Name: Multiplex PCR Ensaio para a digita (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprenda a realizar ensaio multiplex PCR para tipagem de SCCmec em MRSA usando isolados de Staphylococcus aureus. Este método simplifica a caracterização de cepas e melhora a eficiência laboratorial em microbiologia clínica.

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Agradecemos a T. Ito, K. Hiramatsu, R. Daum, H. de Lencastre e D. Coleman pelo gentil presente de algumas cepas de referência usadas neste estudo. Este trabalho foi em parte apoiado financeiramente pelo Centro de Resistência Antimicrobiana (CAR), Alberta Health Services-Calgary/Calgary Laboratory Services/University of Calgary.

Esses procedimentos devem ser realizados em um n

<ol><li>IWG-SCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+%28SCCmec%29%3A+guidelines+for+reporting+novel+SCCmec+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).</li>
<li>Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Reporting+Novel+mecA+Gene+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).</li>
<li>Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+new+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+clones+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).</li>
<li>Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+multiplex+PCRs+for+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+assignment%3A+rapid+identification+system+for+mec%2C+ccr%2C+and+major+differences+in+junkyard+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).</li>
<li>Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+rapid+identification+of+structural+types+and+variants+of+the+mec+element+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+to+the+multiplex+PCR+strategy+for+assignment+of+mec+element+types+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+subtyping+the+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+IV+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%3A+%27SCCmec+IV+multiplex%27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+multiplex+PCR+assay+for+characterization+and+concomitant+subtyping+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+multiplex+PCR+assay+for+typing+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).</li>
<li>de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., de Micco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+microbial+DNA+extraction+method+using+%22Chelex+100%22+suitable+for+gene+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification.</a> Research in Microbiology. 143 (8), 785-790 (1992).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+assay+to+facilitate+identification+of+the+recently+described+Staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII.</a> Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type%2C+tentatively+designated+type+VIII%2C+harboring+class+A+mec+and+type+4+ccr+gene+complexes+in+a+Canadian+epidemic+strain+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O ensaio de PCR multiplex descrito aqui fornece um método simples e confiável para classificar os tipos e subtipos principais de SCCmec I-V em estafilococos, com discriminação simultânea de MRSA de MSSA. O ensaio é robusto, convenientemente feito em uma única reação de PCR e os resultados são fáceis de interpretar. O ensaio tem limitações, pois tem como alvo loci individuais dentro de cada tipo demec SCC, mas não oferece tipagem abrangente de ccr e mec complexa e, portanto, não pode se...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.

Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus resistente

<table><tbody><tr><td>Ágar Soja Tríptico</td><td>Fisher (BD)</td><td>CA90002-700 (236920)</td><td></td></tr><tr><td>Água destilada estéril</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq: incluindo tampão PCR 10x e 50 mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>10966-034</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP</td><td>Life Technologies</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Life Technologies</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>1Kb + DNA</td><td>ladder Life Tecnologias</td><td>10787-026</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml Tubos de microcentrífuga </td><td>VWR (Axygen Scientific)</td><td>10011-700</td><td></td></tr><tr><td>Varetas de cultura</td><td>VWR</td><td>CA10805-018</td><td></td></tr><tr><td>Tubos PCR</td><td>Diamed</td><td>AD0210-FCN (novo #: DIATEC420-1250)</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5417c</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de calor</td><td>VWR</td><td>13259-030 / 13259-286</td><td></td></tr><tr><td>Thermalcycler</td><td>Applied Biosystems (2720)</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de eletroforese em gel horizontal submersível com molde de gel</td><td>BioRad</td><td>170-4469</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação</td><td>BioRad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>Agitador basculante</td><td>VWR</td><td>40000-300</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Imager Gel Doc System</td><td>BioRad</td><td>1708170</td><td></td></tr></tbody></table>

multiplex pcr ensaio para a digita

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Este M-PCR atualizado é capaz de determinar (classificar) os tipos I-V de SCCmec, bem como os principais subtipos de SCCmec IV. O ensaio tem como alvo locos únicos e específicos de SCCmec I, II, III, IVa, IVb, IVc, IVd, IVE e V, com detecção concomitante do gene mecA. A identificação preliminar de SCCmec VI e VIII também é possível, mas exigiria testes adicionais para confirmação. Figura 3 ilustra representações típicas de SCCmec I-VI e VIII e as loca...

Demonstramos um ensaio de PCR multiplex simples para triagem e tipagem rápidas de Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) tipos I-V para Staphylococcus aureus resistente à meticilina e fornecemos algumas das etapas vitais e nuances processuais que o tornam bem-sucedido na adaptação deste ensaio a laboratórios individuais.

Multiplex PCR Ensaio para a digita

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar o tipo SCCmec de isolados de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina, ou MRSA, utilizando um ensaio de PCR multiplex. Isso é realizado primeiramente isolando o DNA das cepas, por meio de uma técnica rápida e simples de extração que envolve o aquecimento das células bacterianas em água. O segundo passo consiste em realizar um ensaio de PCR multiplex para amplificar alvos específicos de cada um dos tipos SCCmec.Em seguida, os produtos de PCR são separados por eletroforese em gel AROS. O passo final é corar o gel para visualização do DNA e análise dos dados. Em última instância, a combinação única de produtos específicos de PCR obtidos com este ensaio de PCR multiplex é utilizada para determinar os tipos SE cmec dos isolados de MRS A. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como os esquemas tradicionais de tipagem S CEC, que visam complexos individuais de genes CCR e MEC e exigem múltiplos tubos de PCR separados, é que este processo simplifica grandemente a carga de trabalho e pode ser realizado em um único tubo de PCR.Estes procedimentos devem ser realizados em um laboratório de nível dois de biosse

multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um barato, o método de elevada capacidade para detecção simultânea de até 43 alvos moleculares é descrito. Aplicações de mPCR / RLB incluem digitando microbiana e detecção de patógenos múltiplos a partir de amostras clínicas.

Multiplex PCR e hibridação reversa Linha Assay Blot (mPCR / RLB)

Nós descrevemos um multiplex PCR para a detecção rápida de Salmonella enterica sorotipos Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium. Sorovares de Salmonella específicos podem ser identificados por alvo um multiplex PCR para os genes e as seqüências exclusivas para o cluster biossíntese O antígeno-flagelina e de um sorovar dado. Sorovar é atribuída então a uma Salmonella isolar baseado na aparência de amplicons específicos, o tamanho (produto de PCR) correspondente ao alelo alvo.

Uma PCR Allelotyping para Identificar Salmonella enterica Sorovares Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium

Nós descrevemos um método multiplex para a detecção de microorganismos em uma amostra usando oligonucleotídeos-coupled partículas fluorescentes. Amplicon de todos os organismos dentro de uma amostra é hibridizada com um painel de sonda acoplada contas. Um instrumento Luminex ou Bio-Plex é usado para consultar cada grânulo para o tipo de grânulo e sinal de hibridização.

Detecção de multiplex de bactérias em amostras clínicas e Complexo Ambiental utilizando Oligonucleotídeos-coupled microesferas fluorescentes

Biossensores fagos líticos e contas de anticorpos são capazes de discriminar entre resistente à meticilina (MRSA) e bactérias estafilococos sensíveis. Os fagos foram imobilizadas por um método de Langmuir-Blodgett sobre uma superfície de um sensor de microbalança de cristal de quartzo e trabalhado como de largo espectro de estafilococos sondas. Contas de anticorpos reconhecer MRSA.

Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos

Um microarray amplificação combina assimétrica PCR amplificação e hibridização microarray em uma única câmara, que simplifica significativamente o fluxo de trabalho microarray para o usuário final. Simplificar o fluxo de trabalho microarray é um primeiro passo necessário para a criação de diagnósticos à base de microarray que podem ser rotineiramente usados ​​em ambientes com recursos mais baixos.

Demonstrando um multi-resistente<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Ampliação Microarray

Este protocolo descreve a detecção de integrons de classe 1 e seus de genes associados em alimentos.

Triagem géneros alimentícios destinados a uma classe integrons e Gene Cassetes

Aqui, o espaçador ribossômico PCR (RS-PCR) é usado em conjunto com um sistema de eletroforese miniaturizado como um método rápido e de alta resolução para genotipagem de S. aureus a custos moderados, permitindo um alto rendimento.

genotipagem de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; por Ribossômico Spacer PCR (RS-PCR)

Apresentamos dois kits internos de RT-qPCR de uma etapa baseados em sonda para vírus respiratórios comuns. O primeiro ensaio é para SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 e H3N2) e Influenza B. O segundo é para SARS-Cov-2 (N) e MERS (UpE e ORF1a). Estes ensaios podem ser implementados com sucesso em qualquer laboratório especializado.

Desenvolvimento de ensaios RT-qPCR multiplex em tempo real para a detecção de SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV

Protocolos para a utilização de biofilmes fluxo de abrir o sistema com reatores de fluxo de gotejamento e girando reatores disco são apresentadas em detalhe.

O uso do fluxo de gotejamento e Reatores de disco rotativo para Staphylococcus aureus Análise de biofilme

Pele murina e modelo de infecção dos tecidos moles é utilizado para avaliar a função de virulência de Staphylococcus aureus resistente (MRSA) e as respostas imunológico do hospedeiro. Aqui, apresentamos um modelo de infecção subcutânea por infecção da pele e tecidos moles.

Infecção subcutânea de Staphylococcus aureus resistente (MRSA)

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Multiplex PCR Ensaio para a digita

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