto. </li><li> Selecione o método Max-Min para o tempo de análise total. </li><li> Exportar dados para o Excel na opção de formato de placa. </li><li> Calcular delta L (ÄG) subtraindo a média da amplitude de resposta à estimulação Gi (RmGi) a partir da média da magnitude da resposta ao estímulo Gs (RMGS) utilizando a seguinte fórmula: ÄG = RmGi - RMGS </li><li> Calcula-se a percentagem do efeito de dobragem (Fe) de OPN em resposta Gi-mediada dividindo a média da amplitude de resposta à estimulação Gi na presença de OPN (RmGiOPN) com a média da amplitude de resposta para GI estimulação na presença de PBS ( RmGiPBS) utilizando a seguinte fórmula: Fe = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS) </li><li> Consulte Tcapaz 2 para classificar os pacientes. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Este trabalho levou a diversas patentes detidas pela University Hospital Sainte-Justine e muitos outros estão pendentes em vários países. Quarta Dimensão Spine LLC é a concessionária exclusiva do Hospital da Universidade de Sainte-Justine.

Nós descrevemos um procedimento detalhado de um teste baseado em células prognóstico para escoliose idiopática que é aplicável a células mononucleares do sangue periférico (PBMC) recém isolado ou conservado congelado por até um ano em nitrogênio líquido. Desde a utilização de PBMC recém-isoladas é complicado quando se testa grande número de indivíduos, o procedimento foi presenteado com PBMC congelados, que oferecem uma alternativa mais prática em ambiente clínico. No entanto, problemas com a acumulação de células durante o descongelamento foram encontrados quando PBMC congelados foram inicialmente utilizados, conduzindo, por vezes, a variabilidade inter-ensaio. Para maximizar ensaio reprodutibilidade, recomendamos evitar ciclo de congelamento-descongelamento e usando a amostra congelada apenas uma vez. O processo é muito simples, o que permite a detecção precisa da função da proteína Gi defeito num curto espaço de tempo. Usando este procedimento, crianças assintomáticas e com escoliose pode ser facilmente classificada para melhor prever sua evolução clínica, sem qualquer perigo para a sua saúde. HoWever, ao realizar a classificação de acordo com o grau de resposta à estimulação máxima Gi em relação aos controles saudáveis ​​12, vários requisitos para os assuntos de controle devem ser cumpridos. De fato, a fim de ter uma coorte comparação adequada, os indivíduos do grupo controle deve ser a idade e sexo do, não estar em qualquer tipo de medicação, e fornecer informações privadas, como a história individual / familiar passado médica. Estes requisitos podem constituir um obstáculo importante para o recrutamento de indivíduos controle. Por conseguinte, a realização de classificação por análise do grau de desequilíbrio entre a resposta e Gi Gs estimulação proteína no mesmo indivíduo, é ideal para eliminar a necessidade da utilização de sujeitos de controlo. A utilização do sistema à base de CDS para realizar este teste prognóstico é significativa em termos de proporcionar simultaneamente Gi-e respostas celulares mediadas Gs no mesmo ensaio. Embora muitos pacientes podem ser classificados sem amambigüidade utilizando a gama dinâmica fixa para este ensaio, um pequeno número de pacientes que apresentam valores no limite de intervalos, tal como ilustrado pelos resultados do presente relatório. Para discriminar estes indivíduos, que foram introduzidas a avaliação do efeito de OPN em resposta à estimulação Gi, demonstrando que a OPN induz um efeito diferencial em resposta celular mediada por Gi entre os três grupos funcionais. Com efeito, verificou-se que em presença de OPN, resposta a estimulação Gi aumenta em que FG1, ao mesmo tempo que diminui em FG2 e FG3, a uma maior extensão no FG2. Apesar do elevado custo de OPN, o uso desta quimioquina é essencial para distinguir os casos ambíguos, e, por conseguinte, aumentar a precisão do nosso ensaio de classificação. Contudo, este ensaio tem uma desvantagem na medida em que um mínimo de 1,5 x 10 5 células por poço, é necessário observar a resposta celular com o sistema com base em CDS sob as nossas condições experimentais. Certas amostras dos doentes não têm um número suficiente deAs células a serem testadas. Neste caso, é necessário recordar os pacientes para coleta de sangue adicional, que pode ser preocupante para as famílias e frustrante para a equipe médica e laboratorial. Estudos prospectivos são planejadas em nosso laboratório para resolver esse problema. No entanto, o protocolo actual baseia-se métodos simples e com provas dadas para preparar as células, enquanto o ensaio é automatizado usando um sistema de livre-etiqueta validado 13, 14, para monitorizar as respostas das células. A plataforma de ensaio é relativamente barata quando comparada com a plataforma genética disponível para o prognóstico de outras doenças. Além disso, o custo de todos os materiais descartáveis, incluindo os tubos de coleta de sangue, dicas, o eletrodo especial microplacas, e cônico e tubos de Eppendorf, e não é muito caro e é estimada em menos de US $ 3.000 para completar um teste para cerca de mil pacientes. Embora esta estimativa não inclui os custos de trabalho para a preparação de amostrase realização do teste, este teste permanece consideravelmente mais acessível do que as plataformas de sequenciamento de próxima geração. Notável, não é apenas a comparação de custos de plataformas genéticas, mas mais especificamente relacionadas ao campo da AIS, são os custos associados ao exame radiológico. Hoje, mais de um milhão de crianças nos EUA e cerca de 100.000 crianças no Canadá são diagnosticados com escoliose idiopática, eo custo total de diagnóstico e acompanhamento das crianças com escoliose através da exposição de raios-X é mais de 2,5 bilhões de dólares por ano na América do Norte. Assim, o nosso procedimento de ensaio de base celular que seria esperado para ser adequado para o rastreio e monitorização de crianças com escoliose idiopática, sem risco para a saúde e a custos mais baixos de rotina.

Escoliose idiopática é uma deformidade da coluna de causa desconhecida, geralmente definida como uma curvatura lateral maior do que 10 graus, acompanhadas por uma rotação vertebral 1. A condição afeta 4% da população pediátrica e é mais comumente diagnosticado entre as idades de 9 a 13 anos 2,3,4. O diagnóstico é primariamente de exclusão e é feita somente após a exclusão de outras causas de deformidade da coluna vertebral, como a malformação vertebral, neuromuscular ou doenças sindrômicas. Tradicionalmente, a assimetria trunkal é revelado por Adams teste frente de flexão e medido com escoliômetro durante o exame físico 5. O diagnóstico pode ser confirmado por observação radiográfica da curva e a medição do ângulo, utilizando o método de Cobb 6. Uma vez diagnosticada, a principal preocupação para os médicos no tratamento de crianças com escoliose é se a curva vai progredir. Com efeito, a progressão da curva é frequentemente imprevisível eé mais freqüentemente observada entre as meninas do que em meninos 7. Se não for tratada, a curva pode progredir drasticamente, criando deformidade física significativa e até mesmo problemas cardiopulmonares. Estas manifestações se tornar fatais quando a curva for superior a 70 ° 8,9. As opções atuais de tratamento para prevenir ou impedir a progressão da curva incluem órtese e cirurgia. Em geral, se preparando é recomendada para curvas entre 25-40 °, enquanto a cirurgia é reservada para as curvas superiores a 45 ° ou que não respondem a órtese. Aproximadamente, 10% das crianças diagnosticadas com escoliose idiopática têm progressão da curva exigindo cirurgia corretiva 10. Atualmente, não existe um método comprovado ou teste disponível para identificar este grupo de doentes. Consequentemente, todas as crianças diagnosticadas são submetidos a várias radiografias ao longo de vários anos, geralmente até atingirem a maturidade esquelética. Estima-se que os doentes com escoliose típicos terãoaproximadamente 22 exames radiológicos durante um período de 3 anos 11. Devido ao risco potencial de vários exames radiográficos, as abordagens alternativas que poderiam permitir a realização do prognóstico de escoliose idiopática, sem expor as crianças à radiação ionizante são fortemente desejável. Com o intuito de atender a essa necessidade, que já desenvolveu um ensaio de triagem baseada em células como teste preditivo para identificar mais cedo as crianças assintomáticas em risco de desenvolver escoliose idiopática. O teste prevê o resultado clínico em crianças assintomáticas e afectadas pelo examinando o estado funcional de proteínas Gi e classificar as crianças em três grupos funcionais (FG1, FG2 e GF3) de acordo com o grau de resposta à estimulação máxima proteína Gi 12 medido pelo CDS sistema baseado. Este sistema é largamente utilizado para avaliar a transdução de sinal através de proteínas G em vários tipos de células 13,14,15,16. Ela produz informação sobre oresposta total integrada das células aos estímulos externos, medindo mudanças na impedância após a ativação de receptores de superfície celular. As células são semeadas em microplacas que contêm eléctrodos no fundo dos poços e o sistema aplica uma pequena voltagem que induzem correntes extracelular e intracelular. Após a injecção composto para dentro do poço, os receptores da superfície celular são estimulados e os eventos de transdução de sinal de ocorrer, conduzindo a alterações celulares que afectam o fluxo de correntes extracelulares e transcelular, e, assim, afectar a grandeza medida. Com esta abordagem, os pacientes com escoliose e crianças em maior risco de desenvolver escoliose são menos sensíveis às Gi estimulação proteína quando comparados com indivíduos saudáveis, ea classificação é baseada na porcentagem de grau de redução em relação ao grupo controle. Os intervalos de classificação são fixos entre 10 e 40% para FG3, 40 e 60% ​​para FG2, e 60 e 90% para FG1 12. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Mais recentemente, tem modificações nesta abordagem, demonstrando que os três grupos funcionais podem ser claramente distinguidos de acordo com o perfil de desequilíbrio entre a resposta à estimulação Gi e Gs. Na verdade, descobrimos que a resposta à estimulação Gi predominou no FG3, enquanto nenhum desequilíbrio aparente foi observada em FG2. Em contraste, FG1 exibiu predominância da resposta à estimulação Gs. Além disso, nós fornecemos a evidência de que os pacientes pertencentes a FG2 correm mais risco de progressão para o ponto de precisar de cirurgia 17. A precisão do teste de classificação tem sido melhorada através da demonstração de um efeito diferencial da osteopontina (OPN) em resposta à estimulação Gi entre grupos funcionais. Aqui nós documentar os passos detalhados de procedimentos experimentais e analíticos deste teste funcional como atualmente realizados em nosso laboratório.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Wisent, Inc</td><td>350-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Therno Scientific Hyclone</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>Aldrich D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Fitohemaglutinina</td><td>Invitrogen (Gibco)</td> <td>10576-015</td><td></td></tr><tr><td>Osteopontina Humana Recombinante</td><td>R & D Systems, Inc</td><td>1433-OP/CF</td><td></td></tr><tr><td>Somatostatin</td><td>Tocris</td><td>1157</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>Tocris</td><td>1743</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent, Inc</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta estéreis</td><td>Axygen Scientific</td><td>301-06-451</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf estéreis</td><td>Ultident</td><td>24-MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>50 ml cônicos tubos</td><td>VWR International</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Cellkey pequena amostra 96W microplaca</td><td>Molecular Devices</td><td>1026496</td><td></td></tr><tr><td>Cellkey dicas</td><td>Cybio</td><td>OL3800-25-559N</td><td></td></tr><tr><td>Selos perfuráveis pré-cortados</td><td>Excel Scientific, Inc</td><td>XP-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Vicell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>731050</td><td>Contador de células automatizado</td></tr><tr><td>Capuz de cultura de células</td><td>Forma Scientific</td><td>1284</td><td>Classe II</td></tr><tr><td>Armazenamento de nitrogênio líquido</td><td>Thermo Scientific</td><td>CY5093570</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>VWR International</td><td>89032-204</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz padrão</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMIL LED</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células</td><td>Thermo Scientific</td><td>51019557</td><td>5% CO2 a 37 > C</td></tr><tr><td>Centrífuga de baixa velocidade</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004364</td><td></td></tr><tr><td>Cellkey sistema</td><td>Molecular Devices</td><td>1019185</td><td>instrumento baseado em CDS</td></tr></tbody></table>

baseado em celular protocolo ensaio para a predição prognóstica de escoliose idiopática usando celular dielétrica espectroscopia

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Este protocolo detalha o procedimento experimental e analítico para um ensaio baseado em células desenvolvido em nosso laboratório como um teste funcional para prever o prognóstico de escoliose idiopática em crianças assintomáticas e afetados. O ensaio consiste na avaliação do estado funcional das proteínas Gi e Gs em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) por espectroscopia dielétrica celular (CDS), utilizando um instrumento baseado em CDS automatizado, bem como a classificação das crianças em três grupos funcionais (FG1 , FG2, FG3) no que diz respeito ao perfil de desequilíbrio entre o grau de resposta a Gi Gs e proteínas de estimulação. A classificação é ainda confirmada pelo efeito diferencial da osteopontina (OPN) em resposta à estimulação Gi entre os grupos ea progressão grave da doença é referenciado por FG2. Aproximadamente, um volume de 10 ml de sangue é necessário para extrair PBMC por gradiente de Ficoll-e as células são então armazenadas em azoto líquido. O número adequado de PBMCs para realizar o ensaio é obtido após dois dias de cultura de células. Essencialmente, as células são primeiro incubadas com phytohemmaglutinin (PHA). Após 24 horas de incubação, o meio é substituído por um meio de cultura isento de PHA durante mais 24 horas adicionais antes da sementeira celular e tratamento de OPN. As células são então espectroscopicamente selecionados para suas respostas a somatostatina e isoproterenol, que, respectivamente, ativam proteínas Gi e Gs através de seus receptores cognatos. Ambos somatostatina e isoproterenol são injectados simultaneamente com um sistema de fluidos integradas e respostas das células são monitorizados durante 15 min. O ensaio pode ser realizado com PBMC frescos ou congelados e que o processo for concluído dentro de 4 dias.

A viabilidade das células foi comparável entre todas as amostras com valores consistentes na gama de 86 e 96%. Em contraste, foram observados elevados variações no número de células entre as amostras (Tabela 3). Das 32 amostras utilizadas, dois tiveram número insuficiente de células e não foram classificados. Um exemplo dos resultados da classificação funcional de acordo com o grau de desequilíbrio entre Gi e sinalização Gs é mostrado na Figura 3. O eixo vertical desta figura está dividida em três secções, que delimitam os grupos funcionais, com gamas dinâmicas estabelecidas como&gt; 10 para FG3, entre 10 e -10 para FG2, e, finalmente, &lt;-10 para FG1. Entre 30 pacientes testados aqui, 14, 6 e 5 pacientes foram claramente classificados em FG3, FG2 e FG1, respectivamente, enquanto cinco pacientes, nomeadamente 345, 353, 370, 371, e 382, ​​estavam no limite de intervalos. A avaliação do efeito de OPN em resposta à estimulação Gi revelou que a OPN um aumento da resposta em papacientes 353 e 371. Em contraste, a resposta foi reduzida em mais de 50% em doentes 345 e 382 e pelo menos de 50% em paciente de 370 a seguir ao tratamento rOPN. Assim, de acordo com os nossos critérios de classificação (Tabela 2), fomos capazes de categorizar os pacientes 353 e 371 em FG1, os pacientes 345 e 382 em FG2 e paciente 370 em FG3. Em paralelo, todos os pacientes foram selecionados para a sua resposta ao estímulo da proteína Gi e comparados aos controles. Como esperado, todos os pacientes eram menos sensíveis do que os indivíduos controle e pacientes classificados no mesmo grupo funcional pelo nosso novo procedimento apresentaram níveis semelhantes de resposta máxima (Figura 5). Além disso, a disparidade entre os pacientes de cada grupo funcional foi consistente com a nossa gama clássica de classificação 12, validando nosso novo procedimento. A classificação de um grande grupo de pacientes com escoliose regularmente seguido em nossa clínica especial em Sainte-Justine Hospital revelou que os trêsgrupos funcionais foram distribuídas de maneira semelhante entre os casos moderados, enquanto o FG2 predominou nos casos graves (Figura 6), a identificação de pacientes classificados para este grupo funcional como um maior risco de progressão da doença grave e indicando que este teste de classificação podem ser úteis no prognóstico de escoliose idiopática. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="5"> Solução A </td><td> D-glucose anidra </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> CaCl 2 2H 2 O </td><td> 0,05 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 0,98 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5,4 mM </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 145 mM </td></tr><tr><td> Solução B </td><td> NaCl </td><td> 140 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Solução salina equilibrada (BSS) </td><td> Solução A </td><td> 1 volume </td></tr><tr><td> Solução B </td><td> 9 de volume </td></tr><tr><tdrowspan = &quot;3&quot;&gt; mídia completa </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibióticos antimicótico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td rowspan="3"> Meios complementares </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibióticos antimicótico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Mídia Congelamento </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibióticos antimicótico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 20% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Mídia PHA </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibióticos antimicótico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Fito-hemaglutinina </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Essencialsoluções. <table border="1"><tbody><tr><td> Intervalos dinâmicos com ÄG </td><td> Grupos Funcionais </td><td> Intervalos dinâmicos com Fe </td></tr><tr><td> ÄG &lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> Fe&gt; 100% </td></tr><tr><td> -10 &lt;ÄG &lt;10 </td><td> FG2 </td><td> Fe &lt;50% </td></tr><tr><td> ÄG&gt; +10 </td><td> FG3 </td><td> 50% &lt;Fe &lt;95% </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Categorização de grupos funcionais de acordo com faixas dinâmicas estabelecidas com ÄG e Fe. <table border="1"><tbody><tr><td> Pacientes </td><td> Viabilidade (%) </td><td> A concentração das células (x 10 6 / ml) </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88,7 </td><td> 11.64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90,5</td><td> 13,6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94,4 </td><td> 8.54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94,3 </td><td> 25.79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94,2 </td><td> 27.36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94,6 </td><td> 8,52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91,2 </td><td> 0,82 </td><td> Número insuficiente de células </td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90,3 </td><td> 8,92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92,6 </td><td> 8.28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91,3 </td><td> 12,75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86,9 </td><td> 7,62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91,2 </td><td> 7,51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90,3 </td><td> 9.36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95,1 </td><td> 16.94 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92,3 </td><td> 13.89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89,4 </td><td> 7,67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93,5 </td><td> 7,84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86,5 </td><td> 2.2 </td><td> Número insuficiente de células </td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92,6 </td><td> 15,69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93,4 </td><td> 10,9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92,5 </td><td> 19,93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88,8 </td><td> 10.68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93,9 </td><td> 16.86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92,9 </td><td> 15,67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93,1 </td><td> 9.99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93,6 </td><td> 13.57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ Td&gt; <td> 92,6 </td><td> 19.86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91,1 </td><td> 8.46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93,9 </td><td> 14.82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92,1 </td><td> 23.06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92,9 </td><td> 11.82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89,1 </td><td> 7,73 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 3. Viabilidade por cento e a concentração das células, como determinado utilizando um contador de células automático e analisador de viabilidade. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> Figura 1. Design para a semeadura de células. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> Figura 2.Projete para a distribuição de compostos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> Figura 3. Faixa dinâmica da classificação funcional usando o sistema baseado em CDS. Gráfico ilustra valores do grau de desequilíbrio entre as respostas a Gi e Gs estimulação obtida em PBMC de pacientes com escoliose idiopática. Os valores foram medidos pelo sistema baseado em CDS em resposta a 10 uM de somatostatina e isoproterenol. Cada ponto representa a ÄG de ambas as respostas em duplicado. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> Figura 4. Efeito de rOPN em resposta à estimulação de PBMC Gi. As células foram de soro de fome durante 18 horas na presença ou ausência de 0,5 ug / ml rOPN e depois estimuladas com 10<html> 56; M de somatostatina para iniciar a resposta celular mediada por Gi. Os dados do gráfico foi gerado a partir de impedância máxima, mínima e correspondem à média de resposta em duplicado. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> Figura 5. Estado funcional da proteína Gi em PBMC de controle e assuntos scoliostic. PBMCs de sujeitos de controlo e de doentes com escoliose foram expostos a concentrações crescentes de somatostatina para estimular proteínas Gi através de receptores de somatostatina endógena. A resposta celular foi medida por um sistema baseado em CDS como descrito na secção do processo. As curvas foram geradas a partir de máxima mínima impedância. Cada curva representa a regressão não-linear. Os dados foram normalizados para a resposta máxima em células de indivíduos de controlo e cada ponto corresponde à média de resposta em duplicado./ 50768/50768fig5large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver maior figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> Figura 6. Distribuição dos grupos funcionais entre os diferentes fases de escoliose. Um grande grupo de pacientes com escoliose com 794 moderados (curvaturas entre 10-44 °) e 162 casos graves (curvatura maior que 45 °) regularmente acompanhados no Hospital Sainte-Justine, foram classificados de acordo com seu grau de desequilíbrio entre a resposta a Gi e Gs estimulação. As respostas foram medidas pelo sistema baseado em CDS em resposta a 10 uM de somatostatina e isoproterenol.

Um protocolo estruturada é apresentado para um ensaio de base celular como um teste funcional para prever o prognóstico de escoliose idiopática usando espectroscopia dieléctrica celular (CDS). O ensaio pode ser realizado com as células mononucleares do sangue periférico frescos ou congelados (PBMC) e o procedimento for concluído no prazo de 4 dias.

Baseado em celular Protocolo Ensaio para a predição prognóstica de escoliose idiopática Usando celular dielétrica Espectroscopia

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

O objetivo geral do experimento a seguir é prever o prognóstico da escoliose idiopática de acordo com o agrupamento funcional de pacientes por meio da análise da resposta dos PBMC à ativação de RCPG utilizando espectroscopia dielétrica celular. Isso é alcançado cultivando-se os PBMC na presença de fito-hemaglutinina ou PHA para aumentar o número de células. A expansão celular é realizada em um tubo mantido em posição inclinada.Como segundo passo, as células são tratadas com OSTEOPLONTINA ou OPN, o que aumenta ou reduz a atividade da proteína GI. Dependendo dos pacientes após o tratamento, a suspensão celular é transferida para a microplaca. Em seguida, as células são estimuladas com agonistas do GI ou do GS do receptor acoplado à proteína G (GPCR) para determinar as alterações resultantes na impedância.Os resultados fornecem respostas cinéticas para todas as placas, e as respostas integradas são então quantificadas com base nas alterações de impedância. A implicação desta técnica vai muito além do simples diagnóstico. Assim, pela primeira vez, podemos detectar em estágio inicial pacientes assintomáticos com risco de desenvolver escoliose, e agora, sabendo quem desenvolverá escoliose ou em que estágio se encontram, podemos oferecer novas terapias para tratá-los.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a exposição a raios X, é que ela permite prever a prognose da escoliose osteopática sem necessidade de medir covid e sem risco à saúde. A etapa mais recente, a técnica agora será conduzida pela nossa assistente de pesquisa Nita Franco, descongelamento de alíquota congelada de células mononucleares do sangue periférico em banho-maria a 37 graus Celsius. Usando uma pipeta estéril, transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mililitros contendo 15 mililitros de meio completo e centrifugue.As células aspiram o sobrenadante. Em seguida, suspenda suavemente o pellet celular em um mililitro de meio PHA e complete o volume para 20 mililitros com o mesmo meio, tampando o tubo de forma frouxa para permitir a entrada de ar. Incube o tubo durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono para permitir que os linfócitos quiescentes se transformem em linfoblastos em rápida proliferação.Aperte completamente as tampas e pelotize as células por centrifugação. Remova o sobrenadante por aspiração. Suspenda suavemente o pellet celular em um mililitro de meio completo.Complete o volume até 20 mililitros com o mesmo meio e tampe o tubo levemente para cultivar durante a noite, a fim de expandir o número de células. Após duas lavagens com 10 mililitros de RPMI 1640, ressuspenda suavemente o pellet celular em 600 microlitros de RPMI 1640. Meça a concentração e a viabilidade celular utilizando um contador automatizado de células e um analisador de viabilidade.Em seguida, adicione um volume apropriado de RPMI 1640 para ajustar a concentração celular a 1,5 vezes 10 à quinta células por 20 microlitros. Transfira 100 microlitros da suspensão para dois tubos estéreis de 1,5 mililitro com tampa tipo "eppendorf". Adicione osteopontina recombinante em um dos tubos até uma concentração final de 0,5 microgramas por mililitro.Adicione um volume igual de PBS ao segundo tubo. Misture suavemente cada condição pipetando duas vezes com uma pipeta estéril ajustada em 100 microlitros. Em seguida, adicione cinco microlitros de RPMI 1640 a cada poço de uma placa de 96 poços e centrifugue a placa a 200 ×g por três minutos para remover quaisquer bolhas de ar antes de transferir as células do tubo para a microplaca.Pipete suavemente para cima e para baixo uma vez para garantir uma suspensão uniforme de células. Semee 40 microlitros de suspensão celular por poço em quádruplo para células não tratadas e em duplicata para células tratadas com ROPN ou PBS. Deixe a placa celular sob a capela estéril por cinco minutos para permitir que as células repousem e se acomodem uniformemente no fundo do poço.Para otimizar o efeito da cultura de OPN, incube as células por 18 horas a 37 graus Celsius em um incubador de dióxido de carbono e equilibre as culturas à temperatura ambiente por cerca de 30 minutos. Enquanto isso, prepare um mililitro de somatostatina e isoproterenol de 100 micromolar em RPMI 1640. Preencha a placa de compostos dispensando 20 microlitros nos poços apropriados.Cubra a placa de compostos com um selo curável. Carregue as ponteiras de pipeta e a placa de compostos no sistema baseado em CDS. Nomeie a placa no software do instrumento baseado em CDS.Vá até a lista de protocolos e selecione o protocolo apropriado para iniciá-lo. Clique em iniciar. O sistema fluidico integrado adiciona simultaneamente os compostos a todas as poças.O sistema baseado em CDS coleta automaticamente os dados durante 15 minutos após a adição do composto; a viabilidade celular foi comparável entre todas as amostras, com valores consistentes na faixa de 86 a 96%. Em contraste, foram observadas grandes variações no número de células. Dentre as 32 amostras utilizadas, duas apresentavam um número insuficiente de células e não foram classificadas. Este exemplo mostra a classificação funcional de acordo com o grau de desequilíbrio entre sinalização GI e GI.A avaliação do efeito da OPN em resposta à estimulação GI revelou que a OPN aumentou a resposta nos pacientes 353 e 371. Em contraste, a resposta foi reduzida em mais de 50% nos pacientes 345 e 382 e em menos de 50% no paciente 370 após o tratamento com ROPN. Assim, de acordo com nossos critérios de classificação, fomos capazes de categorizar os pacientes 353 e 371 no FG um, os pacientes 345 e 382 no FG dois e o paciente 370 no FG três.Paralelamente, todos os pacientes foram avaliados quanto à sua resposta à estimulação com proteína GI e comparados a indivíduos controle. Como esperado, todos os pacientes foram menos responsivos do que os indivíduos controle. Pacientes classificados no mesmo grupo funcional exibiram níveis semelhantes de resposta máxima.A classificação de uma grande coorte de pacientes com SC acompanhados regularmente em nossa clínica especial no Hospital San Justine revelou que os três grupos funcionais foram distribuídos de forma semelhante. Entre os casos moderados, o GF dois foi predominante nos casos graves. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como classificar pacientes em dois ou três grupos funcionais utilizando espectroscopia dielétrica celular.

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Baseado em celular Protocolo Ensaio para a predição prognóstica de escoliose idiopática Usando celular dielétrica Espectroscopia (Vídeo) | JoVE Journal

Baseado em celular Protocolo Ensaio para a predição prognóstica de escoliose idiopática Usando celular dielétrica Espectroscopia

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