Name: MicroRNA Em situ Hibridização de tecidos de rim fixadas em formalina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Aprenda a hibridização in situ para detectar microRNAs em seções renais fixadas em formalina. Este método permite localizar e quantificar a expressão de microRNAs em diferentes segmentos do néfron com detecção colorimétrica.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health dos EUA concede HL082798 e HL111580.

1. Rim Tecido Seções <ol><li> Fixadas em formalina (10%) secções de rim embebidas em parafina são cortados em lâminas de microscópio a 5 mm de espessura usando um Microm HM 355 S. As lâminas podem ser armazenadas durante vários meses, antes da análise. </li></ol> 2. Preparação de Solução <ol><li> Prepare 1 litro de PBS 1x em DDH 2 O em um parafuso de garrafa top autoclave. Encha uma garrafa com 1 L de DDH 2 O. Adicionar 1 ml de DEPC para cada garrafa, tampa e agitar vigorosamente. Deixe a solução assentar durante a noite à temperatura ambiente, para destruir ARNases e, em seguida, autoclave. Adicionar 400 ml de Tween-20 a 1 L de 1x PBS para fazer PBS-T. </li><li> Preparar tampão de proteinase K (50 mMTris-HCl, pH 8,0 e 1 mM de CaCl2 em água tratada com DEPC). </li><li> Prepara-se uma solução de 0,2% de glicina em PBS-T. </li></ol> 3. Preparação Tissue <ol><li> Prepara-se uma grande quantidade de tampão de hibridação (50-100 ml), composto de 50% de formamida, 5x SSC, 0,1% de Tween, 9,2mM de ácido cítrico para o ajuste de pH de 6, 50 ug / ml de heparina, e 500 ug / ml de ARN de levedura em DEPC tratados ddH 2 O. Divida em 1 ml alíquotas e armazenar a -80 º C. </li><li> Retirar a parafina do tecido por lavagem 3x em xileno fresco, durante 5 minutos cada. </li><li> Re-hidratar as secções de tecido por 5 min em incubações concentrações decrescentes de etanol (100%, 75%, 50% e 25%) em ddH 2 O. </li><li> Tratar as lâminas com DEPC suficiente para cobrir completamente as secções de tecidos (cerca de 0,4-0,5 ml) durante 1 min. Fazer tecidos certeza não sequem. </li><li> Enxaguar as lâminas em DEPC tratados PBS-T duas vezes por 5 min, recolhendo o DEPC contendo resíduos para o descarte adequado. Todos os reagentes devem ser tratados DEPC para eliminar RNAses a partir deste ponto. </li><li> Pré-aquecer proteinase K e adicionar tampão de proteinase K para uma concentração final de 10 ug / ml. Cobrir as secções de tecido com uma solução de proteinase K e incubar a 37 º C durante 5 min. </li><li> Remover rapidamente as proteinassolução de e K e adicionar 0,2% de glicina em PBS-T, durante 30 seg. </li><li> Lavar as lâminas em DEPC tratados PBS-T duas vezes por 30 segundos cada. </li><li> Fix seções acabado de fazer paraformaldeído 4% por 10 min. </li></ol> 4. Hibridização <ol><li> Adicionar 50 ul de tampão de hibridação (formamida a 50%, 5x SSC, 0,1% de Tween, ácido cítrico 9,2 mM, para o ajuste de pH de 6, 50 ug / ml de heparina, 500 ug / ml de ARN de levedura) por secção de tecido e cobrir com RNAse HybriSlips livres corte maior do que as secções de tecido. </li><li> Secções Prehybridize em humidade controlada forno de hibridação durante 2 horas à temperatura de hibridização para determinar a extremidade 3 &#39;da sonda marcada com digoxigenina (usualmente ADN Tm da sonda de -21 ° C, (isto é, 54 ° C durante o miR-382, a sonda de DNA Tm = 75 ° C ), usando lenços de laboratório tecido embebido em 50% formamide/50% 5x SSC para manter a câmara úmida. </li><li> Diluir a sonda miRNA, controle positivo (U6, RNA nuclear pequeno) e controle negativo (mexidossequência) a 40 nM em tampão de hibridação (75 ul de tampão é necessária por secção). </li><li> Aquece-se a sonda em tampão de hibridação a 65 º C durante 5 min. </li><li> Retirar as lâminas do forno de hibridização e remover lamelas e tampão de hibridação excesso de pré-hibridização. </li><li> Adicionar 75 ul de tampão sonda contendo por secção de tecido, directamente para o tecido. Cubra com tecido HybriSlips apenas grandes o suficiente para cobrir os cortes de tecido. </li><li> Manutenção do nível de suporte de slides, voltar ao forno de hibridização para incubação durante a noite à temperatura do passo 4.2 (aproximadamente 16 horas). </li></ol> 5. Lavagem rigorosa <ol><li> Adicionar 200 ul de 2xSSC, aquecida à temperatura de hibridação, pouco menos de uma borda das lamelas para ajudar a libertar a lamela do tecido. Retirar as lamelas pela inclinação do slide. </li><li> Lavar as lâminas em 200 ul de 50% de formamida, 50% 2x SSC à temperatura de hibridação 3x durante 30 minutos cada. </li><li> Enxaguaras lâminas 5x em PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min cada, num agitador orbital de velocidade baixa. </li></ol> 6. Detecção <ol><li> Incubar corrediça em tampão (2% de soro de cabra ou cavalo, 2 mg / ml de BSA em PBS-T) de bloqueio, durante 1 hora à temperatura ambiente num agitador orbital de velocidade baixa. </li><li> Dilui-se os fragmentos de anti-DIG-AP Fab em tampão de bloqueio a 1:100. Adicionar 100 l por secção de tecido e cubra com HybriSlips cortado apenas suficientemente grande para cobrir a seção. </li><li> Incubar anticorpo numa câmara humidificada a 4 ° C durante a noite (aproximadamente 16 horas). </li><li> Lavar as lâminas em PBS-T 7x, durante 5 min cada, num agitador orbital a uma velocidade baixa. </li><li> Lavar as lâminas em tampão de AP (100 mM Tris-HCl pH 9,5, 50 mM de MgCl 2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20) 3x, durante 5 minutos cada. </li><li> Adicionar solução de NBT / BCIP de tampão AP (200 μl/10 tampão ml) </li><li> Adicionar 400-500 ml de solução diluída de NBT / BCIP a cada slide para cobrir completamente todas as seções do tecido. Desenvolver em um escuro, nível, humidifcâmara de IED para 4-5 horas. </li></ol> 7. Slides de montagem <ol><li> Desidratar secções em concentrações crescentes de etanol (25%, 50%, 75%, 100%) durante 5 minutos cada. </li><li> Incubar em 5x xileno para limpar seções. </li><li> Monte desliza Permount montagem médio e secar durante a noite. </li></ol>

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<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li>
</ol>

Não há nada a divulgar.

O objetivo deste artigo foi descrever um protocolo para miRNA hibridização in situ que funciona bem em tecidos renais formol fixos. Enquanto trabalham fora deste protocolo várias fontes importantes de artefato coloração foram identificados. Atenção especial para estes pontos podem ajudar a evitar manchas artefato e aumentar a probabilidade de uma corrida ISH bem sucedida. Uma das causas mais evitáveis ​​de artefato coloração pode ocorrer quando cortes de tecidos tornam-se secos dura...

MicroRNA são pequenos (cerca de 22 nucleótidos de comprimento) que não de codificação RNAs que são produzidos endogenamente. Eles geralmente funcionam para suprimir a expressão da proteína através da repressão de translação ou degradação do mRNA. miRNAs ligam a alvos de RNAm com complementaridade incompleta, tornando possível que um único miRNA para suprimir múltiplos alvos. Entendimento que tipos e estruturas celulares expressar miRNAs é uma parte importante da compreensão dos mecanismos através dos quais alterações miRNA celular influência expressão e fenótipos de tecido. Enquanto os métodos tais como a sequenciação de miARN, qPCR e Northern blotting pode ser usado para a detecção de miRNAs em tecidos completos, esta abordagem não permitem determinar qual o tipo de célula específico que veio a partir de um determinado tecido. Dissecção de componentes celulares e estruturais antes da análise usando estes métodos pode ser muito difícil, e as condições necessárias para atingir isolamentos adequados pode levar a alterações na expressão de genes ou a degradação de ARN. microRNA hibridação in situ é um método usado para visualizar a localização microRNA e os níveis de expressão em tecidos. Esta técnica é especialmente valiosa em tecidos compostos de estruturas heterogéneas, tais como o rim. MicroRNAs demonstraram desempenhar um papel regulador no desenvolvimento do rim 2,3 e fisiologia 4. Alterações de expressão microRNA também têm sido mostrados para ser envolvido com a patologia renal, tais como fibrose 5-10, nefropatia diabética 7, carcinoma renal, 11,12, e lesão renal aguda 13. Em nossa pesquisa, descobrimos que a otimização microRNA hibridização in situ para os tecidos renais foi valioso para determinar os locais exatos estruturais de expressão de miRNA em saúde e na doença 14. Determinação da expressão tubular e celular de diferentes microRNAs é importante porque a sua regulação de targets pode ser dependente de funções celulares. No estado de doença, é também importante para determinar como as alterações na expressão de miARN pode ser afectar a função. O objetivo do método descrito aqui foi a de construir sobre metodologias ISH existentes desenvolvidos por 15 Kloosterman et al., Outros pesquisadores 16,17, e os sugeridos pela Exiqon 1 e otimizar o método para tecidos renais fixados em formalina. Temos utilizado com sucesso este método para identificar as diferenças regionais distintos na expressão renal microRNA miR-382 com obstrução ureteral unilateral 18. Esta abordagem pode ser utilizada com outros tecidos, bem como, com optimização adicional.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Dietil Pirocarbonato</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Ultra Puro</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Vida Útil Technologies</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>J.T. Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Cítrico</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>Yeast RNA</td><td>Life Technologies</td><td>AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3' Sonda DIG- miRNA</td><td>Exiqon</td><td>miR dependente-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- Sonda miR embaralhada</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3' Sonda DIG- U6 miR</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenina-Ab Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>Fisher</td><td>Ajuste ao tamanho</td><td></td>do tecido</tr><tr><td>Microtom HM 355 S</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>Forno de Hibridização Deslizante</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Bandeja de Alumínio</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>Inserção de Rack de Aço Inoxidável</td><td>Boekel</td><td>C2403754</td><td></td></tr></tbody></table>

microrna<em&gt; em situ</em&gt; hibridização de tecidos de rim fixadas em formalina

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

Neste artigo descrevemos um método de detecção colorimétrica de miRNA no rim através de hibridização in situ com sondas marcadas com digoxigenina microRNA. Este protocolo, desenvolvido originalmente por Kloosterman e colegas para amplo uso com sondas Exiqon miRNA 1, foi modificado para superar os desafios inerentes à análise de miRNA em tecidos renais. Estes incluem questões como a identificação da estrutura e difícil de remover sonda residual e de anticorpos. Utilização de relativamente fina, espessura de 5 mm, as secções de tecido permitido para melhor visualização das estruturas do rim, ao passo que um sinal forte de sonda foi retido nas células. Além disso, as condições de concentração de sonda e de incubação foram otimizados para facilitar a visualização da expressão do microRNA com baixa de fundo e um sinal não específico. Aqui, o protocolo optimizado é descrito, cobrindo a recolha inicial de preparação de tecidos e, através da montagem das lâminas, no final do procedimento. O compone básiconts deste protocolo pode ser alterado por aplicação de outros tecidos e modelos de cultura de células.

As áreas de uma secção de tecido que se tornam secas durante as hibridações, as incubações ou passos de lavagem geralmente acabam coloração mais escura, durante o desenvolvimento de NBT / BCIP. Figura 1 mostra uma porção de uma secção de rim em que o HybriSlip escorregou da borda o tecido, permitindo tornar-se parcialmente desidratado. Apesar de re-hidratação e de cobertura nas etapas restantes, o sinal na porção desidratado é artificialmente elevada. A importância de contro...

Este artigo descreve um protocolo de hibridização in situ em otimizado para detecção colorimétrica de expressão de microRNA em seções renais fixados em formalina.

MicroRNA<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização de tecidos de rim fixadas em formalina

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

O objetivo geral do experimento a seguir é localizar e quantificar a expressão de microRNA em tecidos renais. Isso é alcançado primeiramente pela hibridização de uma sonda marcada e digoxigenada a um determinado microRNA no tecido renal. Como segundo passo, um anticorpo contra digoxigenina, conjugado à fosfatase alcalina, é incubado com o tecido.Em seguida, um substrato N-B-T-B-C-I-P é adicionado ao tecido para visualizar a localização do micro RNA mediante o desenvolvimento de um produto com coloração azul nos locais onde houver hibridização das sondas de micro RNA. Os resultados obtidos mostram onde os microRNAs são expressos nas regiões renais e nos segmentos do néfron, com base na hibridização de sondas complementares de micro RNA. Este procedimento utiliza cortes renais fixados em formalina e emblocados em parafina, montados em lâminas de microscopia com espessura de cinco micrômetros. Para preparar os cortes renais para análise, remova primeiramente a parafina do tecido com três lavagens em xilol fresco, durante cinco minutos cada.Reidrate cada corte tecidual com incubações de cinco minutos em concentrações decrescentes de etanol em água bidestilada. Em seguida, trate os lâminas com quantidade suficiente de dathyl, percarbonato ou desy para cobrir completamente os cortes teciduais por um minuto. Certifique-se de que os tecidos não sequem.Remova o desy e lave as lâminas em PBST tratado com dessy duas vezes por cinco minutos. Certifique-se de que o dessy contendo resíduos seja coletado para descarte adequado.A partir deste momento, todos os reagentes devem ser tratados para eliminar RNAs. Adicione proteinase K ao tampão de proteinase K pré-aquecido até uma concentração final de 10 microgramas por mililitro. Cubra as seções de tecido com a solução de proteinase K e incube a 37 graus Celsius por cinco minutos. Remova rapidamente a solução de proteinase K e adicione glicina 0,2% em PBST por 30 segundos.Lave as lâminas em PBST duas vezes, por 30 segundos cada. Por fim, fixe as seções de tecido em paraformaldeído a 4% recém-preparado durante 10 minutos.Para iniciar este procedimento, adicione 50 microlitros de tampão de hibridização por seção de tecido e cubra com lamínulas livres de RNAses, levemente maiores do que as seções de tecido. Coloque as lâminas em uma câmara umidificada com lenços de laboratório embebidos em 50% formamida e 50% 5X SSC. Pré-hibridize as seções de tecido colocando a câmara umidificada por duas horas em uma estufa na temperatura de hibridização determinada para a sonda marcada com digoxigenina no extremo 3’. A temperatura de hibridização para a sonda é geralmente a temperatura de fusão do DNA, ou TM da sonda, menos 21 graus Celsius.Por exemplo, a temperatura de hibridização para a sonda mere 3 82 é de 54 graus Celsius porque sua TM é de 75 graus Celsius. Prepare a sonda de micro RNA e os controles positivo e negativo diluindo cada uma para 40 nano molar em tampão de hibridização. O controle positivo é o RNA nuclear pequeno U seis e o controle negativo é uma sequência embaralhada.Aqueça a sonda e os controles a 65 graus Celsius por cinco minutos. Remova as lâminas do forno de hibridização. Remova as lamínulas e o excesso de tampão de hibridização da montagem de pré-hibridização.Adicione 75 microlitros de sonda contendo tampão diretamente sobre cada seção de tecido. Cubra com lamínulas de hibridização que, novamente, sejam apenas grandes o suficiente para cobrir as seções de tecido. Mantenha o porta-objetos nivelado.Retorne as lâminas para a estufa de hibridização na temperatura apropriada. Incube durante a noite por aproximadamente 16 horas. Após a conclusão da hibridização, remova as lâminas da estufa de hibridização.Adicione 200 microlitros de dois XSSC aquecidos até a temperatura de hibridização logo abaixo de uma das bordas da lamínula para ajudar a soltar a lamínula do tecido. Remova a lamínula inclinando a lâmina. Após a remoção das lamínulas, lave as lâminas em 200 microlitros de 50 por cento de amida 50 por cento dois XSSC à temperatura de hibridização determinada, três vezes, por 30 minutos cada.Lave as lâminas cinco vezes em PBST, à temperatura ambiente, durante cinco minutos cada, em agitador orbital em baixa velocidade. Inicie este procedimento incubando as lâminas em tampão bloqueador por uma hora à temperatura ambiente em agitador orbital em baixa velocidade. Após uma hora, adicione 100 microlitros de fragmentos FAB anti-dig AP a cada seção de tecido, cobrindo com lamínulas.Corte grande o suficiente para cobrir a seção. Incube as lâminas em uma câmara umidificada a quatro graus Celsius durante a noite ou por aproximadamente 16 horas no dia seguinte. Lave as lâminas sete vezes em PBST à temperatura ambiente, por cinco minutos cada vez, em um agitador orbital ajustado em baixa velocidade.Em seguida, lave as lâminas no tampão AP três vezes, por cinco minutos cada. Prepare a solução reveladora de N-B-T-B-C-I-P adicionando 200 microlitros da solução de N-B-T-B-C-I-P a 10 mililitros de tampão AP. Adicione 400 a 500 microlitros da solução diluída de N-B-T-B-C-I-P a cada lâmina, cobrindo completamente todas as seções de tecido.Desenvolva em uma câmara escura e umidificada, por quatro a cinco horas à temperatura ambiente, quando a detecção colorimétrica estiver concluída. Desidrate os cortes em concentrações crescentes de etanol por cinco minutos cada, e limpe os cortes mediante cinco incubações em xilol por cinco minutos cada vez. Por fim, monte as lâminas em meio de montagem tipo per mont e seque-as durante a noite.É fundamental garantir que o corte do tecido não seque para o sucesso deste protocolo de hibridização in situ. A parte esquerda desta figura mostra uma porção de um corte renal na qual a lamínula deslizou para fora da borda do tecido, permitindo que ele se desidratasse parcialmente. Apesar da reidratação e da cobertura nas etapas restantes, o sinal na porção desidratada é artificialmente alto em comparação com a porção que permaneceu coberta pela lamínula.A barra de calibração representa 100 mícrons nesta imagem. A importância de otimizar a duração do desenvolvimento do N-B-T-B-C-I-P é demonstrada nestas figuras seguintes. O painel A mostra que períodos de desenvolvimento superiores a quatro ou cinco horas resultam em desenvolvimento de cor acentuado e não específico, bem como em tecidos controle de micro RNA embaralhados em todo o rim.O painel B mostra que incubações superiores a quatro ou cinco horas não resultam em melhora adicional no sinal quando os rins são analisados para alvos de alta abundância, como o controle de RNA nuclear pequeno U seis. Essas figuras adaptadas de um estudo anterior confirmam a aplicabilidade deste método de hibridização in situ à detecção de micro RNA em tecido renal. O painel A mostra imagens representativas da expressão de mere 3 82 obtidas por hibridização in situ em seções renais de camundongos com ou sem obstrução ureteral unilateral ou UUO e tratados com anti-ME 3 82 ou antis. O UUO induziu um aumento na expressão de mere 3 82, conforme demonstrado pela coloração mais intensa no tecido UUO mais antis scrambled em comparação com o tecido sham mais antis scrambled.Esse aumento foi bloqueado pelo tratamento com anti-ME 3 82. Os gráficos no painel B mostram a expressão de mere 3 82 em camundongos tratados com sham mais antis scrambled como percentual da densidade óptica integrada média. Como observado, uma medida da intensidade dos pixels, a UUO induz um aumento significativo na expressão de mere 3 82 na medula externa e interna, e o anti-ME 3 82 bloqueia esse efeito.Esse aumento, todo ele passível de ser visualizado e medido por hibridização in situ de microRNA. Esses resultados também são consistentes com resultados de qPCR-R que não são mostrados aqui, indicando que o uso da hibridização INI dois para detectar a expressão de mere 3 82 em rim fixado em formalina é sensível o suficiente para fornecer resultados quantificáveis que refletem a análise de expressão baseada em qPCR-R. Além disso, a hibridização C dois permite a medição de diferenças regionais distintas na expressão de microRNA dentro do rim.

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