Um protocolo rápido para integrar matrizes extracromossômicas com alta taxa de transmissão no genoma de C. elegans

O objetivo geral deste procedimento é integrar matrizes cromossômicas extras transgênicas no genoma da elegância do serrátil usando irradiação ultravioleta. Primeiro, selecione a linha transgênica com a maior taxa de transmissão possível, idealmente maior que 80% Em seguida, irradie por UV as larvas transgênicas selecionadas de L quatro e quatro animais transgênicos fluorescentes de cada placa F1 selecionada. Próxima tela, as duas placas F para transgênico 100% fluorescente.

F três vermes. Em última análise, escolher um animal fluorescente da geração F três pode mostrar a herança de 100% do transgene. Essa abordagem experimental é adequada para linhagens transgênicas que transmitem matrizes cromossômicas extras em alta taxa.

Demonstrando o procedimento estará Stephanie Belman, técnica do nosso laboratório. Comece com 500 placas de Petri grandes contendo o crescimento de nematóides. Meio Semeie cada placa com 0,3 mililitros de isia coli saturada.

OP 50 cultura. Avaliar a taxa de transmissão da linhagem transgênica a ser integrada para cada linhagem transgênica. Escolha 10 adultos de gravidade fluorescente em 10 placas de cultura separadas sob uma cultura de estereoscópio fluorescente.

Os animais em uma incubadora de minhocas ajustadas a uma temperatura permissiva à reprodução do fundo genético. Monitore a progênie todos os dias para avaliar em qual estágio de desenvolvimento o marcador de injeção de co é expresso e pode ser melhor observado usando oscopia fluorescente. Avalie a taxa de transmissão da progênie determinando a porcentagem de progênie fluorescente.

Para a integração do transgene, selecione a linha transgênica com a maior taxa de transmissão. Obter uma população de animais transgênicos sincronizados no estágio larval L quatro. Para integração, escolha 30 adultos GRA fluorescentes em cinco placas de cultura.

Depois que os vermes tiverem posto ovos por três a quatro horas a 15 graus Celsius, verifique a presença de pelo menos 30 ovos por placa e, em seguida, elimine os adultos das placas, cultive os animais em uma incubadora de minhocas até que a progênie atinja o estágio larval L quatro. Coloque cada placa contendo 15 a 20 animais transgênicos fluorescentes em um reticulador UV com as tampas removidas, irradie os vermes para recuperação. Incube os vermes irradiados durante a noite a 15 graus Celsius.

Verifique o número de animais que estão vivos em nossas mãos. Uma taxa de sobrevivência de cerca de 80 a 90% é adaptada para uma irradiação eficiente. Cultivar os animais irradiados a 15 a 25 graus Celsius até que a progênie atinja o estágio de desenvolvimento, permitindo a observação da expressão do marcador de injeção de co.

Transferir animais F1 fluorescentes individuais para placas de cultura separadas. Manter estas placas F1 a 15 a 25 graus Celsius até que a progênie atinja um estágio apropriado para a observação de F dois animais fluorescentes, dependendo do comarcador utilizado. Neste caso particular, observamos os vermes quando adultos descartarem todas as placas F1 exibindo uma, nenhuma progênie, indicando que o animal F1 era estéril ou morreu, ou dois não, ou apenas alguns animais fluorescentes F dois, indicando que o animal F1 não transmitiu o transgene na taxa esperada.

Destacar quatro animais fluorescentes transgênicos F dois de cada placa F1 selecionada. Ao usar transgenes fluorescentes, escolha F dois vermes com alto nível de fluorescência, pois isso pode indicar que esses animais são homozigotos para a matriz integrada. Observe que, ao escolher F dois animais, é fundamental não carregar ovos ou larvas para evitar falsos negativos na próxima etapa.

Depois de cultivar os dois animais F, rastreie as duas placas F para vermes F três transgênicos 100% fluorescentes. A tela é bastante rápida, pois a presença de um único verme não fluorescente indica que a placa deve ser jogada fora, destacando oito animais fluorescentes F três de placas selecionadas para confirmar a herança de 100% do transgene. Se possível, manter várias estirpes transgénicas integradas independentes.

Foram realizadas integrações de transgenes em duas linhagens diferentes, transmitindo arranjos cromossômicos extras aproximadamente na mesma frequência. Usando o padrão e os protocolos aprimorados, o tempo e o número de placas necessárias por linha integrada são otimizados no protocolo aprimorado. Em seguida, testamos a hipótese de que uma taxa de transmissão transgênica mais alta em uma linhagem não integrada facilita a integração do transgene no genoma.

Um transgene específico foi integrado em linhas que transmitem em taxas diferentes usando o protocolo aprimorado para a linha de transmissão mais alta. Três linhagens integradas foram recuperadas de apenas 90 animais F1 selecionados, enquanto para a linhagem transgênica transmitindo de 50 a 60%Uma linhagem integrada foi recuperada de 110 animais F1 selecionados. Após este procedimento, diferentes métodos podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como determinar a expressão gênica, padrão e regulação, localização e superexpressão de proteínas ou desenvolvimento de marcadores subcelulares.