Name: Recuperação de antígeno induzida por calor: um método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante a neurogênese do hipocampo adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda a recuperação de antígenos induzida por calor para visualizar tipos de células progenitoras durante a neurogênese do hipocampo adulto em tecido cerebral de camundongo. Este método melhora a detecção de marcadores genéticos em células-tronco neurais.

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A metodologia foi originalmente desenvolvida no laboratório do Dr. Hongjun Song no Instituto de Engenharia Celular, Departamento de Neurologia, Johns Hopkins School of Medicine. Este trabalho foi financiado pelo NIMH (R00MH090115), NARSAD, o Fundo de Pesquisa do Câncer Mayo da Ordem Fraternal das Águias e um pacote inicial da Fundação Mayo concedido ao MHJ e ao Programa de Pesquisa Científica Básica por meio da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (A3014385) concedido ao WRK.

1. Pré-imuno-histoquímica: perfusão e histologia
<ol>
	<li>Perfundir camundongos de acordo com um protocolo transcárdico geral adaptado para camundongos e extrair os cérebros em paraformaldeído a 4% (PFA)9.</li>
	<li>Deixar o cérebro em PFA durante a noite a 4 °C (por exemplo, um tubo cónico de 10 ml cheio de PFA). Mantenha em PFA por pelo menos 12-24 horas, não mais do que 36 horas para fixação completa. Após a fixação durante a noite, esvazie o PFA do tubo cônico, mas deixe o cérebro dentro. Despeje 30% de sacarose no tubo e lave os cérebros por breves 5 segundos para remover qualquer PFA residual. Finalmente, encha o tubo contendo cérebros com 30% de sacarose novamente. Mantenha os cérebros em sacarose a 4 ° C até que os cérebros afundem no fundo do tubo.</li>
	<li>Corte seções cerebrais de 40 μm em um micrótomo. Consulte um atlas do cérebro de camundongos para começar a coletar seções desde o início do giro dentado até o fim. Conservar secções em solução anticongelante (uma receita simples é 300 g de sacarose em 500 ml de PBS 0,1 M e 300 ml de etilenoglicol) até estarem prontas para a imuno-histoquímica.</li>
	<li>Monte o tecido cortado em lâminas de microscópio projetadas especificamente para aderir fortemente ao tecido. Essas lâminas fornecem uma forte fixação ao tecido durante o estágio de ebulição. Depois de montar o tecido, deixe a lâmina secar por 10 min ou até que esteja totalmente seca. A secagem pode ser acelerada se a lâmina estiver apoiada contra uma superfície vertical com a borda inferior da lâmina em uma toalha de papel. Se mais de uma lâmina estiver sendo montada, a (s) outra (s) lâmina (s) podem ser deixadas secas durante esse tempo (1-2 horas está bem) até que estejam prontas para prosseguir para a próxima etapa.</li>
	<li>Quando a lâmina estiver seca, lave com PBS três vezes por 5 min cada e seque novamente (tampão PBS = 0,137 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0119 M Na2PO4). Isso garante que qualquer produto químico anterior (como glicerol da solução de armazenamento anticongelante) seja suficientemente removido e não prejudique a aderência do tecido à lâmina.</li>
</ol>
2. Preparação de Reagentes e Equipamentos Menores
<ol>
	<li>Prepare a Solução A (0,1 M ou 19,21 g/l de ácido cítrico) e a Solução B (0,1 M ou 24,9 g/l de citrato de trissódio) nas quais as seções de tecido serão fervidas.</li>
	<li>Numa garrafa graduada, misturar 9 ml de solução A e 41 ml de solução B. Adicionar 450 ml de ddH2O a esta mistura.</li>
	<li>Despeje esta mistura em um recipiente vazio (por exemplo, uma caixa vazia de pontas de pipeta) que seja seguro para micro-ondas.</li>
</ol>
3. Recuperação de antígeno induzida por calor
<ol>
	<li>Ferva a solução feita na etapa 2 por 5 min na configuração padrão em um micro-ondas padrão. A solução começará a ferver a uma temperatura igual ou superior a 100 °C.</li>
	<li>Quando a fervura estiver concluída, remova cuidadosamente o recipiente do micro-ondas e coloque as lâminas secas nele, garantindo que a face da lâmina com as seções do hipocampo esteja voltada para baixo e totalmente exposta ao líquido. Se possível, coloque as lâminas em ângulo contra as paredes da caixa e empilhe outras lâminas ao redor delas. Certifique-se de que seu "encaixe" dentro da caixa esteja apertado para que os slides não tenham espaço para se mover um sobre o outro.</li>
	<li>Ferva esta mistura com lâminas por 7 min nas configurações padrão no micro-ondas. A solução irá ferver durante este tempo a uma temperatura igual ou superior a 100 °C.</li>
	<li>Durante este estágio de ebulição, encha dois baldes de gelo até a metade com gelo.</li>
	<li>Quando a fervura na etapa 3.3 estiver concluída, retire o recipiente do micro-ondas e coloque-o dentro de um dos baldes de gelo. Despeje o resto do gelo do outro balde ao redor do recipiente e cubra-o completamente. Deixe descansar por 1 hora.</li>
</ol>
4. Coloração de anticorpos primários e secundários
<ol>
	<li>Ao final do período de espera de 1 hora, remova as lâminas do recipiente e lave com tampão TBS-T 3x por 5 min cada. Qualquer aparelho pode ser usado para realizar essas lavagens básicas. (Tampão TBS = 50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, TBS-T = 0,05% Triton X-100 TBS tampão, TBS-TT = 4% tampão TBS-T de soro de burro).</li>
	<li>Após a lavagem, deixe as lâminas secarem em um local escuro (por exemplo, dentro de uma gaveta de bancada, coloque uma toalha de papel dentro da gaveta e incline a lâmina contra ela) por 5-10 min ou até que a lâmina esteja totalmente seca. Durante este período, prepare uma câmara para coloração noturna de anticorpos primários. Uma câmara de coloração simples pode incluir um recipiente com grande área de superfície preenchido com ddH2O e um estágio dentro do recipiente, sobre o qual a lâmina pode ser apoiada acima do ddH2O.</li>
	<li>Depois que a lâmina secar, desenhe um contorno ao redor das seções de tecido usando uma caneta repelente de água. Durante a etapa 4.5, esse contorno atua como uma barreira que impede que a mistura de anticorpos flua.</li>
	<li>Preparar a mistura de anticorpos primários em TBS-TT. São necessários pelo menos 500 μl para cobrir uma lâmina inteira, por exemplo, se o estoque de anticorpos estiver na concentração de 1:500, adicione 1 μl de anticorpo específico a 500 μl de TBS-TT). Utilize anticorpos primários conforme mencionado na tabela de reagentes.</li>
	<li>Coloque a lâmina seca em cima do stage na câmara de coloração. Adicione 500 μl dos anticorpos primários lentamente e cubra toda a superfície. Cubra todo o aparelho e embrulhe em papel alumínio para bloquear a luz externa. Deixe descansar durante a noite em temperatura ambiente.</li>
	<li>No dia seguinte, lave a lâmina três vezes por 5 min cada com tampão TBS-T. Deixe secar em uma área escura, conforme descrito na etapa 4.2.</li>
	<li>Preparar uma mistura de anticorpos secundários semelhante ao passo 4.4. Consulte a tabela de reagentes para anticorpos secundários.</li>
	<li>Coloque a lâmina seca na câmara de coloração conforme descrito nas etapas 4.2 e 4.5. Adicione 500 μl dos anticorpos secundários lentamente e cubra toda a superfície. Enrole a câmara de coloração em papel alumínio para protegê-la da luz externa. Deixe-o coberto e protegido da luz externa por pelo menos 2 horas em temperatura ambiente.</li>
	<li>Após a conclusão da coloração secundária, lave a lâmina três vezes por 5 min cada com tampão TBS-T. Deixe a lâmina secar em uma área escura. Após a secagem, coloque a solução de montagem e cubra a corrediça com uma lamínula evitando cuidadosamente qualquer introdução de bolhas. Deixe a lâmina descansar em uma área escura por pelo menos 2 horas antes da análise subsequente.</li>
	<li>Realize lapso de tempo ou análise confocal no tecido corado.</li>
</ol>

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Annual Reviews of Neuroscience. 28, 223-250 (2005).</li>
<li>Santarelli, L., Saxe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+hippocampal+neurogenesis+for+the+behavioral+effects+of+antidepressants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants.</a> Science. 301 (5634), 805-809 (2003).</li>
<li>Sahay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+adult+hippocampal+neurogenesis+is+sufficient+to+improve+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation.</a> Nature. 472 (7344), 466-4670 (2011).</li>
<li>Clelland, C. D., Choi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+role+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+spatial+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation.</a> Science. 325 (5937), 210-213 (2009).</li>
<li>Wang, J. W., David, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+fluoxetine+stimulates+maturation+and+synaptic+plasticity+of+adult-born+hippocampal+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic fluoxetine stimulates maturation and synaptic plasticity of adult-born hippocampal granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 28 (6), 1374-1384 (2008).</li>
<li>D'Amico, F., Skarmoutsou, E., Stivala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+in+antigen+retrieval+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">State of the art in antigen retrieval for immunohistochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 341 (1-2), 1-18 (2009).</li>
<li>Daneshtalab, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection%3A+Procedures+in+immunohistochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 127-135 (2010).</li>
<li>Jang, M. H., Bonaguidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+frizzled-related+protein+3+regulates+activity-dependent+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted frizzled-related protein 3 regulates activity-dependent adult hippocampal neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 12 (2), 215-223 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Porcelli, M., Cacciapuoti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-thermal+effects+of+microwaves+on+proteins%3A+Thermophilic+enzymes+as+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Non-thermal effects of microwaves on proteins: Thermophilic enzymes as model system.</a> FEBS Letters. 402 (2-3), 102-106 (1997).</li>
<li>Stone, J. R., Walker, S. A., Povlishock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+visualization+of+a+new+class+of+traumatically+injured+axons+through+the+use+of+a+modified+method+of+microwave+antigen+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The visualization of a new class of traumatically injured axons through the use of a modified method of microwave antigen retrieval.</a> Acta Neuropathologica. 97 (4), 335-346 (1999).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

As etapas mais críticas para a recuperação e coloração bem-sucedidas de antígenos de tipos de células progenitoras são: 1) utilização de tecido bem perfundido e fixado com a espessura coronal ideal; 2) permitir tempo suficiente para a ebulição e subsequente resfriamento durante a recuperação do antígeno; 3) destreza manual na montagem de cortes coronais fixos e prevenção de danos ao fazê-lo.
É fundamental na IHQ usar tecido perfundido que tenha sido submetido a fixação suficiente, mas não a fi...

A neurogênese, a geração de novos neurônios a partir de células-tronco neurais, agora é conhecida por ocorrer constantemente na idade adulta em duas regiões especializadas do cérebro. Estes incluem a zona subventricular (SVZ) do bulbo olfatório e a zona subgranular (SGZ) do giro dentado no hipocampo. Na última década, o campo da neurogênese do hipocampo adulto teve um trabalho significativo. A região tem atraído muito interesse, uma vez que os neurônios recém-nascidos na SGZ contribuem para aumentar a plasticidade neural que pode sustentar funções cerebrais específicas1-5. A neurogênese do hipocampo adulto tem sido implicada em desempenhar papéis importantes na regulação do humor, regeneração, aprendizado e memória. Assim, tem havido um esforço conjunto para entender o desenvolvimento e a regulação dos neurônios neste rico nicho neurogênico.
Um aspecto inevitável e importante do estudo da neurogênese do hipocampo adulto é a identificação de estágios separados pelos quais uma célula-tronco neural ativada passa em seu caminho para se tornar um neurônio totalmente funcional. Nesse processo, a célula-tronco neural quiescente é ativada e prossegue por meio de uma série de tipos de células progenitoras ativas precoces e ativas tardias (Figura 1). Essas populações distintas de progenitores neurais podem ser identificadas pela morfologia e sua expressão de marcadores moleculares como MCM2, nestina, Tbr2 e Doublecortin (DCX) e NeuN que orientam a conversão de RGLs em seus respectivos tipos de células progenitoras. Nestin é uma proteína de filamento intermediário que é expressa nas células semelhantes à glia radial e em alguns tipos de células progenitoras iniciais. Outro marcador é o Tbr2, que é especificamente expresso nas células progenitoras amplificadoras. A expressão do transgene Tbr2 é inicialmente desligada nas células do tipo 1 (como a glia radial), ativada nos progenitores do tipo 2a, tipo 2ab e tipo 2b e desligada entre os neurônios mais diferenciados do tipo 3 e imaturos (Figura 1). DCX é um marcador de migração neuronal que é expresso nos progenitores neurais Tipo 2ab, Tipo 2b e Tipo 3. Usando essa combinação de três marcadores, podemos rotular subtipos distintos de progenitores neurais. Estes incluem o tipo 1 (MCM2+nestina+Tbr2-), o tipo 2a (MCM2+nestina+Tbr2+), o tipo 2ab (MCM2+nestina-Tbr2+ parcial e MCM2+Tbr2+DCX-), o tipo 2b (MCM2+Tbr2+DCX+) e o tipo 3 (MCM2+Tbr2-DCX+). Células pós-mitóticas, como os neurônios imaturos e funcionalmente integrados, podem ser identificadas utilizando DCX e o marcador neuronal maduro, NeuN.
Os métodos tradicionais de IHC utilizam anticorpos para identificar antígenos para tipos específicos de células com base em sua expressão gênica. A visualização subsequente por meio de técnicas de imagem de alta resolução, como a microscopia confocal, pode ser utilizada para sua identificação. No entanto, atualmente existem problemas com esses métodos que não permitem a identificação eficiente das células semelhantes à glia radial e dos primeiros tipos de células progenitoras. É difícil identificar esses tipos de células específicos porque o anticorpo aplicado não é capaz de penetrar e se ligar eficientemente à proteína nestina. Nestin é a proteína de filamento intermediário que compreende os processos radiais produzidos pela célula radial semelhante à glia. A ligação ineficiente de um anticorpo ao antígeno pode ser resultado de muitos fatores, incluindo tempo de fixação, temperatura e técnica utilizada6-7. Para ajudar a resolver esses problemas, desenvolvemos um método de recuperação de antígeno ou "fervura". Além da nestina, este método de recuperação de antígeno também melhora a coloração para outros marcadores, como Ki67, BrdU, proteína glial fibrilar ácida (GFAP), Tbr2 e MCM2. Nosso método combina abordagens químicas e físicas. Envolve a fixação química do tecido em paraformaldeído e subsequente ebulição em alta temperatura de finas seções coronais do hipocampo em um tampão de um tratamento desnaturante e caotrópico. Isso aumenta a acessibilidade do antígeno ao anticorpo, melhora a especificidade do anticorpo e permite uma melhor identificação dos tipos de células progenitoras. Nossa abordagem é simples de usar, exigindo principalmente ferramentas e reagentes já disponíveis no laboratório. Nós o utilizamos extensivamente para estudar o desenvolvimento de células-tronco neurais e sua regulação por meio de fatores ambientais genéticos ou extrínsecos intrínsecos8.

<table><tbody><tr><td>SuperFrost Plus Slide</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td>Fornece forte aderência ao tecido do hipocampo durante a fervura</td></tr><tr><td>PVA/DABCO Mídia de montagem</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10981-100 ml</td><td> </td></tr><tr><td>Nestin (frango) </td><td>Aves Lab</td><td>NES</td><td>Marcador de células-tronco neurais</td></tr><tr><td>GFAP (coelho)</td><td>Dako North America</td><td>Z033401-2</td><td>Marcador de células-tronco neurais e astrócitos</td></tr><tr><td>MCM2 (camundongo)</td><td>Laboratório de Transdução BD</td><td>610701</td><td>Marcador</td></tr><tr><td>de proliferação DCX (cabra)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC8066</td><td>Marcador de neurônio imaturo</td></tr><tr><td>Tbr2 (coelho)</td><td>Abcam</td><td>Ab23345</td><td>Marcador progenitor amplificador</td></tr><tr><td>NeuN (camundongo)</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td>Marcador de neurônio maduro</td></tr><tr><td>Cy2 (anti-coelho)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-226-047</td><td> </td></tr><tr><td>Cy2 (anti-frango)</td> <td>Jackson Immunoresearch</td><td>303-165-006</td><td> </td></tr><tr><td>Cy5 (anti-mouse)</td> <td>Jackson Immunoresearch</td><td>315-175-047</td><td> </td></tr><tr><td>Cy5 (anti-cabra)</td> <td>Jackson Immunoresearch</td><td>305-165-047</td><td> </td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td> </td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>S2002</td><td>Dako</td><td>Caneta repelente de água</td></tr></tbody></table>

recuperação de antígeno induzida por calor: um método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante a neurogênese do hipocampo adulto

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Os métodos tradicionais de imuno-histoquímica (IHQ) após a fixação do tecido permitem a visualização de vários tipos de células. Estes normalmente procedem com a aplicação de anticorpos para ligar antígenos e identificar células com características que são uma função da biologia e desenvolvimento inerentes. A neurogênese do hipocampo adulto é um processo sequencial em que uma célula-tronco neural quiescente pode ser ativada e prosseguir através de estágios de proliferação, diferenciação, maturação e integração funcional. Cada fase é distinta com uma morfologia característica e regulação positiva de genes. A identificação dessas fases é importante para entender os mecanismos regulatórios em jogo e quaisquer alterações nesse processo que fundamentam a fisiopatologia dos transtornos debilitantes. Nossa abordagem de recuperação de antígeno induzida por calor melhora a intensidade do sinal detectado e permite a identificação correta do tipo de célula progenitora. Conforme discutido neste artigo, ele nos permite contornar especialmente os problemas atuais na detecção de certos tipos de células progenitoras.

A neurogênese hipocampal adulta é um processo sequencial no qual o tipo representativo de célula progenitora em cada estágio pode ser identificado por meio de uma combinação de marcadores. A fixação química cuidadosa e a recuperação de antígenos melhoram a eficácia e a acessibilidade de marcadores que, de outra forma, seriam difíceis de detectar. Um desses marcadores é a nestina, que é expressa nas células-tronco neurais do tipo glia radial e em alguns tipos precoces de células progenitoras ativas. A nestina pode ser uma...

Durante a neurogênese do hipocampo adulto, um conjunto distinto de marcadores genéticos é expresso quando uma célula-tronco neural quiescente progride sequencialmente e se desenvolve em um neurônio funcionalmente integrado no circuito. Usando a recuperação de antígeno induzida por calor, os tipos de células progenitoras que são difíceis de detectar são identificados com maior eficácia.

Recuperação de antígeno induzida por calor: um método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante a neurogênese do hipocampo adulto

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar a recuperação de antígenos em tecido cerebral do hipocampo para melhorar a visualização dos tipos celulares progenitores que dão origem a novos neurônios. Isso é realizado primeiramente colhendo o cérebro perfundido de camundongo, cortando finas seções coronais e montando essas seções em uma lâmina de vidro especialmente projetada para aderir fortemente ao tecido. O segundo passo é ferver as lâminas com o tecido e o tratamento Kay atópico e permitir tempo suficiente para resfriamento.Em seguida, corar o tecido com anticorpos primários durante a noite. O passo final é realizar a coloração com anticorpos secundários no tecido no dia seguinte, por pelo menos duas horas. Por fim, visualizar os diversos tipos celulares progenitores de gênero nas diferentes fases de desenvolvimento durante a neurogênese adulta do tecido hipocampal por meio de microscopia de lapso de tempo ou microscopia confocal.Olá, meu nome é Hun Jo, pós-doutorando, membro do laboratório do Dr. Ian John no Mayo Clinic. Nosso foco principal no Laboratório John é investigar o processo de neurogênese em doenças neurológicas e psiquiátricas. Nosso objetivo final é traduzir com sucesso esse conhecimento em aplicações terapêuticas. Demonstrando nosso procedimento de recuperação de antígeno será Quam Hui, e olá John do nosso laboratório.A principal vantagem da nossa técnica em comparação com os métodos existentes de imunohistoquímica é que ela permite a visualização eficaz de tipos celulares distintos durante a neurogênese hipocampal adulta. Esses tipos celulares, incluindo as células-tronco neurais precursoras que, de outra forma, são difíceis de detectar, podem ser rotulados e visualizados de maneira eficiente utilizando o nosso método de recuperação de antígenos. Este método fornecerá informações sobre o desenvolvimento e a regulação de neurônios recém-formados durante a neurogênese hipocampal adulta.Para aqueles interessados no estudo de transtornos mentais e tratamento farmacológico, nossa recuperação de antígenos será útil para investigar o papel do desenvolvimento neuronal durante a patogênese desta doença. Inicie o procedimento colocando o cérebro de um camundongo perfundido em paraformaldeído a 4% num tubo cônico de 10 mililitros durante a noite a quatro graus Celsius, ou por pelo menos 12 a 24 horas, mas não mais que 36 horas para fixação completa. Após a fixação durante a noite, remova o PFA e deixe o cérebro no tubo cônico.Em seguida, lave o cérebro com sacarose a 30% para remover qualquer resíduo de PFA e descarte a sacarose. Então, encha novamente o tubo com sacarose a 30% e mantenha-o a quatro graus Celsius até que o cérebro afunde até o fundo do tubo. Posteriormente, corte o hipocampo em seções cerebrais de 40 micrômetros em um micrótomo.Preserve as seções na solução anticongelante até que estejam prontas para imunohistoquímica. Em seguida, monte as fatias em lâminas de microscópio especialmente projetadas para aderir fortemente ao tecido. Após a montagem do tecido, deixe as lâminas secarem por cerca de 10 minutos.A secagem pode ser acelerada se as lâminas forem apoiadas contra uma superfície vertical sobre uma toalha de papel para garantir a remoção completa dos produtos químicos anteriores. Uma vez que as lâminas estejam secas, lave-as com PBS 3 vezes, durante cinco minutos cada vez. Em seguida, deixe secar novamente.Neste procedimento, prepare a solução para fervura do tecido de acordo com a descrição no manuscrito suplementar. Em seguida, ferva a solução por cinco minutos em um forno de micro-ondas padrão, na configuração normal. Após a fervura, remova cuidadosamente o recipiente do micro-ondas.Em seguida, transfira as lâminas secas para a solução. Certifique-se de que o lado com as seções do hipocampo esteja totalmente exposto à solução. Se possível, posicione as lâminas em um ângulo contra as paredes do recipiente e empilhe outras lâminas ao redor delas.Em seguida, aqueça a mistura com as lâminas por sete minutos no forno de micro-ondas em condições padrão. Enquanto isso, encha dois baldes de gelo até a metade com gelo. Após a ebulição, remova o recipiente do micro-ondas e coloque-o dentro de um dos baldes de gelo.Despeje o restante do gelo do outro balde ao redor do recipiente e cubra-o completamente. Em seguida, deixe repousar por uma hora. Remova as lâminas do recipiente.Lave-os com tampão TBST três vezes, durante cinco minutos cada vez. Em seguida, seque as lâminas no escuro por cinco a 10 minutos ou até que a lâmina esteja completamente seca. Enquanto isso, prepare uma câmara com DDH₂O para a coloração com anticorpo primário durante a noite.Uma vez que as lâminas tenham secado, desenhe um contorno ao redor das seções de tecido usando uma caneta hidrofugante. Esse contorno atua como uma barreira para impedir que a mistura de anticorpos escorra. Em seguida, prepare a mistura do anticorpo primário em T-B-S-T-T.Coloque as lâminas secas sobre a platina na câmara de coloração. Adicione lentamente 500 microlitros do anticorpo primário para cobrir toda a superfície. Em seguida, cubra a câmara de coloração para bloquear a luz externa e mantenha-a durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, lave as lâminas três vezes, por cinco minutos cada, com tampão TBST.Depois disso, seque-os no escuro. Agora prepare a mistura do anticorpo secundário em T-B-S-T-T. Em seguida, coloque as lâminas secas na câmara de coloração.Adicione 500 microlitros do anticorpo secundário. Cubra lentamente a câmara de coloração e mantenha-a protegida da luz externa por pelo menos duas horas à temperatura ambiente após a conclusão da coloração secundária; lave as lâminas três vezes, por cinco minutos cada vez, com tampão TBST, seque as lâminas no escuro após a secagem. Adicione solução de montagem às lâminas.Cubra-os cuidadosamente com lamínulas para evitar a introdução de bolhas. Em seguida, mantenha as lâminas no escuro por pelo menos duas horas antes da análise subsequente e da realização de análises de lapso de tempo ou análise convo nos tecidos corados. A neurogênese hipocampal adulta é mostrada ao longo da zona subgranular do giro denteado.Uma célula-tronco do tipo um, semelhante a um astrócito radial ativado, passa por fases distintas ao se diferenciar, amadurecer e integrar-se funcionalmente com uma morfologia elaborada ao circuito neuronal. Cada uma das fases e os respectivos tipos celulares podem ser identificados com base na expressão de uma combinação de marcadores. MCM2 é um marcador de proliferação expresso em todos os tipos celulares progenitores mitóticos, enquanto nestina é expressa em células-tronco semelhantes a gliais radiais e não radiais.À medida que os progenitores do tipo dois A se diferenciam, a expressão aninhada é primeiro desativada. A expressão de TBR dois aumenta no progenitor pós-mitótico, a expressão de MCM dois é perdida, enquanto a expressão de DCX e NEWAN determina a migração e a maturação em um neurônio funcional. Esta é uma imagem confocal representativa da coloração roxa para MCM dois, verde para nestina e vermelha para DAPI.As imagens ampliadas nas caixas mostram um progenitor radial semelhante a GL que expressa nestina, MCM2 e dpi. Abaixo, há uma imagem confocal representativa de MCM2 em azul, TBR2 em vermelho, DCX em verde e dpi em cinza. A coloração mostra a característica de um tipo celular progenitor tipo 2B, conforme exibido nas imagens ampliadas nas caixas, expressando MCM2, TBR2, DCX e dpi.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de três aspectos. Primeiro, utilizar tecido bem perfundido e fixado, com a espessura coronal adequada. Segundo, montar o tecido planamente sobre as lâminas e evitar qualquer dano durante esse processo.E finalmente, três, permitindo tempo suficiente para fervura e resfriamento subsequente durante a recuperação de antígenos. Após este procedimento, outros métodos, como reconstrução de tecidos por microscopia confocal e experimentos comportamentais, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre como os neurônios recém-formados podem se integrar à circuitaria hipocampal e contribuir para a função cognitiva. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a recuperação de antígenos em seu tecido hipocampal para visualizar de forma mais eficaz os tipos celulares presentes que dão origem a novos neurônios durante a neurogênese hipocampal.

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Research

JoVE Journal

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Recuperação de Antígeno Induzido por Calor: Um Método Eficaz para Detectar e Identificar Tipos de Células Progenitoras Durante a Neurogênese Hipocampal Adulta

O vídeo ilustra um método de coloração por imunofluorescência usado para examinar a neurogênese no hipocampo adulto. Inicialmente, uma seção do cérebro de camundongo é submetida a tratamento com anticorpos primários direcionados a proteínas marcadoras associadas à neurogênese em células progenitoras neuronais. Em seguida, é marcado com anticorpos secundários marcados com fluoróforos. A seção cerebral é então observada sob um microscópio confocal para distinguir vários subtipos de células...

Uma técnica de coloração por imunofluorescência para detectar a neurogênese do hipocampo adulto

Este vídeo demonstra o procedimento para colorir células-tronco neurais recém-proliferadas em seções de tecido cerebral usando incorporação de EdU, seguida de imunofluorescência para visualizar proteínas específicas, melhorando a compreensão da dinâmica e proliferação celular.

Coloração por imunofluorescência para visualização de células-tronco neurais proliferadas em seções cerebrais de camundongos

Este artigo em vídeo ilustra um protocolo abrangente para detectar e quantificar todos os estágios da neurogênese do hipocampo adulto dentro da mesma seção de tecido. Elaboramos um método para superar as limitações da imunofluorescência múltipla indireta que surgem quando anticorpos adequados de diferentes espécies hospedeiras não estão disponíveis.

A imuno-histoquímica e Rotulagem múltipla com anticorpos da espécie hospedeira Mesmas para Estudar Adulto Hippocampal Neurogênese

Nós descrevemos um protocolo de imuno-histoquímica para estudar o perfil de ativação dos neurônios do hipocampo após a exposição a uma tarefa de aprendizagem espacial em um modelo de rato caracterizado por déficits cognitivos de origem do desenvolvimento neurológico. Este protocolo pode ser aplicado a ambos os modelos genéticos ou farmacológicos de ratinho caracterizadas por disfunções cognitivas.

A visualização imuno-histoquímica de Hippocampal Neuron Atividade Após Spatial Aprendizagem em um rato modelo de desordens do desenvolvimento neurológico

Apresentamos um método eficaz e reprodutível para isolar e cultura de células progenitoras neurais do tecido do cérebro embrionário e pós-natal por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de histona 3 lisina 79 laboratório (H3K79me2) - uma marca do histone localizada dentro do domínio globular de histona 3.

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

O objetivo deste protocolo é descrever uma aproximação para analisar o comportamento de pilhas neurais adultas da haste/progenitor em resposta à manipulação chemogenetic de um circuito neural local específico.

Regulação específica do circuito de assaying de células precursoras neurais hipocampais adultas

Este trabalho apresenta quatro das técnicas mais comuns para visualizar células BrdU positivas para medir a neurogênese adulta em ratos. Este trabalho inclui instruções para preparação de reagentes, administração análoga de timidina, perfusão transcárdica, preparação tecidual, reação imuno-histoquímica da peroxidase, imunofluorescência, amplificação de sinal, contracoloração, microscopia e análise celular.

Técnicas de imuno-histoquímica para análise da proliferação celular e neurogênese em ratos utilizando o análogo da timidina BrdU

Encefalite autoimune é uma nova categoria de doenças mediadas por anticorpos do sistema nervoso central. Neurônios hipocampais podem ser usados para descobrir e caracterizar esses anticorpos. Este artigo fornece um protocolo para a cultura celular primária e imunostenção para determinar autoanticorpos no soro e fluido cefalorraquidiano dos pacientes.

Culturas neuronais hipocampais para detectar e estudar novos anticorpos patogênicos envolvidos em encefalite autoimune

O transplante de neurônios GABAérgicos derivados de células-tronco pluripotentes humanas gerados pela programação neuronal pode ser uma abordagem de tratamento potencial para distúrbios do neurodesenvolvimento. Este protocolo descreve a geração e o transplante de precursores neuronais GABAérgicos derivados de células-tronco humanas no cérebro de camundongos neonatais, permitindo a investigação a longo prazo de neurônios enxertados e a avaliação de seu potencial terapêutico.

Transplante de neurônios gabaérgicos derivados de células-tronco humanas no hipocampo de camundongo pós-natal precoce para mitigar distúrbios do neurodesenvolvimento

Apresentado aqui é um método para sequenciar núcleos únicos isolados do giro dentado do rato que exclui a maioria dos neurônios através da classificação de núcleos ativados por fluorescência (FAN). Essa abordagem gera perfis de expressão de alta qualidade e facilita o estudo da maioria dos outros tipos de células representadas no nicho, incluindo populações escassas, como células-tronco neurais.

Classificação negativa de neurônios por núcleos ativados por fluorescência combinada com sequenciamento de RNA de núcleos únicos para estudar o nicho neurogênico do hipocampo

Aprenda a recuperação de antígenos induzida por calor para visualizar tipos de células progenitoras durante a neurogênese do hipocampo adulto em tecido cerebral de camundongo. Este método melhora a detecção de marcadores genéticos em células-tronco neurais.

Recuperação de antígeno induzida por calor: um método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante a neurogênese do hipocampo adulto (Vídeo) | JoVE Journal

Recuperação de antígeno induzida por calor: um método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante a neurogênese do hipocampo adulto

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