Name: Cultivar e Manter Clostridium difficile Em um ambiente anaeróbico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-14T21:25:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprenda a isolar, cultivar e manter Clostridium difficile em ambiente anaeróbico usando câmara de vinil. Este método permite preparar estoques de glicerol e esporos para pesquisas em microbiologia e resistência antibiótica.

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Gostaríamos de agradecer a Coy Laboratories por gentilmente fornecer imagens da câmara de anaerobiose. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health DK087763 concessão (SMM) e um Curriculum STEP / HHMI Desenvolvimento da Irmandade (ANE).

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<li>Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cycloserine-cefoxitin-fructose+agar+%28CCFA%29+and+taurocholate-CCFA+for+recovery+of+Clostridium+difficile+during+surveillance+of+hospitalized+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).</li>
<li>Marler, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+cultural+procedures+for+isolation+of+Clostridium+difficile+from+stools%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools.</a> J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).</li>
<li>Sorg, J. A., Dineen, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Clostridium difficile.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1(2009).</li>
<li>Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of Clostridium difficile.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2(2011).</li>
<li>Lemee, L., Pons, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilocus+sequence+typing+for+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multilocus sequence typing for Clostridium difficile.</a> Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).</li>
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<li>Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpoIVA+and+SipL+are+Clostridium+difficile+spore+morphogenetic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins.</a> J. Bacteriol. , (2013).</li>
<li>Burns, D. A., Minton, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+studies+in+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sporulation studies in Clostridium difficile.</a> J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).</li>
<li>Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clospore%3A+a+liquid+medium+for+producing+high+titers+of+semi-purified+spores+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile.</a> J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).</li>
<li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+the+initiation+of+Clostridium+difficile+spore+germination+using+analogs+of+chenodeoxycholic+acid%2C+a+bile+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid.</a> J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).</li>
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<li>Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+recovery+of+Clostridium+difficile+from+an+environmental+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface.</a> J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).</li>
<li>Koch, C. J., Kruuv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+release+of+oxygen+from+polystyrene+Petri+dishes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Radiol%22%5BJournal%5D)">The release of oxygen from polystyrene Petri dishes.</a> Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).</li>
<li>Ethapa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+modulate+biofilm+formation+by+the+anaerobic+pathogen+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile.</a> J. Bacteriol. , (2012).</li>
<li>Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anaerobic cell culture.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F(2009).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os métodos descritos aqui permitir a recuperação simples e rápida de C. difficile a partir de uma variedade de amostras fecais, incluindo seres humanos, ratos e hamsters, bem como o armazenamento a longo prazo de C. difficile como ações de glicerol ou de esporos. C. difficile pode ser um organismo difíceis de cultivar, mas a manutenção cuidadosa de um ambiente anaeróbico e a aplicação de técnicas de assepsia pode proporcionar para um crescimento robusto e uma redução na contaminação. <p cl...

Clostridium difficile é uma bactéria formadora de esporos, Gram-positiva que é um anaeróbio obrigatório e um agente patogénico gastrointestinal potencialmente fatal dos seres humanos e animais. Inicialmente descrita em 1935 como um organismo comensal encontrada em amostras de fezes de recém-nascidos 1, C. difficile foi mais tarde demonstrado ser o agente causador de colite pseudomembranosa associada ao tratamento com antibióticos 2. C. infecções difficile (CDI) são tipicamente precedido por tratamento com antibióticos, que resulta na interrupção da flora do cólon normais, criando um nicho para C. difficile prosperar 2. C. difficile é transmitida como um esporo dormente através da via fecal-oral e, posteriormente, germina no interior do trato gastrintestinal, produzindo células vegetativas capazes de gerar diversas toxinas e causar doença grave e colite 3. CDI são muitas vezes refractária aos tratamentos convencionais e estes emperfeições são freqüentemente recorrentes 4. Como resultado, o CDI é responsável por até US $ 4,8 bilhões em custos de saúde nos Estados Unidos 5-7. O C. difficile é muito sensível mesmo a baixos níveis de oxigénio no ambiente. Para C. difficile a persistir no meio ambiente e ser eficientemente transmitida de um hospedeiro para outro, a formação de um esporo metabolicamente inativas é fundamental 8. Porque a manutenção de laboratório e manipulação de C. difficile requer um ambiente anaeróbio controlada, estas técnicas requerem a utilização de uma câmara anaeróbica. O uso de câmaras anaeróbias resultou num aumento da recuperação e isolamento de anaeróbios obrigatórios 9-11, e permitiu que um número de técnicas de biologia molecular para ser realizado em uma atmosfera anaeróbia. Além C. difficile, o uso da câmara anaeróbia e manutenção descritas aqui são aplicáveispara outros anaeróbios obrigatórios, como outras espécies Clostridium (por exemplo, C. perfringens), outras espécies gastrointestinais (por exemplo, espécies de Bacteroides 12) e patógenos periodontais (por exemplo, espécies Peptostreptococcos 13).

<table><tbody><tr><td>Peptona de proteose nº 2</td><td>BD</td><td>212120</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>BP362</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S27</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (anidro)</td><td>Fisher</td><td>M65</td><td></td></tr><tr><td>...-Frutose</td><td>Fisher</td><td>L96</td><td></td></tr><tr><td>Taurocolato de sódio</td><td>Sigma</td><td>T4009</td><td></td></tr><tr><td>Cicloserina</td><td>Sigma</td><td>C6880</td><td></td></tr><tr><td>Cefoxitina</td><td>Fluka</td><td>C4786</td><td></td></tr><tr><td>Meio de infusão de coração cerebral</td><td>BD</td><td>237300</td><td></td></tr><tr><td>Peptona de Proteose BD</td><td></td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptona</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>Ágar sangue de ovelha colombiano</td><td>Fisher</td><td>L21928</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S27</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP2291</td><td></td></tr><tr><td>Alças de inoculação estéreis</td><td>Fisher</td><td>22363596</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes estéreis</td><td>Câmara</td> anaeróbica de vinil Fisher <td>1495990</td><td></td></tr><tr><td>Coy e acessórios</td><td>Coy Laboratory Products, Inc</td><td>Especificado pelo cliente</td><td>Esses itens são encomendados de acordo com as necessidades</td></tr><tr> do laboratório<td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td colspan="4">TCCFA ágar Peptona de proteose nº 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anidro) 0,1 g Frutose 6 g Ágar 20 g Levar a 1 L com água deionizada e autoclave a 121 &graus; C por 20 min para esterilizar. Após a autoclavagem, adicionar: 10 ml de taurocolato de sódio a 10% (p/v), esterilizado por filtro (dissolver em água; concentração final, 0,1%) 25 ml de 10 mg/ml de á'...-cicloserina, esterilizado por filtro (dissolver em água; concentração final, 250 &mu; g/ml) 1,6 ml de cefoxitina 10 mg/ml, esterilizado por filtro (dissolver em água; concentração final, 16 &mu; g/ml) BHIS Médio Infusão de coração cerebral 37 g Extrato de levedura 5 g Para pratos, adicione 15 g de ágar. Leve a 1 L com água deionizada e autoclave a 121 &graus; C por 20 min para esterilizar. Opcional (adicionar após autoclavagem): 3 ml de L-cisteína a 10% (p/v) (dissolver em água; concentração final, 0,03%) 10 ml de taurocolato de sódio a 10% (p/v) (dissolver em água; concentração final, 0,1%) <forte>Meio de esporulação SMC BactoPeptona 90 g Peptona de protease 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1,5 g Ágar 15 g Leve a 1 L com água deionizada e autoclave a 121 &deg; C por 20 min para esterilizar. Opcional (adicionar após autoclavagem): 3 ml de L-cisteína a 10% (p/v) (dissolver em água; concentração final, 0,03%) 70:30 Médio BactoPeptona 63 g Peptona protease 3,5 g Infusão cérebro coração 11,1 g Extrato de levedura 1,5 g (NH4)2SO4 0,7 g Tris base 1,06 g Para pratos, adicione 15 g de ágar. Leve a 1 L com água deionizada e autoclave a 121 &graus; C por 20 min para esterilizar. Após a autoclavagem, adicione 3 ml de L-cisteína a 10% (p/v) (concentração final, 0,03%). ágar sangue Recomenda-se o uso de placas de ágar sangue de ovelha anaeróbicas Columbia pré-fabricadas (Fisher Scientific, L21928)35. 1X Solução salina tamponada com fosfato (PBS) NaCl 8,01 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,44 g KH2PO4 0,27 g Leve a 1 L com água deionizada e ajuste o pH para 7,4 com HCl. Filtrar esterilize antes de usar.</td></tr></tbody></table>

cultivar e manter<em&gt; clostridium difficile</em&gt; em um ambiente anaeróbico

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile é um, anaeróbico, esporogênico bactéria Gram-positiva que é a principal responsável pela diarreia associada a antibióticos (DAA) e é um agente patogénico nosocomial significativa. C. difficile é notoriamente difícil de isolar e cultivar e é extremamente sensível ao mesmo níveis baixos de oxigênio no ambiente. Aqui, os métodos para isolar C. difficile em amostras de fezes e subsequentemente cultura C. difficile para a preparação de ações de glicerol para o armazenamento de longo prazo são apresentados. As técnicas para a preparação e enumerando estoques de esporos em laboratório para uma variedade de aplicações a jusante, incluindo estudos de microscopia e animais, também são descritos. Essas técnicas necessitam de uma câmara de anaerobiose, que mantém um ambiente anaeróbico consistente para assegurar condições adequadas para melhor C. crescimento difficile. Nós fornecemos protocolos para a transferência de materiais dentro e fora da câmara sem causando contaminação significativa de oxigênio, juntamente com sugestões para a manutenção regular necessária para sustentar o ambiente anaeróbico adequado para eficiente e consistente C. cultivo difficile.

Um exemplo de C. difficile cultivadas em BHIS e Columbia anaeróbio ovelhas meios de agar de sangue pode ser visto na Figura 2. C. difficile forma colônias irregulares que são planas e possuem uma aparência de vidro fosco que é evidente em ambos os meios. Aqui, um isolado clínico sensível à eritromicina de C. difficile, 630E 30, é cultivada em BHIS agar, num meio não-selectivo enriquecido, durante 24 horas a 37 ° C (Figura 2A). As colónias no ágar Co...

Clostridium difficile é uma bactéria patogênica que é um anaeróbio estrito e causa diarreia associada a antibióticos (DAA). Aqui, os métodos para o isolamento, a cultura e manter C. As células vegetativas difficile e esporos são descritos. Essas técnicas necessitam de uma câmara de anaerobiose, o que requer uma manutenção regular para garantir condições adequadas para melhor C. cultivo difficile.

Cultivar e Manter<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Em um ambiente anaeróbico

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar C. difficile de amostras fecais para cultivar C. difficile, preparar estoques de glicerol para armazenamento de longo prazo e preparar e enumerar estoques de esporos para diversas aplicações posteriores. Isso é realizado primeiramente isolando C. difficile de amostras de fezes por meio de plaqueamento em meio seletivo. O segundo passo consiste em cultivar C. difficile em meio líquido e manter estoques de longo prazo de C. difficile em glicerol.Em seguida, C difficile é recuperado de estoques congelados em glicerol e estriado em placas de ágar. Na etapa final, são preparados estoques de esporos de C difficile e enumerados, por fim, seguindo estes protocolos. C difficile pode ser cultivado em diversos meios para verificar e confirmar sua identidade, além de ser cultivado e mantido com sucesso.Esses colos de glicerol e culturas podem ser utilizados posteriormente em inúmeras aplicações downstream, incluindo estudos com animais e estudos adicionais de biologia molecular. A principal vantagem do uso de uma câmara anaeróbica de vinil para o cultivo de c difficile em comparação com outros métodos, como o uso de potes com vela, é que um ambiente

culturing-maintaining-clostridium-difficile-an-anaerobic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Li, J., et. al., Desenvolvimento de um modelo de infecção larval de peixe-zebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o isolamento e a cultura da bactéria Clostridioides difficile do intestino de larvas de peixe-zebra. O intestino infectado é dissecado, homogeneizado e incubado em meio anaeróbico seletivo contendo antibióticos. Essas condições suprimem micróbios concorrentes e promovem o crescimento de células viáveis.

Isolamento e Cultura de Bactérias Clostridioides difficile do Intestino Larval de Peixe-Zebra

Fonte: Anwar, Z., et al. Enriquecimento e detecção de toxinotipos de Clostridium perfringens em amostras de alimentos para varejo. J. Vis. Exp. (2019).Neste vídeo, bactérias redutoras de sulfito são cultivadas em um meio de ágar contendo sulfito, onde crescem anaeróbia e reduzem sulfito a sulfeto de hidrogênio, formando precipitados pretos com íons de ferro. As colônias negras são isoladas da profundidade do ágar usando técnicas assépticas e transferidas para meio fresco para incubação...

Subcultura de bactérias anaeróbicas redutoras de sulfito de uma cultura de ágar

Este protocolo descreve o modelo do rato cefoperazona de infecção por Clostridium difficile (CDI), utilizando uma estirpe clinicamente relevante e geneticamente-tratável, R20291. Ênfase na monitorização clínica da doença, C. difficile enumeração bacteriana, a citotoxicidade de toxinas, e alterações histopatológicas em todo CDI em um modelo de rato estão detalhadas no protocolo.

tratados com Cefoperazone Rato Modelo de clinicamente relevante<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 Strain

A eficácia dos antibióticos é mais comumente determinada pela realização de estudos cinéticos de morte e medição de unidades formadoras de colônias (UFCs). Ao integrar a microscopia eletrônica de varredura (MEV) com esses métodos padrão, podemos distinguir os efeitos farmacológicos do tratamento entre diferentes antibióticos.

Protocolo para Caracterizar as Alterações Morfológicas<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Em resposta ao tratamento antibiótico

Como os organismos anaeróbios obrigam são incapazes de crescer em cima da exposição de oxigênio, o uso de técnicas de cultivo anaeróbicos é indispensável. Aqui, demonstramos um método simples e efetivo para cultivar uma cultura mista derivada de uma usina de biogás a partir da preparação de mídia para o gás e quantificação de ácidos graxos voláteis.

Preparação média para o cultivo de microrganismos condições estritamente anaeróbicas/anóxicas

O foco deste artigo é detalhar as melhores práticas para a fabricação de meios para microrganismos anaeróbios fastidiosos adquiridos de um ambiente. Esses métodos ajudam a gerenciar culturas anaeróbias e podem ser aplicados para apoiar o crescimento de microrganismos indescritíveis não cultivados, a "matéria escura microbiana".

Um conjunto de formatos de meios simulados informados in situ para cultivo de microrganismos anaeróbios ambientalmente adquiridos

O protocolo apresenta duas metodologias para melhorar o isolamento de bactérias anaeróbias intestinais. O primeiro se concentra no isolamento de uma gama diversificada de bactérias usando diferentes meios de cultura. O segundo enfoca as etapas de cultivo de um grupo microbiano específico, possivelmente assimilando o mio-inositol, para compreender completamente seu significado ecológico.

Estratégias para melhorar o cultivo de bactérias anaeróbicas do trato gastrointestinal de frango

Nós delinear métodos para a rápida e eficiente isolamento / cultura da microglia viável a partir do córtex cerebral neonatal e adulto medula espinhal. A dissecção e revestimento de microglia cortical pode ser realizado dentro de 90 minutos, com a colheita da microglia subseqüente ocorrendo ~ 10 dias após a dissecção inicial.

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Descrevemos aqui um simples fluorescência de hibridação in situ (FISH), o método para a localização de vírus e bactérias, em tecidos de plantas e de insectos. Este protocolo pode ser estendido para a visualização de mRNA em toda montagem e cortes microscópicos.

Fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizações (FISH) para a localização de vírus e bactérias Endosymbiotic em Plant e Insect Tecidos

Neste protocolo, descrevemos métodos para transfectar eficientemente linhagens celulares de macrófagos murinos com siRNAs usando o Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, estimular os macrófagos com lipopolissacarídeo e monitorar os efeitos na produção de citocinas inflamatórias.

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

Aprenda a isolar, cultivar e manter Clostridium difficile em ambiente anaeróbico usando câmara de vinil. Este método permite preparar estoques de glicerol e esporos para pesquisas em microbiologia e resistência antibiótica.

Cultivar e Manter

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