Identificação de populações específicas de neurônios sensoriais para estudo de canais iônicos expressos

O objetivo geral deste procedimento é identificar neurônios aferentes por marcação retrógrada de corante e estudar os canais iônicos nesses neurônios usando eletrofisiologia e imunoquímica de patch clamp. Isso é feito injetando primeiro DAI no tecido-alvo para rotular os neurônios aferentes inervantes. O segundo passo é isolar os neurônios aferentes dos gânglios da raiz dorsal.

Em seguida, os neurônios marcados são fixados para registrar os canais iônicos fechados, a etapa final é identificar os canais iônicos expressos nos neurônios marcados usando imunoquímica. Em última análise, usando uma combinação de patch, clamp e imunoquímica, somos capazes de identificar o padrão de expressão, bem como as propriedades funcionais dos canais iônicos em neurônios aferentes. A principal vantagem deste método sobre outros métodos existentes é que é um método não invasivo e o DAI que usamos, o DAI I, é conhecido por sua rápida absorção pelos terminais neuronais.

Falta de transferência entre neurônios e retenções de longo prazo dentro dos neurônios que injetamos. Demonstrando o procedimento estaremos eu e Stephanie, técnica de pesquisa de nosso laboratório para injeção de corante. Primeiro, raspe o cabelo sobre a área da panturrilha em ambas as pernas do rato anestesiado usando um barbeador elétrico.

Em seguida, encha uma seringa estéril de um CC com 200 microlitros de solução de 1,5% Dai. Insira lentamente a agulha paralela ao eixo longo de cada músculo gastro e injete 100 microlitros de dai no músculo antes de retirar a agulha do músculo. Puxe o êmbolo da seringa para trás para garantir que o corante não escorra mais da ponta.

Aguarde 10 segundos e retire a agulha do músculo. São necessários quatro a cinco dias para que a distribuição do corante seja preparada para dissecação. Coloque um copo com 10 mililitros de HBSS, uma placa de Petri de 35 milímetros e uma placa de Petri de 100 milímetros no gelo.

Em seguida, pesar sete miligramas de colagenase, um miligrama de DNA e 10 miligramas de tripsina pré-aquecer, um banho-maria agitado a 37 graus Celsius e aquecer um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo 10 mililitros de EBSS no banho. Depois de sacrificar o rato antes da dissecação, corte rapidamente a pele do dorso do animal. Em seguida, remova o tecido conjuntivo e muscular ao longo da coluna vertebral para melhor exposição.

Em seguida, remova a seção lombar da coluna vertebral. Em seguida, coloque a coluna vertebral isolada na placa de Petri de 100 milímetros. Aplique a solução HBSS gelada usando uma pipeta de pastagem estéril para manter a preparação úmida e fria.

Corte os músculos dos lados da coluna vertebral. Realize uma laminectomia dorsal usando rongeurs ou tesouras para remover suavemente o osso e fechar os recessos que contêm os gânglios da raiz dorsal. Repetidamente. Aplique HBSS gelado durante este procedimento.

Sob o microscópio, isole o DRG cortando os nervos periféricos e centrais, deixando de um a dois milímetros de nervo para facilitar o manuseio dos gânglios. Em seguida, coloque o DRG isolado na placa de Petri de 35 milímetros contendo tampão HBSS gelado. Repita os procedimentos até que todos os DRG L quatro e L cinco tenham sido isolados.

Remova o excesso de nervos e vasos sanguíneos usando microtesouras e pinças. Abra o DRG para melhor exposição às enzimas, mas não retire o DRG para dissociação do neurônio DRG. Adicione as enzimas ao meio EBSS quente e, em seguida, vórtice para dissolver e filtrar e esterilizar.

Em seguida, coloque todo o DRG na solução enzimática com uma cabeça de tubo de pastagem estéril. Depois disso, borbulhe o frasco com 95% de oxigênio e 5% de CO2 por 60 segundos antes de tampar bem o frasco. Em seguida, incubar o balão no banho-maria com agitação a 37 graus Celsius durante 60 minutos a 240 RPM.

No final da incubação vigorosamente. Agitar o balão 50 vezes para dissociar o DRG em condições estéreis. Adicione cinco mililitros de MEM plus ao frasco para interromper as atividades enzimáticas.

Transferir o conteúdo do balão para um tubo de centrifugação estéril de 15 mililitros e centrifugar a 16 vezes G durante seis minutos. Depois, remova e descarte o sobrenadante. Adicione cinco mililitros de MEM plus ao tritrato de amostra suavemente com a pipeta.

Para quebrar a etapa de centrifugação repetida do pellet, remova e descarte o sobrenadante e adicione 500 microlitros de MEM mais tritrato suavemente com a ponta da pipeta de um mililitro em uma pipeta para fazer uma suspensão celular. Depois disso, coloque uma lamínula de vidro revestida de polilisina em um prato vazio e estéril de 35 milímetros. Em seguida, adicione uma gota da suspensão da célula no centro da lamínula.

Repita este procedimento até que a solução celular se esgote. Coloque os pratos de 35 milímetros em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de CO2 por uma hora para permitir que os neurônios adiram aos lábios da lamínula após uma hora. Adicione mais dois mililitros de mídia em cada prato e devolva-os à incubadora para realizar a gravação do patch clamp.

Primeiro, identifique os neurônios DRG marcados com corante usando um microscópio com epifluorescência. Em seguida, encha o eletrodo de vidro com solução interna. Bata suavemente para remover quaisquer bolhas presas.

Em seguida, coloque o eletrodo no suporte do eletrodo. Abaixe o eletrodo até a célula usando um micromanipulador. Assim que o eletrodo tocar a célula, aplique uma sucção suave através do tubo de sucção até formar uma vedação hermética.

Em seguida, prenda a tensão da membrana no potencial de retenção desejado. Obtenha a configuração do grampo de remendo de toda a célula aplicando uma sucção mais forte. Para remover o adesivo de membrana na ponta do eletrodo, uma vez estabelecida a configuração do grampo de adesivo de célula inteira, inicie a gravação.

Neste procedimento, fixe os neurônios nas lamínulas com 4% de formaldeído por uma hora. Em seguida, permeie os neurônios com 2% entre 20 em PBS por 10 minutos. Em seguida, incube as células na solução de bloqueio por uma hora.

As células de teste são incubadas na solução de bloqueio mais o anticorpo primário durante a noite. O conjunto de neurônios de controle é deixado para incubar durante a noite em solução de bloqueio sem anticorpos primários. No dia seguinte, lave as lamínulas com tampão PBS três vezes por cinco minutos cada, seguidas de duas lavagens de cinco minutos cada com 1% entre 20 para remover o anticorpo primário não ligado.

Em seguida, incube as lamínulas de teste e controle com o anticorpo secundário marcado com fluorescência apropriado por 30 minutos, que se liga ao anticorpo primário para permitir a visualização. Depois disso, lave as lamínulas com PB S3 vezes por cinco minutos cada para remover o excesso de anticorpos secundários. Em seguida, monte as lamínulas em uma lâmina de vidro limpa usando a mídia de montagem.

Em seguida, aplique esmalte transparente na borda da lamínula para fixá-la no lugar. Depois de secos, visualize os neurônios e capture imagens usando o software que acompanha o microscópio de fluorescência. Esta é uma representação da injeção de Dai no músculo gastro e do transporte retrógrado do músculo para o DRG.

O DRG L quatro e L cinco são rotulados aqui. Os neurônios aferentes são mostrados na imagem de campo brilhante e esta imagem fluorescente mostra um neurônio aferente muscular marcado com corante. Este histograma mostra a intensidade fluorescente DII dos neurônios sensoriais.

O pico grande é de neurônios não marcados e é equipado com uma equação gaussiana para determinar a intensidade média e o desvio padrão. A linha vertical tracejada representa o limite para a rotulagem de DAI. O histograma compreende dados de 1047 neurônios, sendo 167 marcados com dai.

Aqui está um neurônio aferente muscular representativo com bom controle da voltagem da membrana. As correntes de sódio em menos 20, menos 10 e zero milivolts são mostradas à esquerda e a relação de tensão atual é mostrada à direita. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de dissecar os DRGs de forma rápida, mas suave, e manter a preparação úmida repetidamente no código de gelo hbss.

Após este procedimento, outros neurônios eferentes podem ser rotulados e identificados para entender seu papel na fisiologia.