Cultivar e Manter

O objetivo geral deste procedimento é isolar C. difficile de amostras fecais para cultivar C. difficile, preparar estoques de glicerol para armazenamento de longo prazo e preparar e enumerar estoques de esporos para diversas aplicações posteriores. Isso é realizado primeiramente isolando C. difficile de amostras de fezes por meio de plaqueamento em meio seletivo. O segundo passo consiste em cultivar C. difficile em meio líquido e manter estoques de longo prazo de C. difficile em glicerol.

Em seguida, C difficile é recuperado de estoques congelados em glicerol e estriado em placas de ágar. Na etapa final, são preparados estoques de esporos de C difficile e enumerados, por fim, seguindo estes protocolos. C difficile pode ser cultivado em diversos meios para verificar e confirmar sua identidade, além de ser cultivado e mantido com sucesso.

Esses colos de glicerol e culturas podem ser utilizados posteriormente em inúmeras aplicações downstream, incluindo estudos com animais e estudos adicionais de biologia molecular. A principal vantagem do uso de uma câmara anaeróbica de vinil para o cultivo de c difficile em comparação com outros métodos, como o uso de potes com vela, é que um ambiente anaeróbio rigoroso pode ser mantido, permitindo um crescimento consistente e confiável de c difficile. Geralmente, pessoas novas nessas técnicas podem enfrentar problemas devido à falta de destreza dentro da câmara causada pelas luvas, bem como à necessidade crítica de planejar seus experimentos com antecedência.

Demonstrando esses procedimentos estará um técnico do meu laboratório, Jose Suarez No início. Este procedimento pode ser realizado em condições aeróbicas. Primeiro, pese a amostra de fezes.

Isso é necessário para enumerar C. difficile nas fezes. Em seguida, re-suspenda a amostra fecal em um XPBS e vortexe para garantir que a amostra fecal seja completamente re-suspensa. A seguir, faça diluições seriadas da amostra fecal re-suspensa em um XPBS para o isolamento apropriado ou enumeração de unidades formadoras de colônia ou UFC por grama de fezes a partir de agora.

Realize o procedimento em condições anaeróbicas para garantir que as células vegetativas de C difficile não sejam expostas a qualquer oxigênio. A câmara anaeróbica utilizada neste experimento é mantida a 37 graus Celsius. Utilizando técnica asséptica.

Adicione 100 microlitros de cada diluição em série em placas de Toro collate oxetano, cyclo Seine, ágar frutose ou T-C-C-F-A. Essas placas foram previamente reduzidas por pelo menos uma a duas horas na câmara anaeróbica para garantir a remoção do oxigênio residual. Para isolar colônias para contagem precisa ou para outras aplicações posteriores.

Use um alça de inoculação estéril para espalhar uniformemente a cultura aplicada sobre a superfície da placa T-C-C-F-A. Incube as placas anaerobicamente por 48 horas a 37 graus Celsius. Identifique as colônias de c difficile com base na aparência plana e irregular, semelhante a vidro fosco, para garantir que as formas vegetativas de c difficile não sejam mortas pela exposição ao oxigênio.

As placas para o isolamento de colônias para aplicações posteriores devem ser mantidas dentro da câmara anaeróbica o tempo todo. Para a enumeração de colônias, as placas podem ser retiradas da câmara anaeróbica. Observe que, assim que uma placa for retirada da câmara, as formas vegetativas de C. difficile serão expostas ao oxigênio e morrerão.

Essas colônias de C difficile não podem ser recuperadas mesmo se a placa for devolvida à câmara. Conte as colônias de C difficile de cada diluição e calcule o número de UFC por grama de amostra fecal para o cultivo e a preparação de estoces glicerinados de C difficile. Use um alça estéril para selecionar uma colônia individual e semear em um ágar cérebro-corpo de infusão previamente reduzido.

Suplementado com extrato de levedura ou placa de ágar BHIS, suplementada com 0,03% de cisteína, estriar colônias individuais e quadrantes usando uma alça de inóculo estéril nova para cada quadrante. Incubar as placas anaerobicamente a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas. Assim que colônias isoladas aparecerem nas placas de ágar BHIS, escolher uma colônia isolada individual e ressuspender a colônia em 10 mililitros de meio líquido BHIS previamente reduzido, suplementado com 0,03% de L-cisteína, e incubar durante a noite.

Anaerobicamente a 37 graus Celsius ou até que o cultivo fique turvo. No dia seguinte, adicione 333 microlitros de glicerol a 50% e 666 microlitros do cultivo de C. difficile a um tubo criogênico de 1,8 mililitro. Para criar um estoque de glicerol a 15% da linhagem isolada, tampe firmemente o tubo criogênico e misture.

Retire imediatamente o estoque da câmara anaeróbica e coloque-o em um congelador a menos 80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo. Para iniciar este procedimento, retire o estoque congelado de glicerol de C. difficile do congelador a menos 80 graus Celsius. Para evitar o descongelamento.

Coloque imediatamente o estoque congelado de glicerol em um suporte de resfriamento que tenha sido armazenado a menos 80 graus Celsius antes do uso. Leve o estoque congelado de glicerol dentro do suporte de resfriamento para a câmara anaeróbica utilizando técnica asséptica e uma alça de inoculação estéril. Coloque uma pequena quantidade do estoque na placa e risque em um quadrante da placa.

Gire a placa 90 graus e, utilizando um novo alça estéril, risque através do segundo quadrante. Repita para o terceiro e quarto quadrantes para garantir o isolamento de colônias individuais. Remova imediatamente o estoque congelado de glicerol da câmara anaeróbica e retorne ao congelador a menos 80 graus Celsius.

Incube a placa anaerobicamente durante a noite a 37 graus Celsius para purificar esporos da cultura de C. difficile. Estriquee cepas de estoque congelado de glicerol em placas de BHIS previamente reduzidas. Siga o procedimento demonstrado no segmento anterior.

Incubar anaerobicamente durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Reisolar colônias individuais em várias placas 70 30 previamente reduzidas. Incubar anaerobicamente a 37 graus Celsius por 24 a 48 horas.

Uma vez formados os esporos, remova as placas da câmara anaeróbica. Raspe as placas usando um alça de inoculação estéril e re-suspenda as células em 10 mililitros de PBS 1X estéril. Descarte as placas, pelote as células a 3000 G durante 15 minutos.

Remova o sobrenadante, adicione um mililitro de PBS 1X para ressuspendência, ressuspenda e reencapsule novamente dessa maneira. Lave as células duas vezes em PBS, incube a quatro graus Celsius durante a noite para auxiliar na lise das células vegetativas e células mães no dia seguinte, incube a 70 graus Celsius por 20 minutos para eliminar quaisquer células vegetativas residuais. Para determinar a UFC por mililitro, dilua seriamente cada preparação de esporos em PBS 1X e plaque em BHIS previamente reduzido acrescido de 0,1% de colinato de sódio; incube as placas a 37 graus Celsius por no mínimo 24 horas antes de enumerar as colônias.

Os esporos podem ser armazenados em XPBS, seja à temperatura ambiente para armazenamento de curto prazo, ou a quatro graus Celsius para armazenamento de longo prazo. A. Um exemplo de C. difficile cultivado em BHIS e ágar sangue ovino anaeróbico de Columbia pode ser visto aqui.

C. difficile forma colônias irregulares que são planas e possuem uma aparência semelhante a vidro fosco, evidente em ambos os meios. O painel A mostra um isolado clínico sensível à eritromicina, C. difficile 630 E, cultivado em ágar BHIS, um meio enriquecido não seletivo, durante 24 horas. A 37 graus Celsius, as colônias em ágar sangue ovino anaeróbio de Columbia mostradas no painel B parecem semelhantes às cultivadas em BHIS sob luz branca.

No entanto, o uso desse meio também permite a detecção da fluorescência esverdeada ou cítrica exibida pelo C difficile sob luz ultravioleta de onda longa, mostrada no painel C após este procedimento. Outros métodos, como curvas de crescimento em meio líquido, isolamento de colônias, extração de DNA e RNA, PCR e outras técnicas de biologia molecular, bem como manipulações adequadas para o C difficile, assim como o uso de esporos de C difficile em estudos com animais, podem ser realizados para responder a questões adicionais de biologia molecular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar, cultivar e manter células vegetativas e esporos de C difficile em um ambiente anaeróbio.

Não se esqueça de que C difficile é um patógeno humano e animal que pode causar doenças gastrointestinais. Experimentos com C difficile devem ser realizados sob condições apropriadas de nível de biossegurança dois.