Name: Multiplex PCR Ensaio para a digita (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprenda a realizar ensaio multiplex PCR para tipagem de SCCmec em MRSA usando isolados de Staphylococcus aureus. Este método simplifica a caracterização de cepas e melhora a eficiência laboratorial em microbiologia clínica.

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Agradecemos a T. Ito, K. Hiramatsu, R. Daum, H. de Lencastre e D. Coleman pelo gentil presente de algumas cepas de referência usadas neste estudo. Este trabalho foi em parte apoiado financeiramente pelo Centro de Resistência Antimicrobiana (CAR), Alberta Health Services-Calgary/Calgary Laboratory Services/University of Calgary.

Esses procedimentos devem ser realizados em um n

<ol><li>IWG-SCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+%28SCCmec%29%3A+guidelines+for+reporting+novel+SCCmec+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).</li>
<li>Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Reporting+Novel+mecA+Gene+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).</li>
<li>Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+new+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+clones+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).</li>
<li>Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+multiplex+PCRs+for+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+assignment%3A+rapid+identification+system+for+mec%2C+ccr%2C+and+major+differences+in+junkyard+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).</li>
<li>Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+rapid+identification+of+structural+types+and+variants+of+the+mec+element+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+to+the+multiplex+PCR+strategy+for+assignment+of+mec+element+types+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+subtyping+the+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+IV+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%3A+%27SCCmec+IV+multiplex%27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+multiplex+PCR+assay+for+characterization+and+concomitant+subtyping+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+multiplex+PCR+assay+for+typing+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).</li>
<li>de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., de Micco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+microbial+DNA+extraction+method+using+%22Chelex+100%22+suitable+for+gene+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification.</a> Research in Microbiology. 143 (8), 785-790 (1992).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+assay+to+facilitate+identification+of+the+recently+described+Staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII.</a> Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type%2C+tentatively+designated+type+VIII%2C+harboring+class+A+mec+and+type+4+ccr+gene+complexes+in+a+Canadian+epidemic+strain+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O ensaio de PCR multiplex descrito aqui fornece um método simples e confiável para classificar os tipos e subtipos principais de SCCmec I-V em estafilococos, com discriminação simultânea de MRSA de MSSA. O ensaio é robusto, convenientemente feito em uma única reação de PCR e os resultados são fáceis de interpretar. O ensaio tem limitações, pois tem como alvo loci individuais dentro de cada tipo demec SCC, mas não oferece tipagem abrangente de ccr e mec complexa e, portanto, não pode se...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.

Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus resistente

<table><tbody><tr><td>Ágar Soja Tríptico</td><td>Fisher (BD)</td><td>CA90002-700 (236920)</td><td></td></tr><tr><td>Água destilada estéril</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq: incluindo tampão PCR 10x e 50 mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>10966-034</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP</td><td>Life Technologies</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Life Technologies</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>1Kb + DNA</td><td>ladder Life Tecnologias</td><td>10787-026</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml Tubos de microcentrífuga </td><td>VWR (Axygen Scientific)</td><td>10011-700</td><td></td></tr><tr><td>Varetas de cultura</td><td>VWR</td><td>CA10805-018</td><td></td></tr><tr><td>Tubos PCR</td><td>Diamed</td><td>AD0210-FCN (novo #: DIATEC420-1250)</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5417c</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de calor</td><td>VWR</td><td>13259-030 / 13259-286</td><td></td></tr><tr><td>Thermalcycler</td><td>Applied Biosystems (2720)</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de eletroforese em gel horizontal submersível com molde de gel</td><td>BioRad</td><td>170-4469</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação</td><td>BioRad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>Agitador basculante</td><td>VWR</td><td>40000-300</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Imager Gel Doc System</td><td>BioRad</td><td>1708170</td><td></td></tr></tbody></table>

multiplex pcr ensaio para a digita

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Este M-PCR atualizado é capaz de determinar (classificar) os tipos I-V de SCCmec, bem como os principais subtipos de SCCmec IV. O ensaio tem como alvo locos únicos e específicos de SCCmec I, II, III, IVa, IVb, IVc, IVd, IVE e V, com detecção concomitante do gene mecA. A identificação preliminar de SCCmec VI e VIII também é possível, mas exigiria testes adicionais para confirmação. Figura 3 ilustra representações típicas de SCCmec I-VI e VIII e as loca...

Demonstramos um ensaio de PCR multiplex simples para triagem e tipagem rápidas de Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) tipos I-V para Staphylococcus aureus resistente à meticilina e fornecemos algumas das etapas vitais e nuances processuais que o tornam bem-sucedido na adaptação deste ensaio a laboratórios individuais.

Multiplex PCR Ensaio para a digita

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar o tipo SCCmec de isolados de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina, ou MRSA, utilizando um ensaio de PCR multiplex. Isso é realizado primeiramente isolando o DNA das cepas, por meio de uma técnica rápida e simples de extração que envolve o aquecimento das células bacterianas em água. O segundo passo consiste em realizar um ensaio de PCR multiplex para amplificar alvos específicos de cada um dos tipos SCCmec.Em seguida, os produtos de PCR são separados por eletroforese em gel AROS. O passo final é corar o gel para visualização do DNA e análise dos dados. Em última instância, a combinação única de produtos específicos de PCR obtidos com este ensaio de PCR multiplex é utilizada para determinar os tipos SE cmec dos isolados de MRS A. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como os esquemas tradicionais de tipagem S CEC, que visam complexos individuais de genes CCR e MEC e exigem múltiplos tubos de PCR separados, é que este processo simplifica grandemente a carga de trabalho e pode ser realizado em um único tubo de PCR.Estes procedimentos devem ser realizados em um laboratório de nível dois de biossegurança certificado. Equipamentos de proteção individual apropriados devem ser utilizados em todos os momentos no dia anterior à realização da PCR. Selecione uma única colônia de MRSA de uma placa fresca de cultura de 24 horas com um bastão estéril para cultura e prepare uma alça pesada das bactérias em uma placa de ágar triptica de soja.Vários espécimes podem ser esgotados em uma única placa e incubados durante a noite a 37 graus Celsius. Adicione 75 microlitros de água destilada estéril a um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro. Usando um bastão de cultura estéril.Pegue uma pequena quantidade de bactérias do crescimento denso da estria de cultura de incubação prolongada. Agite as bactérias na água estéril para preparar uma solução turva. Repita este processo para todas as amostras.Incube os tubos em um bloco de aquecimento seco ajustado a 95 graus Celsius por 10 minutos para lisar as bactérias e liberar o DNA. Remova as amostras do bloco de aquecimento e deixe em repouso à temperatura ambiente por cinco minutos. Centrifugue as amostras a 13.000 RPM por um minuto.A amostra resultante apresenta um pellet de detritos celulares e um sobrenadante claro contendo o DNA. Para o preparo da PCR, retire os reagentes de PCR, incluindo tampão 10 XPCR, cloreto de magnésio 50 milimolar, DTPs e iniciadores, do congelador a menos 20 graus Celsius e deixe descongelar à temperatura ambiente na bancada limpa de PCR, onde não é permitida a presença de bactérias ou DNA. Tubos de PCR de 0,2 mililitro podem ser preparados e rotulados neste momento.Uma vez descongelado, agite brevemente em vórtex para misturar todos os reagentes e, em seguida, combine conforme indicado no protocolo textual em forma de tabela. É importante usar a DNA polimerase Platinum Taq, pois observou-se que ela influencia o sucesso da reação. Após agitar a mistura mestra em vórtex, distribua-a nos tubos individuais de PCR, feche todos os tubos de PCR e leve-os à bancada geral de trabalho.Adicione o molde aos tubos de PCR pipetando dois microlitros do sobrenadante claro das amostras bacterianas previamente preparadas. Transfira-se para o local dedicado à amplificação antes de colocar os tubos no ciclador térmico e executar a reação conforme indicado no protocolo descrito no texto. Trabalhe em um local dedicado à eletroforese em gel, utilizando 2,5 gramas de agarose para 100 mililitros de tampão 0,5 XTBE em um frasco erlenmeyer de vidro.Cubra o frasco com filme plástico e aqueça a solução no micro-ondas até dissolução completa. Um gel a 2,5% ferve rapidamente. Portanto, interrompa o aquecimento no micro-ondas e agite a solução regularmente.Resfrie os géis até que fiquem em uma temperatura confortável ao toque, girando-os sob água fria ou deixando-os repousar na bancada por cinco minutos. Despeje os géis na bandeja de moldagem após remover os tubos do ciclador térmico de PCR. Prepare as amostras adicionando dois microlitros de corante de carregamento de DNA 6X a cada amostra.Carregue cinco a 10 microlitros de amostra por poço no gel. Uma escada de DNA de um KB plus ou de 100 pares de base é apropriada para os tamanhos de banda esperados. O brometo de etídio pode ser adicionado ao gel antes de despejá-lo ou, alternativamente, o gel pode ser corado em um banho de brometo de etídio antes da visualização.Coloque o gel finalizado em uma solução de 0,5 microgramas por mililitro de brometo de atherium em água destilada e misture suavemente em agitador durante 10 minutos. Transfira o gel para um recipiente limpo e mantenha em água destilada por mais 10 minutos. É mostrado aqui um gel representativo demonstrando os produtos de PCR esperados para todas as cepas representativas dos tipos SEC MEC um a seis e oito, bem como os subtipos A a F do SEC MEK quatro. Para uma cepa típica do SEC MEK um, são esperadas duas bandas.A banda específica do tipo um em 613 pares de bases, bem como a mec, uma banda controle em 147 pares de bases. Três cepas representativas de SEC MEK dois são mostradas, incluindo a cepa prototípica do tipo dois N três 15 e os tipos dois A e dois B menos prevalentes. Para classificar uma cepa como SEC MEK dois, duas bandas devem estar presentes, incluindo o alvo do locus tipo dois em 128 pares de bases e a banda controle Mecca. Duas cepas representativas de SEC MEK três são mostradas no gel, incluindo a cepa prototípica SEC MEK três 85 2 0 8 2 e a variante tipo três A da cepa JCSC dois 90. SEC MEC três é identificada com base na presença de dois produtos de PCR, incluindo o alvo específico do tipo três em 257 pares de bases e o alvo controle Mecca.O SEC MEC três dominante também será positivo para o alvo de mercúrio em 280 pares de bases, que está localizado em um elemento SEC adjacente e serve para distingui-lo do SEC MEC três A cinco, menos comum. São apresentados elementos representativos do SEC MEC quatro, incluindo os tipos quatro A, quatro B, quatro C, quatro D, quatro E e quatro F. Diferentemente do SC MEK um a três, não há um único alvo presente em todos os subtipos do SCC MEK quatro, exceto o meck A. A cepa representativa do SCC MEK quatro E é identificada com base na presença da banda do tipo quatro E, bem como do produto CCR AB quatro, que está presente em um elemento acessório adjacente, e do produto tipo quatro C, que está presente porque o SEC MEK quatro E compartilha a mesma região J um com o SE Cmk quatro. O CSCC MEK quatro F é semelhante ao SEC MEK quatro E no sentido de que compartilha a mesma região J três e, consequentemente, é positivo para o alvo quatro E, bem como positivo para o alvo CCR AB quatro devido a um elemento acessório adjacente. No entanto, o S Cmk quatro F pode ser distinguido do S CMK quatro E pelo fato de não possuir o alvo tipo quatro C.Um CMK SE típico do tipo cinco teria. Dois produtos de PCR presentes no gel: a banda específica do tipo cinco em 325 pares de bases e o controle ME em 147 pares de bases. Finalmente, embora o objetivo deste ensaio não fosse fornecer identificação definitiva de SEC MEK seis ou oito, cepas representativas foram incluídas para ambos, já que um padrão específico de PCR fornece evidência sugestiva da presença desses tipos.Além do alvo Meck A, espera-se que o representante SEC MEK seis produza um produto positivo CR AB quatro de 106 pares de bases, já que este é seu tipo principal de complexo CCR. O representante SEC MEC oito também seria positivo para MEC A em 147 pares de bases e para C-C-R-A-B quatro em 106 pares de bases, sendo distinguido do SEC MEK seis com base em um produto específico do tipo dois positivo, resultante da presença da mesma região J dois SEC MEK dois. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que, devido à natureza sofisticada do ensaio e ao grande número de iniciadores presentes na reação, existe a possibilidade de dificuldades.Ao adaptar este procedimento aos laboratórios individuais, prestar muita atenção a certas questões fundamentais, como a preparação do molde de DNA e a marca dos reagentes de PCR, facilitará em grande medida esse objetivo.

multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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