Um protocolo rápido para integrar matrizes extracromossômicas com alta taxa de transmissão no genoma de C. elegans
9 de dezembro de 2013
Este protocolo descreve um procedimento rápido e de baixo consumo de material para a integração de matrizes extracromossômicas transgênicas no genoma de Caenorhabditis elegans usando irradiação ultravioleta (UV). Além disso, este protocolo é particularmente adequado para linhas transgênicas que transmitem matrizes extracromossômicas em alta taxa.
O objetivo geral deste procedimento é integrar arrays transgênicos extracromossômicos no genoma de Caenorhabditis elegans utilizando irradiação ultravioleta. Primeiro, selecione a linhagem transgênica com a taxa de transmissão mais alta possível, idealmente superior a 80%. Em seguida, irradie com UV as larvas transgênicas L4 selecionadas e isole quatro animais transgênicos fluorescentes F2 de cada placa F1 selecionada. A seguir, examine as placas F2 em busca de transgênicos fluorescentes com frequência de 100%.
F três vermes. Eventualmente, a seleção de animais fluorescentes da geração F três pode demonstrar a herança de 100% do transgene. Essa abordagem experimental é particularmente adequada para linhagens transgênicas que transmitem arranjos cromossômicos extras a uma alta taxa.
Demonstrará o procedimento Stephanie Belman, uma técnica do nosso laboratório. Inicie com 500 placas de Petri grandes contendo meio de crescimento para nematoides. Semee cada placa com 0,3 mililitros de cultura saturada de E. coli.
Cultura OP 50. Avalie a taxa de transmissão da linhagem transgênica a ser integrada para cada linhagem transgênica. Escolha 10 adultos fluorescentes por gravidade e coloque-os em 10 placas de cultura separadas sob um estereoscópio fluorescente.
Os animais em um incubador de vermes ajustado a uma temperatura permissiva para a reprodução do fundo genético. Monitore a prole diariamente para avaliar em qual estágio de desenvolvimento o marcador de co-injeção é expresso e pode ser melhor observado utilizando microscopia fluorescente. Avalie a taxa de transmissão da prole determinando a porcentagem de prole fluorescente.
Para a integração do transgene, selecione a linhagem transgênica com a maior taxa de transmissão. Obtenha uma população de animais transgênicos sincronizados no estágio larval L4. Para integração, escolha 30 adultos GRA fluorescentes e coloque-os em cinco placas de cultura.
Após as minhocas terem posto ovos por três a quatro horas a 15 graus Celsius, verifique a presença de pelo menos 30 ovos por placa e, em seguida, elimine os adultos das placas. Cultive os animais em uma incubadora de minhocas até que a prole atinja o estágio larval L4. Coloque cada placa contendo 15 a 20 animais transgênicos fluorescentes no estágio L4 em um crosslinker de UV com as tampas removidas e irradie as minhocas para recuperação. Incube as minhocas irradiadas durante a noite a 15 graus Celsius.
Verifique o número de animais vivos em nossas mãos. Uma taxa de sobrevivência de cerca de 80 a 90% é adequada para uma irradiação eficiente. Cresça os animais irradiados a 15 a 25 graus Celsius até que a prole tenha atingido o estágio de desenvolvimento, permitindo a observação da expressão do marcador de co-injeção.
Transfira animais F1 fluorescentes individuais para placas de cultura separadas. Mantenha essas placas F1 a 15-25 graus Celsius até que a prole alcance um estágio apropriado para a observação de animais F2 fluorescentes, dependendo do marcador co utilizado. Neste caso específico, observamos os vermes na fase adulta e descartamos todas as placas F1 que exibiam, ou um número nulo de prole, indicando que o animal F1 era estéril ou morreu, ou dois, ou apenas alguns animais F2 fluorescentes, indicando que o animal F1 não transmitiu o transgene na taxa esperada.
Selecione quatro animais transgênicos fluorescentes F2 de cada placa F1 escolhida. Ao utilizar transgenes fluorescentes, escolha vermes F2 com alto nível de fluorescência, pois isso pode indicar que esses animais são homozigotos para o arranjo integrado. Observe que, ao selecionar animais F2, é fundamental não carregar ovos ou larvas, a fim de evitar falsos negativos na próxima etapa.
Após cultivar os animais F2, examine as placas F2 em busca de vermes transgênicos F3 com fluorescência de 100%. A triagem é bastante rápida, pois a presença de um único verme não fluorescente indica que a placa deve ser descartada. Isole oito animais F3 fluorescentes das placas selecionadas para confirmar a herança de 100% do transgene. Sempre que possível, mantenha várias linhagens transgênicas integradas independentes.
Foram realizadas integrações de transgenes em duas linhagens diferentes, transmitindo arranjos extracromossômicos aproximadamente na mesma frequência. Utilizando os protocolos padrão e o aprimorado, o tempo e o número de placas necessários por linhagem integrada são otimizados no protocolo aprimorado. Em seguida, testamos a hipótese de que uma taxa mais alta de transmissão do transgene em uma linhagem não integrada facilita a integração do transgene no genoma.
Um transgene específico foi integrado em linhagens que se transmitiam em diferentes taxas, utilizando o protocolo aprimorado para a linhagem com maior taxa de transmissão. Três linhagens integradas foram recuperadas a partir de apenas 90 animais F1 selecionados, enquanto para a linhagem transgênica com taxa de transmissão de 50 a 60%, uma linhagem integrada foi recuperada a partir de 110 animais F1 selecionados. Após este procedimento, diferentes métodos podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como determinar a expressão gênica, padrão e regulação, localização proteica e superexpressão proteica, ou desenvolvimento de marcadores subcelulares.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um procedimento rápido e com baixo consumo de material para a integração de arranjos extracromossômicos transgênicos no genoma de Caenorhabditis elegans utilizando irradiação ultravioleta (UV). Este método é particularmente eficaz para linhagens transgênicas que transmitem arranjos extracromossômicos a uma alta taxa.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Genética
- Transgênicos
Contexto
- Organismos transgênicos são essenciais para o estudo da função gênica.
- Arranjos extracromossômicos podem facilitar a expressão gênica.
- A irradiação por UV é um método para integrar material genético.
- Taxas elevadas de transmissão são cruciais para experimentos bem-sucedidos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para integrar arranjos transgênicos em C. elegans.
- Ampliar a eficiência da transmissão de transgenes.
- Fornecer um método de baixo consumo de materiais para pesquisadores.
Métodos Utilizados
- Selecione linhagens transgênicas com altas taxas de transmissão (idealmente >80%).
- Irradie com UV larvas L4 selecionadas.
- Analise placas F2 em busca de vermes transgênicos fluorescentes.
- Confirme a herança selecionando animais da geração F3 fluorescentes.
Resultados Principais
- Integração bem-sucedida de arranjos transgênicos no genoma.
- Altas taxas de herança do transgene observadas.
- O protocolo demonstrou eficiência e baixo uso de materiais.
- A triagem fluorescente permitiu a fácil identificação de linhagens transgênicas.
Conclusões
- O protocolo é eficaz para criar linhagens transgênicas estáveis.
- A irradiação com UV é um método viável para integração genética.
- Essa abordagem pode ser adaptada para diversas aplicações transgênicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a geração rápida de linhagens transgênicas estáveis de C. elegans com transmissão do transgene em 100%, solucionando um gargalo importante na validação de alvos, onde a expressão em mosaico e a herança variável dificultam a triagem fenotípica. Ao melhorar a eficiência de integração em linhagens de alta transmissão, ele auxilia na redução de riscos mecanicistas em estudos de função gênica e acelera os processos de identificação de alvos principais que exigem expressão consistente do transgene. O baixo consumo de materiais e a escalabilidade tornam-no adequado para o desenvolvimento de ensaios em larga escala e para a geração de modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da expressão estável e não mosaicista de transgenes em C. elegans.
- Valor Operacional: Reduz a ambiguidade na triagem fenotípica ao eliminar taxas variáveis de transmissão de transgenes.
- Valor Preditivo: Apoia a seleção de portfólios ao fornecer leituras confiáveis para estudos de padrões e regulação da expressão gênica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz sistemas biológicos validados com herança uniforme de transgênes para avaliação de compostos subsequentes.
- Valor Operacional: Padroniza a prontidão do ensaio mediante triagem de progênie F3 fluorescente a 100%, garantindo reprodutibilidade.
- Escalabilidade: Permite a geração rápida de múltiplas linhagens integradas independentes a partir de uma única etapa de irradiação com UV.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Apoia o desenvolvimento de sistemas relevantes para doenças ao permitir a criação de marcadores subcelulares e estudos de localização proteica.
- Modelo Pré-clínico: Facilita decisões de avanço ajustadas ao risco por meio de modelos consistentes de superexpressão.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece a validação de vias ao eliminar a variabilidade na transmissão de transgenes como fator de confusão.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais e a validação pré-clínica, permitindo especificamente ensaios confiáveis dependentes de transgênico.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias por meio da integração estável de transgenes em linhagens de alta transmissão.
- Triagem: Fornece sistemas prontos para ensaios com saídas fluorescentes quantitativas para campanhas de triagem de compostos.
- Análises: Oferece leitura binária (100% fluorescente na geração F3) para decisões de prosseguir ou não quanto ao sucesso da integração do transgene.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao desenvolvimento de biomarcadores por meio da geração de marcadores subcelulares e estudos de localização proteica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para gerar múltiplas linhagens transgênicas independentes por alvo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da eliminação da expressão em mosaico e da transmissão variável.
- Valor Operacional: Padronização e escalabilidade por meio de irradiação UV com baixo consumo de materiais e triagem rápida na geração F3.
- Valor Estratégico: Decisões de avançar ou interromper projetos mais eficazes e maior eficiência no uso de capital, reduzindo a geração falha de linhagens transgênicas.
- Impacto sobre o Portfólio: Priorização ajustada ao risco com base em métricas confiáveis de transmissão de transgênese para progressão.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manejo de C. elegans, triagem fluorescente e protocolos de segurança para irradiação com UV.
- Depende do acesso a um crosslinkador de UV e a um estereoscópio fluorescente para a visualização do marcador de co-injeção.
- Necessita padronização entre equipes quanto aos limiares de taxa de transmissão (>80%) para seleção de linhagens.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes marcadores de co-injeção e padrões de expressão do transgene.
- Limitação prática: a eficiência de integração permanece dependente da linhagem, exigindo triagem prévia para linhagens com alta taxa de transmissão.
