Name: Um protocolo rápido para integrar matrizes extracromossômicas com alta taxa de transmissão no genoma de C. elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Aprenda a integrar matrizes extracromossômicas transgênicas no genoma de Caenorhabditis elegans usando irradiação UV. Este protocolo rápido e de baixo consumo de material é ideal para linhagens com alta taxa de transmissão.

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Os autores gostariam de agradecer a Claire Lecroisey e Laurent Ségalat por gerarem Pdyc-1::d yc-1::gfp não integrado; Cepas transgênicas Pmyo-2::d sRed e Pmyo-3::gfp. Agradecemos a Andy Fire pelo presente do plasmídeo Pmyo-2::d sRed e a Pamela Hoppe pelo presente do plasmídeo Pmyo-3::gfp. Este trabalho foi fundado pelo Centro Nacional Francês de Pesquisa Científica (CNRS) e pela Universidade Claude Bernard de Lyon.

1. Cultura de nematóides transgênicos antes da integração
Linhas transgênicas podem ser geradas conforme descrito em1. Essas linhagens geralmente contêm um plasmídeo marcador de coinjeção que leva à expressão de uma proteína fluorescente ou a um fenótipo comportamental ou morfológico específico em um determinado estágio de desenvolvimento1,3. Este protocolo de integração pode ser aplicado a cepas que expressam marcadores de coinjeção fluorescentes ou não fluorescentes. No exemplo a seguir, foi utilizada uma cepa com marcador de coinjeção fluorescente.
<ol>
	<li>Preparar placas de cultura:
		<ol>
			<li>Prepare cerca de 500 placas de Petri grandes de 60 mm derramadas assepticamente com 10 ml de meio de crescimento de nematóides (NGM) 6,7.</li>
			<li>Semear 0,3 ml de cultura saturada de Escherichia coli OP50 em cada placa, seguindo o procedimento padrão6,7.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Avaliar a taxa de transmissão da linhagem transgênica a ser integrada:
		<ol>
			<li>Para cada linha transgênica, escolha dez adultos grávidas fluorescentes em dez placas de cultura separadas sob um estereoscópio fluorescente usando uma picareta de minhoca, conforme descrito em7.</li>
			<li>Cultive os animais em uma incubadora de minhocas a 15-25 ° C (dependendo do histórico genético) para permitir que os vermes se reproduzam.</li>
			<li>Observe a progênie todos os dias para avaliar em qual estágio de desenvolvimento o marcador de coinjeção é expresso e pode ser melhor observado. A expressão da maioria dos marcadores de coinjeção atualmente usados é observada no estágio larval L4 ou na idade adulta.</li>
			<li>Avaliar a taxa de transmissão da progênie determinando a porcentagem de progênie fluorescente por observação sob um estereoscópio fluorescente.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Escolha uma linha transgênica para integração transgênica:
		<ol>
			<li>Selecione a linha transgênica com a maior taxa de transmissão possível (idealmente ≥80%).</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Obter uma população de animais transgênicos sincronizados no estágio larval L4 para integração:
	<ol>
		<li>Escolha 30 adultos grávidas fluorescentes em cinco placas de cultura (seis animais por placa).</li>
		<li>Deixe os vermes botarem ovos por 3-4 horas a 15 °C.</li>
		<li>Elimine os adultos dos pratos após verificar a presença de pelo menos 30 ovos por prato.</li>
		<li>Cultivar os animais numa incubadora de minhocas a 15-25 °C até que a progenitura atinja a fase larvar L4 (96 horas a 15 °C ou 36 horas a 25 °C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Irradiação UV e Recuperação de Vermes Transgênicos
<ol>
	<li>Irradiação de vermes:
		<ol>
			<li>Escolha 30-100 animais transgênicos fluorescentes L4 em placas de cultura separadas (15-20 animais por placa).</li>
			<li>Coloque as placas, com as tampas removidas, em um reticulador UV. Irradiar os vermes a 0,012 J/cm2. Observe que as cepas são mais ou menos sensíveis aos raios UV e que os resultados podem variar dependendo do irradiador UV usado. Pode ser testada uma gama de doses entre 0,010-0,015 J/cm2.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Recuperação de vermes após irradiação:
	<ol>
		<li>Coloque as placas com vermes irradiados durante a noite a 15 °C para recuperação.</li>
		<li>Verifique o número de animais que estão vivos. Em nossas mãos, uma taxa de sobrevivência de cerca de 80-90% é adaptada para uma irradiação eficiente.</li>
		<li>Cultivar os animais irradiados a 15-25 °C até que a progenitura atinja a fase de desenvolvimento, permitindo a observação da expressão do marcador de coinjecção, conforme estabelecido na fase 1.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Isolamento de Linhagens Transgênicas Integradas
<ol>
	<li>Seleção de animais F1:
		<ol>
			<li>Um único animal F1 fluorescente 150-200 em placas de cultura separadas. Para linhas altamente transmissoras (≥80%), 100 animais F1 são suficientes.</li>
			<li>Manter estas placas F1 a 15-25 °C até que a progenitura atinja uma fase adequada para a observação de animais fluorescentes F2.</li>
			<li>Rejeitar todas as placas F1 que apresentem i) ausência de progenitura, indicando que o animal F1 era estéril ou morreu, ou ii) ausência ou apenas alguns animais fluorescentes F2, indicando que o animal F1 não transmitiu o transgene à taxa esperada. Esta etapa é rápida e representa uma vantagem real quando comparada ao protocolo padrão que requer uma estimativa da porcentagem de vermes fluorescentes F2 para selecionar placas F1 exibindo ≥75% de progênie fluorescente (Tabela 1).</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Seleção de animais F2:
		<ol>
			<li>Um único quatro animais F2 transgênicos fluorescentes de cada placa F1 selecionada. Ao usar transgenes fluorescentes (por exemplo, mCherry8, gfp9 ou dsRed10), escolha vermes F2 com alto nível de fluorescência, pois isso pode indicar que esses animais são homozigotos para a matriz integrada. Observe que, ao escolher animais F2, é fundamental não carregar ovos ou larvas, a fim de evitar falsos negativos na próxima etapa.</li>
			<li>Cultive animais F2 a 15-25 °C.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Isolamento e validação de cepas transgênicas integradas:
		<ol>
			<li>Filtre as placas F2 para vermes F3 transgênicos 100% fluorescentes. A tela é bastante rápida, pois a presença de um único verme não fluorescente indica que a placa deve ser jogada fora. Um animal homozigoto F2 para o transgene integrado dará uma progênie fluorescente 100% homozigótica.</li>
			<li>Oito animais fluorescentes F3 de placas selecionadas para confirmar a herança de 100% do transgene. Em teoria, escolher um animal é suficiente nesta etapa. No entanto, a escolha de oito animais fluorescentes F3 pode ser necessária para evitar a seleção de animais não férteis ou insalubres, pois a irradiação pode induzir aleatoriamente mutações que afetam genes importantes para a fisiologia do verme.</li>
			<li>Se possível, manter várias estirpes transgénicas integradas independentes, ou seja, estirpes recuperadas de diferentes animais F1.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Mello, C., Kramer, J. M., Stinchlomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li>
<li>Transformation and microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WormBook%22">WormBook</a>. Evans, T. C. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).</li>
<li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+Fusion-Based+Approach+to+Create+Reporter+Gene+Constructs+for+Expression+Analysis+in+Transgenic+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">PCR Fusion-Based Approach to Create Reporter Gene Constructs for Expression Analysis in Transgenic C. elegans.</a> BioTechniques. 32, 728-730 (2002).</li>
<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Worm+Lab%3A+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Merritt, C., Rasoloson, D., Gallo, C., Voronina, E., Ko, D., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+vector+kit+for+transgenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22International+Worm+Meeting%22%5BJournal%5D)">A modular vector kit for transgenesis in C. elegans.</a> International Worm Meeting. , (2007).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Green Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Fleenor, J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discosoma+sp.+Red+Fluorescent+Protein+%28dsRED%29+as+a+reporter+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Worm+Breeder%27s+Gazette%22%5BJournal%5D)">Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (dsRED) as a reporter in C. elegans.</a> Worm Breeder's Gazette. 16 (3), 16(2000).</li>
<li>Lecroisey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZYX-1%2C+the+unique+zyxin+protein+of+Caenorhabditis+elegans%2C+is+involved+in+dystrophin-dependent+muscle+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">ZYX-1, the unique zyxin protein of Caenorhabditis elegans, is involved in dystrophin-dependent muscle degeneration.</a> Mol. Biol. Cell. , (2013).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).</li>
<li>Frøkjaer-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).</li>
<li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesse financeiro conflitante.

O protocolo descrito aqui fornece um método eficiente para integrar matrizes transgênicas extracromossômicas no genoma de C. elegans. Usando diferentes linhagens não integradas, que transmitiram o mesmo transgene Pdyc-1::d yc-1::gfp (pKG45) em diferentes taxas (10-15%, 50-60% e >80%), mostramos que o número de cepas integradas recuperadas após a irradiação UV é dependente do nível inicial de transmissão da linhagem não integrada (Tabela 2). Portanto, os transgenes são mais fáceis de int...

Os transgenes são amplamente utilizados em C. elegans para uma ampla gama de aplicações. As cepas transgênicas são tipicamente geradas por injeção de DNA na gônada hermafrodita sincicial1,2. O DNA que carrega o transgene de interesse é coinjetado junto com plasmídeos que codificam marcadores de coinjeção1,3,4. Os marcadores de coinjeção são transgenes estabelecidos que levam à expressão de uma proteína fluorescente ou a um fenótipo comportamental ou morfológico específico. Os DNAs injetados se reorganizam para formar matrizes extracromossômicas de múltiplas cópias; Assim, o transgene de interesse e o marcador de coinjeção são transmitidos juntos5,4. As linhagens transgênicas são selecionadas na geração F2 de animais injetados seguindo o fenótipo induzido pela expressão do marcador de coinjeção (fluorescência ou fenótipo específico)1. As linhagens transgênicas exibem taxas de transmissão parciais e variáveis das matrizes extracromossômicas para a próxima geração. Dependendo da cepa, 10-100% (100% sendo um evento raro) dos animais herdam matrizes extracromossômicas. Além disso, os animais transgênicos são mosaicos e expressam o transgene em um número variável de células. É provável que esse mosaicismo esteja correlacionado com a taxa de transmissão para a próxima geração. De fato, tanto na linha germinativa quanto nas células somáticas, a taxa de transmissão depende da segregação das matrizes extracromossômicas durante as divisões celulares. Uma maneira de evitar esse problema é integrar o transgene ao genoma. Classicamente, a integração de um transgene em um cromossomo depende da irradiação (ultravioleta ou gama) de vermes transgênicos portadores de matrizes extracromossômicas3. Resumidamente, 50-100 animais hermafroditas são irradiados no estágio larval L4. Na geração F1, 200-800 animais transgênicos são selecionados e cultivados individualmente em placas. De acordo com a segregação mendeliana, os animais transgênicos F1 portadores de uma integração heterozigótica do transgene no genoma produziriam 1/2 dos descendentes transgênicos que são heterozigotos para a matriz integrada, 1/4 dos descendentes transgênicos são homozigotos para a matriz integrada e 1/4 dos descendentes que não integraram a matriz (Figura 1). Assim, as placas contendo a geração F2 são visualmente rastreadas para ≥75% de animais transgênicos, conforme observado pela expressão do marcador de coinjeção. Cerca de 1/3 dos animais F2 selecionados para serem candidatos integrantes são considerados homozigotos para a matriz integrada e produzem 100% dos animais F3 homozigotos. Assim, de cada placa selecionada, três a oito animais transgênicos F2 são cultivados individualmente e placas com 100% de descendentes transgênicos são selecionadas. Em seguida, oito animais F3 são cultivados individualmente para confirmar a herança de 100% do transgene.
As principais desvantagens deste método são que
<ol type="i">
	<li>requer uma triagem visual de várias centenas de placas F1 para ≥75% de progênie F2 transgênica, o que consome tempo devido à porcentagem variável e imprevisível de transmissão de matrizes extracromossômicas não integradas. Em alternativa, para evitar o rastreio das placas F1, podem ser realizadas várias etapas subsequentes de inanição após a irradiação dos animais P0; seguido pela escolha de 100 animais transgênicos e triagem para progênie 100% transgênica3.</li>
	<li>Não é adaptado para cepas que exibem uma porcentagem de transmissão de matriz extracromossômica superior a 60%, pois essa porcentagem é difícil de distinguir dessa porcentagem de 75%.</li>
	<li>como apenas cepas com uma taxa de transmissão relativamente baixa podem ser usadas, é necessário um alto número de animais transgênicos P0 irradiados, bem como a observação de numerosos animais F1 e F2, o que é altamente demorado e requer um número considerável de placas.</li>
</ol>
A irradiação de vermes presumivelmente induz quebras de fita dupla no DNA e a integração de matrizes extracromossômicas nos cromossomos ocorre durante o reparo do DNA. Assim, é provável que as chances de obter uma integração mediada por irradiação bem-sucedida sejam diretamente proporcionais ao número de células da linha germinativa que carregam uma matriz extracromossômica. Cepas com alta taxa de transmissão podem conter mais matrizes de DNA transgênico do que cepas com baixa taxa de transmissão, conforme sugerido em2, e exibem um número maior de células da linha germinativa carregando matrizes extracromossômicas. Assim, raciocinamos que em linhas altamente transmissoras, os transgenes podem ser mais fáceis de integrar do que em linhas com baixa taxa de transmissão. No entanto, o protocolo padrão exclui a possibilidade de integrar transgenes com alta frequência de transmissão, pois a porcentagem de animais transgênicos com uma matriz extracromossômica não integrada dificilmente pode ser distinguida da progênie de um animal F1 portador de uma integração heterozigótica do transgene no genoma (Figura 1).
Aqui mostramos que, para um transgene específico, o número de linhas integradas recuperadas após a irradiação com luz ultravioleta (UV) depende da porcentagem inicial de transmissão da matriz não integrada. Apresentamos um protocolo aprimorado para integração de transgenes mediada por irradiação UV que é particularmente relevante para linhas que exibem uma alta taxa de transmissão de matriz de transgenes.

<table><tbody><tr><td>Ágar</td><td>Prolabo</td><td>20768.292</td><td>para preparação de NGM (meio de crescimento de nematóides) (6,7)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chimie-Plus</td><td>40045</td><td>para preparação de NGM</td></tr><tr><td>Bactopeptona</td><td>BD</td><td>211820</td><td>para preparação de NGM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904-1</td><td>para preparação de NGM</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Prolabo</td><td>26930.293</td><td>para preparação NGM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Roth</td><td>P027.2</td><td>para preparação NGM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Prolabo</td><td>22317.297</td><td>para preparação NGM</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Rectapur</td><td></td><td>para preparação NGM</td></tr><tr><td>LB-caldo</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>para cultura de OP50 bactérias</td></tr><tr><td>EQUIPAMENTO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reticulador UV</td><td>Fischer Scientific</td><td></td><td>Wavelength 254 nm</td></tr><tr><td>Microscópio SteREO Discovery V8</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri, 60 mm</td><td>CML</td><td>BPS55E6</td><td></td></tr><tr><td>Fio de platina 0,25 mm</td><td>Alfa Aesar</td><td>7440-06-4</td><td>Para fazer uma picareta para minhocas (7)</td></tr></tbody></table>

um protocolo rápido para integrar matrizes extracromossômicas com alta taxa de transmissão no genoma de c. elegans

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjetar DNA no citoplasma da gônada sincicial de Caenorhabditis elegans é a principal técnica utilizada para estabelecer linhagens transgênicas que exibem taxas de transmissão parciais e variáveis de arranjos extracromossômicos para a próxima geração. Além disso, os animais transgênicos são mosaicos e expressam o transgene em um número variável de células. Arranjos extracromossômicos podem ser integrados ao genoma de C. elegans usando irradiação UV para estabelecer cepas transgênicas não mosaicas com taxa de transmissão de 100% do transgene. Nessa medida, as progênies F1 de animais transgênicos irradiados com UV são rastreadas para animais portadores de uma integração heterozigótica do transgene, o que leva a uma taxa de transmissão mendeliana de 75% para a progênie F2. Um dos desafios deste método é distinguir entre a porcentagem de transmissão transgênica em uma população antes (X% de animais transgênicos) e depois da integração (≥75% de animais transgênicos F2). Assim, este método requer a escolha de uma linhagem transgênica não integrada com uma porcentagem de animais transgênicos significativamente menor que a segregação mendeliana de 75%. Consequentemente, linhagens transgênicas não integradas com uma taxa de transmissão de arranjo extracromossômico para a próxima geração ≤60% são geralmente preferidas para integração, e a integração transgênica em cepas altamente transmissoras é difícil. Aqui mostramos que a eficiência da integração de arranjos extracromossômicos no genoma é aumentada quando se utilizam linhagens transgênicas altamente transmissoras (≥80%). O protocolo descrito permite a fácil seleção de várias linhagens independentes com integração de transgenes homozigotos no genoma após irradiação UV de vermes transgênicos exibindo uma alta taxa de transmissão por arranjo extracromossômico. Além disso, este método é bastante rápido e de baixo consumo de material. A possibilidade de gerar rapidamente diferentes linhagens que expressam um transgene integrado específico é de grande interesse para estudos com foco no padrão e regulação da expressão gênica, localização e superexpressão de proteínas, bem como para o desenvolvimento de marcadores subcelulares.

Realizaram-se integrações de transgenes em duas linhagens diferentes que transmitem arranjos extracromossômicos com frequência aproximadamente igual (50-60%) utilizando os protocolos padrão e aprimorado (Tabela 1). O protocolo padrão permitiu a obtenção de três linhagens integradas independentes após irradiação com UV de 91 animais transgênicos em estágio L4, enquanto o protocolo aprimorado permitiu a obtenção de uma linhagem integrada após irradiação com UV de 30 animais transgênicos em estágio L4. Isso...

Este protocolo descreve um procedimento rápido e de baixo consumo de material para a integração de matrizes extracromossômicas transgênicas no genoma de Caenorhabditis elegans usando irradiação ultravioleta (UV). Além disso, este protocolo é particularmente adequado para linhas transgênicas que transmitem matrizes extracromossômicas em alta taxa.

Um protocolo rápido para integrar matrizes extracromossômicas com alta taxa de transmissão no genoma de C. elegans

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

O objetivo geral deste procedimento é integrar arrays transgênicos extracromossômicos no genoma de Caenorhabditis elegans utilizando irradiação ultravioleta. Primeiro, selecione a linhagem transgênica com a taxa de transmissão mais alta possível, idealmente superior a 80%. Em seguida, irradie com UV as larvas transgênicas L4 selecionadas e isole quatro animais transgênicos fluorescentes F2 de cada placa F1 selecionada. A seguir, examine as placas F2 em busca de transgênicos fluorescentes com frequência de 100%.F três vermes. Eventualmente, a seleção de animais fluorescentes da geração F três pode demonstrar a herança de 100% do transgene. Essa abordagem experimental é particularmente adequada para linhagens transgênicas que transmitem arranjos cromossômicos extras a uma alta taxa.Demonstrará o procedimento Stephanie Belman, uma técnica do nosso laboratório. Inicie com 500 placas de Petri grandes contendo meio de crescimento para nematoides. Semee cada placa com 0,3 mililitros de cultura saturada de E. coli.Cultura OP 50. Avalie a taxa de transmissão da linhagem transgênica a ser integrada para cada linhagem transgênica. Escolha 10 adultos fluorescentes por gravidade e coloque-os em 10 placas de cultura separadas sob um estereoscópio fluorescente.Os animais em um incubador de vermes ajustado a uma temperatura permissiva para a reprodução do fundo genético. Monitore a prole diariamente para avaliar em qual estágio de desenvolvimento o marcador de co-injeção é expresso e pode ser melhor observado utilizando microscopia fluorescente. Avalie a taxa de transmissão da prole determinando a porcentagem de prole fluorescente.Para a integração do transgene, selecione a linhagem transgênica com a maior taxa de transmissão. Obtenha uma população de animais transgênicos sincronizados no estágio larval L4. Para integração, escolha 30 adultos GRA fluorescentes e coloque-os em cinco placas de cultura.Após as minhocas terem posto ovos por três a quatro horas a 15 graus Celsius, verifique a presença de pelo menos 30 ovos por placa e, em seguida, elimine os adultos das placas. Cultive os animais em uma incubadora de minhocas até que a prole atinja o estágio larval L4. Coloque cada placa contendo 15 a 20 animais transgênicos fluorescentes no estágio L4 em um crosslinker de UV com as tampas removidas e irradie as minhocas para recuperação. Incube as minhocas irradiadas durante a noite a 15 graus Celsius.Verifique o número de animais vivos em nossas mãos. Uma taxa de sobrevivência de cerca de 80 a 90% é adequada para uma irradiação eficiente. Cresça os animais irradiados a 15 a 25 graus Celsius até que a prole tenha atingido o estágio de desenvolvimento, permitindo a observação da expressão do marcador de co-injeção.Transfira animais F1 fluorescentes individuais para placas de cultura separadas. Mantenha essas placas F1 a 15-25 graus Celsius até que a prole alcance um estágio apropriado para a observação de animais F2 fluorescentes, dependendo do marcador co utilizado. Neste caso específico, observamos os vermes na fase adulta e descartamos todas as placas F1 que exibiam, ou um número nulo de prole, indicando que o animal F1 era estéril ou morreu, ou dois, ou apenas alguns animais F2 fluorescentes, indicando que o animal F1 não transmitiu o transgene na taxa esperada.Selecione quatro animais transgênicos fluorescentes F2 de cada placa F1 escolhida. Ao utilizar transgenes fluorescentes, escolha vermes F2 com alto nível de fluorescência, pois isso pode indicar que esses animais são homozigotos para o arranjo integrado. Observe que, ao selecionar animais F2, é fundamental não carregar ovos ou larvas, a fim de evitar falsos negativos na próxima etapa.Após cultivar os animais F2, examine as placas F2 em busca de vermes transgênicos F3 com fluorescência de 100%. A triagem é bastante rápida, pois a presença de um único verme não fluorescente indica que a placa deve ser descartada. Isole oito animais F3 fluorescentes das placas selecionadas para confirmar a herança de 100% do transgene. Sempre que possível, mantenha várias linhagens transgênicas integradas independentes.Foram realizadas integrações de transgenes em duas linhagens diferentes, transmitindo arranjos extracromossômicos aproximadamente na mesma frequência. Utilizando os protocolos padrão e o aprimorado, o tempo e o número de placas necessários por linhagem integrada são otimizados no protocolo aprimorado. Em seguida, testamos a hipótese de que uma taxa mais alta de transmissão do transgene em uma linhagem não integrada facilita a integração do transgene no genoma.Um transgene específico foi integrado em linhagens que se transmitiam em diferentes taxas, utilizando o protocolo aprimorado para a linhagem com maior taxa de transmissão. Três linhagens integradas foram recuperadas a partir de apenas 90 animais F1 selecionados, enquanto para a linhagem transgênica com taxa de transmissão de 50 a 60%, uma linhagem integrada foi recuperada a partir de 110 animais F1 selecionados. Após este procedimento, diferentes métodos podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como determinar a expressão gênica, padrão e regulação, localização proteica e superexpressão proteica, ou desenvolvimento de marcadores subcelulares.

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Biologia

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Produção de C. elegans Transgenes via Recombineering com o GalK Marcador selecionável

Um procedimento para líquidos baseados em cultura e distribuição...

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

Análise de microarrays foi conduzido para determinar perfis de expressão genética...

Determinar perfis de expressão genética em C. elegans Usando Microarray e PCR em tempo real

Descrevemos aqui uma leitura molecular de adaptação a longo prazo em...

A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em<em&gt; C. elegans</em

Este vídeo descreve uma técnica para rastrear rapidamente um único nematóide em busca de um marcador genético por triagem de PCR. No protocolo de exemplo, examinamos a edição do genoma baseada em CRISPR.

PCR de verme único: um método para extrair e amplificar o DNA genômico

A microinjeção de transgenes geralmente resulta em cepas de C. elegans com grandes matrizes extracromossômicas, que resultam em expressão e transmissão variáveis do transgene. A irradiação UV pode induzir a integração cromossômica da matriz e uma transmissão transgênica mais estável.

Irradiação UV: Um Método para Integrar Arranjos Extracromossômicos

Aqui, apresentamos um método para engenheiro do genoma de c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteínas e modelos de reparo dependente de homologia.

Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

Apresentado aqui é uma descrição do isolamento simples e relativamente rápido de Caenorhabditis elegans DNA genômico de um ou poucos animais usando um kit de tecido comercialmente disponível. A preparação gDNA resultante é um modelo adequado para PCR.

Extração em pequena escala de Caenorhabditis elegans DNA genômico

Este protocolo fornece um método para medir as frequências de cruzamento e distribuição durante a meiose em Caenorhabditis elegans. A genotipagem do polimorfismo de nucleotídeo único com PCR em tempo real foi usada para determinar a origem dos cromossomos. O mapeamento de 4 pontos permitiu determinar as distribuições cruzadas das regiões do braço esquerdo, centro e braço direito de cada cromossomo. ...

Frequência e distribuição de cruzamentos na meiose de Caenorhabditis elegans por genotipagem de SNP usando PCR em tempo real

Aqui, apresentamos um protocolo ATAC-seq rápido e simples a ser implementado em um verme inteiro de estágio L4 Caenorhabditis elegans usando apenas 30 μL de pellet de verme.

Perfil de Acessibilidade por Cromatina em Larvas Plenas de Caenorhabditis elegans L4

Um fluxo de trabalho de microinjeção CRISPR/Cas9 para marcação fluorescente endógena na linha germinativa de Caenorhabditis elegans , visando obter linhas homozigotas knock-in para análise in vivo de localização de proteínas.

Marcação Endógena Fluorescente Mediada por CRISPR/Cas9 de Genes Específicos da Linhagem Germântica em Caenorhabditis elegans

Aprenda a integrar matrizes extracromossômicas transgênicas no genoma de Caenorhabditis elegans usando irradiação UV. Este protocolo rápido e de baixo consumo de material é ideal para linhagens com alta taxa de transmissão.

Um protocolo rápido para integrar matrizes extracromossômicas com alta taxa de transmissão no genoma de C. elegans

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