Recuperação de antígeno induzida por calor: um método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante a neurogênese do hipocampo adulto

O objetivo geral deste procedimento é realizar a recuperação de antígenos em tecido cerebral do hipocampo para melhorar a visualização dos tipos celulares progenitores que dão origem a novos neurônios. Isso é realizado primeiramente colhendo o cérebro perfundido de camundongo, cortando finas seções coronais e montando essas seções em uma lâmina de vidro especialmente projetada para aderir fortemente ao tecido. O segundo passo é ferver as lâminas com o tecido e o tratamento Kay atópico e permitir tempo suficiente para resfriamento.

Em seguida, corar o tecido com anticorpos primários durante a noite. O passo final é realizar a coloração com anticorpos secundários no tecido no dia seguinte, por pelo menos duas horas. Por fim, visualizar os diversos tipos celulares progenitores de gênero nas diferentes fases de desenvolvimento durante a neurogênese adulta do tecido hipocampal por meio de microscopia de lapso de tempo ou microscopia confocal.

Olá, meu nome é Hun Jo, pós-doutorando, membro do laboratório do Dr. Ian John no Mayo Clinic. Nosso foco principal no Laboratório John é investigar o processo de neurogênese em doenças neurológicas e psiquiátricas. Nosso objetivo final é traduzir com sucesso esse conhecimento em aplicações terapêuticas. Demonstrando nosso procedimento de recuperação de antígeno será Quam Hui, e olá John do nosso laboratório.

A principal vantagem da nossa técnica em comparação com os métodos existentes de imunohistoquímica é que ela permite a visualização eficaz de tipos celulares distintos durante a neurogênese hipocampal adulta. Esses tipos celulares, incluindo as células-tronco neurais precursoras que, de outra forma, são difíceis de detectar, podem ser rotulados e visualizados de maneira eficiente utilizando o nosso método de recuperação de antígenos. Este método fornecerá informações sobre o desenvolvimento e a regulação de neurônios recém-formados durante a neurogênese hipocampal adulta.

Para aqueles interessados no estudo de transtornos mentais e tratamento farmacológico, nossa recuperação de antígenos será útil para investigar o papel do desenvolvimento neuronal durante a patogênese desta doença. Inicie o procedimento colocando o cérebro de um camundongo perfundido em paraformaldeído a 4% num tubo cônico de 10 mililitros durante a noite a quatro graus Celsius, ou por pelo menos 12 a 24 horas, mas não mais que 36 horas para fixação completa. Após a fixação durante a noite, remova o PFA e deixe o cérebro no tubo cônico.

Em seguida, lave o cérebro com sacarose a 30% para remover qualquer resíduo de PFA e descarte a sacarose. Então, encha novamente o tubo com sacarose a 30% e mantenha-o a quatro graus Celsius até que o cérebro afunde até o fundo do tubo. Posteriormente, corte o hipocampo em seções cerebrais de 40 micrômetros em um micrótomo.

Preserve as seções na solução anticongelante até que estejam prontas para imunohistoquímica. Em seguida, monte as fatias em lâminas de microscópio especialmente projetadas para aderir fortemente ao tecido. Após a montagem do tecido, deixe as lâminas secarem por cerca de 10 minutos.

A secagem pode ser acelerada se as lâminas forem apoiadas contra uma superfície vertical sobre uma toalha de papel para garantir a remoção completa dos produtos químicos anteriores. Uma vez que as lâminas estejam secas, lave-as com PBS 3 vezes, durante cinco minutos cada vez. Em seguida, deixe secar novamente.

Neste procedimento, prepare a solução para fervura do tecido de acordo com a descrição no manuscrito suplementar. Em seguida, ferva a solução por cinco minutos em um forno de micro-ondas padrão, na configuração normal. Após a fervura, remova cuidadosamente o recipiente do micro-ondas.

Em seguida, transfira as lâminas secas para a solução. Certifique-se de que o lado com as seções do hipocampo esteja totalmente exposto à solução. Se possível, posicione as lâminas em um ângulo contra as paredes do recipiente e empilhe outras lâminas ao redor delas.

Em seguida, aqueça a mistura com as lâminas por sete minutos no forno de micro-ondas em condições padrão. Enquanto isso, encha dois baldes de gelo até a metade com gelo. Após a ebulição, remova o recipiente do micro-ondas e coloque-o dentro de um dos baldes de gelo.

Despeje o restante do gelo do outro balde ao redor do recipiente e cubra-o completamente. Em seguida, deixe repousar por uma hora. Remova as lâminas do recipiente.

Lave-os com tampão TBST três vezes, durante cinco minutos cada vez. Em seguida, seque as lâminas no escuro por cinco a 10 minutos ou até que a lâmina esteja completamente seca. Enquanto isso, prepare uma câmara com DDH₂O para a coloração com anticorpo primário durante a noite.

Uma vez que as lâminas tenham secado, desenhe um contorno ao redor das seções de tecido usando uma caneta hidrofugante. Esse contorno atua como uma barreira para impedir que a mistura de anticorpos escorra. Em seguida, prepare a mistura do anticorpo primário em T-B-S-T-T.

Coloque as lâminas secas sobre a platina na câmara de coloração. Adicione lentamente 500 microlitros do anticorpo primário para cobrir toda a superfície. Em seguida, cubra a câmara de coloração para bloquear a luz externa e mantenha-a durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, lave as lâminas três vezes, por cinco minutos cada, com tampão TBST.

Depois disso, seque-os no escuro. Agora prepare a mistura do anticorpo secundário em T-B-S-T-T. Em seguida, coloque as lâminas secas na câmara de coloração.

Adicione 500 microlitros do anticorpo secundário. Cubra lentamente a câmara de coloração e mantenha-a protegida da luz externa por pelo menos duas horas à temperatura ambiente após a conclusão da coloração secundária; lave as lâminas três vezes, por cinco minutos cada vez, com tampão TBST, seque as lâminas no escuro após a secagem. Adicione solução de montagem às lâminas.

Cubra-os cuidadosamente com lamínulas para evitar a introdução de bolhas. Em seguida, mantenha as lâminas no escuro por pelo menos duas horas antes da análise subsequente e da realização de análises de lapso de tempo ou análise convo nos tecidos corados. A neurogênese hipocampal adulta é mostrada ao longo da zona subgranular do giro denteado.

Uma célula-tronco do tipo um, semelhante a um astrócito radial ativado, passa por fases distintas ao se diferenciar, amadurecer e integrar-se funcionalmente com uma morfologia elaborada ao circuito neuronal. Cada uma das fases e os respectivos tipos celulares podem ser identificados com base na expressão de uma combinação de marcadores. MCM2 é um marcador de proliferação expresso em todos os tipos celulares progenitores mitóticos, enquanto nestina é expressa em células-tronco semelhantes a gliais radiais e não radiais.

À medida que os progenitores do tipo dois A se diferenciam, a expressão aninhada é primeiro desativada. A expressão de TBR dois aumenta no progenitor pós-mitótico, a expressão de MCM dois é perdida, enquanto a expressão de DCX e NEWAN determina a migração e a maturação em um neurônio funcional. Esta é uma imagem confocal representativa da coloração roxa para MCM dois, verde para nestina e vermelha para DAPI.

As imagens ampliadas nas caixas mostram um progenitor radial semelhante a GL que expressa nestina, MCM2 e dpi. Abaixo, há uma imagem confocal representativa de MCM2 em azul, TBR2 em vermelho, DCX em verde e dpi em cinza. A coloração mostra a característica de um tipo celular progenitor tipo 2B, conforme exibido nas imagens ampliadas nas caixas, expressando MCM2, TBR2, DCX e dpi.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de três aspectos. Primeiro, utilizar tecido bem perfundido e fixado, com a espessura coronal adequada. Segundo, montar o tecido planamente sobre as lâminas e evitar qualquer dano durante esse processo.

E finalmente, três, permitindo tempo suficiente para fervura e resfriamento subsequente durante a recuperação de antígenos. Após este procedimento, outros métodos, como reconstrução de tecidos por microscopia confocal e experimentos comportamentais, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre como os neurônios recém-formados podem se integrar à circuitaria hipocampal e contribuir para a função cognitiva. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a recuperação de antígenos em seu tecido hipocampal para visualizar de forma mais eficaz os tipos celulares presentes que dão origem a novos neurônios durante a neurogênese hipocampal.