Preparação de primário neurônios para visualizar Neuritos num Estado Frozen-hidratado Usando Cryo-Electron Tomografia

Para preservar processos neuronais para análise ultra-estrutural, nós descrevemos um protocolo para revestimento dos neurônios primários em grades de microscopia eletrônica seguido de congelamento flash, rendendo amostras suspensas em uma camada de gelo vítreo. Essas amostras podem ser examinadas com um microscópio crio-eletrônico para visualizar estruturas em escala nanométrica.

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver neurônios primários de ratos de tal forma que seus neurônios sejam adequados para visualização por microscopia crioeletrônica. Isso é feito primeiro preparando pratos com grades EM para revestir os neurônios primários. O segundo passo é preparar e colocar os neurônios primários nas grades EM.

Em seguida, é realizada a vitrificação de neurônios em grades EM. A etapa final é a coleta de imagens por microscopia crioeletrônica, seguida de pós-processamento e anotação. Em última análise, a microscopia crioeletrônica e a tomografia são usadas para mostrar a ultraestrutura dos neuritos em um estado hidratado congelado

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que ela pode ser usada para visualização 3D de neuritos hidratados congelados em resolução nanométrica sem o uso de fixadores químicos. Facilitando, portanto, a avaliação de características morfológicas mais próximas do estado nativo. Comece este procedimento examinando a integridade do carbono sagrado nas grades EM de ouro.

Usando um microscópio de luz com uma ampliação de pelo menos 25 vezes, certifique-se de que os orifícios de carbono estejam maiores que 98% intactos. Para o revestimento de neurônios primários, use um bico de Bunsen para esterilizar as grades EM e, ao mesmo tempo, torná-las hidrofílicas. Transfira imediatamente a grade com o lado de carbono para o centro do vidro.

Prato inferior, coloque uma grade EM por prato e use apenas pratos de fundo de vidro pré-esterilizados. Em seguida, use um microscópio óptico para verificar a integridade da grade, mantendo a grade EM dentro da placa de fundo de vidro em uma capa de cultura de tecidos, aplique 250 microlitros da substância de revestimento apropriada na área central de vidro da placa de Petri. Lenta e cuidadosamente, certifique-se de que a substância de revestimento apropriada cubra toda a grade E EM.

Depois, cubra a placa de Petri com a tampa e incube os espécimes por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, aspire toda a mistura de poliol lisina da louça com uma ponta de pipeta estéril presa ao tubo de vácuo no exaustor. Evite o contato direto com a grade E EM.

Em seguida, use uma pipeta de deslocamento de ar ajustável para aplicar cuidadosamente 250 microlitros de PBS estéril para cobrir totalmente a grade EM na área central de vidro de cada placa de Petri. Em seguida, aspire o PBS de cada prato. Repita o procedimento três vezes depois disso.

Deixe os pratos com grades EM secarem na capa de cultura de tecidos por 15 minutos. Verificação sob o microscópio de luz. Certifique-se de que eles estejam completamente secos e que não haja bolhas de umidade na grade.

Caso contrário, aspire cuidadosamente ao lado da grade EM para eliminar essa umidade extra, a grade revestida deve ser usada imediatamente para revestir os neurônios. Neste procedimento, calcule o volume apropriado de células para cada prato, a fim de atingir uma concentração de 50.000 células por mililitro por prato. A quantidade máxima de aplicação deve ser de 250 microlitros para preencher apenas a área central do vidro, não o prato inteiro.

Em seguida, incube os pratos por 30 minutos em uma incubadora de CO2 a 37 graus Celsius para permitir que as células se recuperem e adiram após 30 minutos, adicione lentamente 1,5 mililitros do meio celular aquecido a cada prato e evite tocar na grade EM para neurônios do hipocampo. Altere a mídia no dia seguinte e, em seguida, altere metade da mídia a cada dois dias por 14 dias. Neste procedimento, prepare o equipamento e todos os materiais para congelar e armazenar as grades EM de ouro em temperatura criogênica, que incluem um dispositivo de vitrificação com câmara de umidade, papel de filtro sem cálcio, um par de pinças longas de ponta plana, um par de pinças especializadas de ponta fina para a máquina de vitrificação, um fazedor de nitrogênio líquido, um recipiente de refrigerante e a caixa de armazenamento da grade EM.

Em seguida, ligue o dispositivo de vitrificação. Defina a umidade para 100% e a temperatura para 32 graus Celsius. Na seção de opções, defina o tempo do bloco para zero segundos.

Isso permite o borrão manual através da janela lateral da câmara de umidade. Em seguida, empilhe três papéis de filtro sem cálcio. Corte a pilha em tiras de 0,5 centímetro de largura com cerca de dois centímetros de comprimento depois disso, dobre-as em um ângulo de 90 graus de modo que uma seção do papel tenha 0,5 centímetros por 0,5 centímetros

Esta seção será usada para borrar a amostra. Remova o papel do meio e coloque-o em outro papel de filtro sem cálcio até o uso. Em seguida, use a vitrificação especializada em pinças para escolher cuidadosamente a grade EM do prato.

Observe o lado da grade EM em que os neurônios estão crescendo, pois a posição será importante para a próxima etapa. Em seguida, use a trava deslizante preta nas pinças para travar as pinças com segurança na grade EM. Agora insira as pinças na máquina de vitrificação de modo que o lado da grade EM no qual os neurônios estão aderidos fique voltado para a esquerda e para longe do orifício de abertura circular na lateral da máquina de vitrificação.

Em seguida, retraia as pinças que prendem a grade EM na máquina de vitrificação. Em seguida, coloque o recipiente de refrigerante cheio de LN dois adequado e etano líquido no suporte apropriado da máquina de vitrificação usando o comando de tela apropriado da máquina de vitrificação. Levante a câmara de refrigeração até que esteja nivelada com o fundo da câmara de umidade com a pinça de ponta plana.

Segure uma extremidade do papel de filtro de forma que o lado mais curto fique perpendicular à pinça. Esta face entrará em contato direto com a grade EM para borrar. Agora, insira cuidadosamente o papel de filtro no orifício lateral da câmara de umidade de forma estável Segure o papel contra a grade EM por 10 segundos, descarte o papel e mergulhe imediatamente.

Congele a amostra no etano líquido usando a automação da máquina de vitrificação. Depois, transfira cuidadosamente a grade EM hidratada congelada para um dos slots no armazenamento da grade. Esta é uma imagem de microscópio de luz da área central de uma grade EM com ampliação de 10 vezes na qual os neurônios primários de ratos estão crescendo há duas semanas.

Aqui está a visão ampliada da caixa aquática onde os neurônios e suas projeções de neuritos são observados. Esta é uma micrografia eletrônica de um neurite projetando-se para fora do corpo do neurônio com ampliação de 4K. A caixa azul é vista de perto aqui, onde as características internas dos neuritos são claramente visíveis com ampliação de 20 K.

Este vídeo mostra uma pilha reconstruída em 3D de micrografias de um neurite da cultura primária de neurônios do hipocampo de ratos. Ele é fotografado usando tomografia e seguido pela anotação de cor 3D correspondente. Aqui está outro vídeo mostrando uma pilha reconstruída em 3D de imagens de um axônio do gânglio da raiz dorsal de rato coletado usando tomografia crioeletrônica seguida pela anotação de cor 3D correspondente e mostrada aqui está a montagem de quatro imagens 2D crio-EM de um axônio do gânglio da raiz dorsal de rato separado tiradas com ampliação de 20 K.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar neurônios primários em grades de microscopia eletrônica de forma adequada para visualizar seus neurônios em um estado hidratado congelado usando tomografia crioeletrônica.