Name: Estudo das interacções de Staphylococcus aureus Com neutrófilos por citometria de fluxo e Time Lapse Microscopy (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprenda a estudar a ativação de neutrófilos humanos por PSMs de Staphylococcus aureus usando citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Este método permite analisar respostas imunes in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"&gt; RN foi parcialmente financiado por uma Marie Curie Europeia concede Re-integração (ERG) do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia, número do projeto 268324.</p&gt;

1. Isolamento dos PMNs a partir de sangue humano por centrifugação de densidade <ol><li> Desenhe 5 9 tubos ml de sangue venoso heparinizado. </li><li> Preparar gradientes de Ficoll dupla camada (4 gradientes para 5 tubos de sangue) do seguinte modo: 12 ml de Despeje a g / ml de solução de 1,119 densidade Ficoll num tubo de 50 ml e cuidadosamente camada de 10 ml de uma g / ml de solução de densidade Ficoll 1.077 no topo. </li><li> Dilui-se o sangue com um volume igual de PBS. </li><li> Camada do sangue diluído cuidadosamente sobre o gradiente de Ficoll de dupla camada; 20-25 ml por gradiente. </li><li> Centrifugar 20 min a 396 x g num rotor de balde oscilante, 22 ° C sem travagem. </li><li> Prepara RPMI frio contendo 0,05% de Albumina de Soro Humano (RPMI-HSA). Também preparar 9 ml estéril deionizada H 2 O. Pré-cool tanto o meio RPMI e H2O em gelo. </li><li> Aspirar a camada de Ficoll topo contendo plasma (de cor amarela) e PBMC, e a segunda camada de Ficoll (cor branca) com a utilização de uma bomba de vácuo (colocar uma ponta de pipeta esterilizada ema pipeta). </li><li> Recolha as PMNs em tubos de 50 ml, utilizando uma pequena pipeta de plástico (1 tubo para as frações PMN de cada 2 gradientes), e colocá-los no gelo. </li><li> Adicionar RPMI-HSA fria até um volume total de 50 ml e centrifugar durante 10 minutos a 249 xg, a 4 ° C. </li><li> Tira-se o sobrenadante com o uso de uma bomba de vácuo e do vortex suavemente o sedimento (eritrócitos e PMN). </li><li> Adicionar 9 ml deionizada estéril H 2 O e iniciar o temporizador. Parar o choque osmótico hiper após 30 seg exatamente, adicionando 1 ml 10 vezes concentrado PBS. Nota: a 30 segundos são muito críticas. </li><li> Adicionar RPMI-HSA fria até um volume total de 50 ml e centrifugar durante 10 minutos a 249 xg, a 4 ° C. </li><li> Tira-se o sobrenadante com o uso de uma bomba de vácuo e recolher o sedimento em 1 PMN tubo com um volume definido (1-2 ml) RPMI-HSA. </li><li> Determinar a quantidade de células e ajustar a concentração de 1,10 a 7 células / ml. Dependendo do dador, o rendimento isolado de PMN estarão entre nípt 5 x 10 6 e 3 x 10 7 PMNs de cada 9 ml tubo de sangue </li></ol> 2. Por citometria de fluxo para avaliação da mobilização de cálcio em PMNs humanos <ol><li> As células de carga (5 x 10 6 células / ml) com 2 uM Fluo-3-AM em RPMI-HSA e incubar durante 20 min à temperatura ambiente lentamente de balanço, utilizando, por exemplo, um agitador de plataforma oscilante, protegido da luz. </li><li> Entretanto preparar uma diluição em série (por exemplo, 3 vezes) do estímulo a 10x a concentração final. PSMα3 é usado neste protocolo, no entanto qualquer estímulo GPCR, que actua sobre os neutrófilos é adequado. </li><li> Prepara 10x concentrado inibidor do receptor em RPMI-HSA. Quando o inibidor actua no estímulo (eg HDL em PSMα3) pré-incubado 25 ul estímulo com um volume igual de inibidor, durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Lave as células por adição de 10 ml de RPMI-HSA e centrifugar durante 249 xg à temperatura ambiente. Suspenda as células a 5 x10 6 células / ml. </li><li> Imediatamente antes do ensaio, diluir as células a 2x10 6 células / ml em RPMI-HSA e adicionar 200 ul por tubo de células FACS. PMNs diluído são muito frágeis. Mantê-los por muito tempo a esta concentração levará à auto-ativação, o mesmo vale para agitar vigorosa ou pipetagem. </li><li> Fixe o tubo com o citômetro de fluxo, espere 3 segundos e começar a aquisição. Depois de um período de tempo fixo (por exemplo, 8 sec), tire o tubo e adicionar rapidamente 50 mL de estímulo à amostra. Imediatamente voltar a ligar o tubo no suporte da amostra e continuar a aquisição. </li><li> Comece com o menor e terminam com a maior concentração de estímulo. Lava-se a agulha de citómetro de fluxo regularmente após cada ensaio com RPMI-HSA. </li><li> Analisar os dados com software de análise de citometria de fluxo. Comparar o sinal de fluorescência média, antes da adição do estímulo para que, após a adição do estímulo e usar os controlos positivos e negativos adequados para calcular a corrente alternadavação força medida para cada diluição. </li></ol> Alternativamente, quando o inibidor actua sobre os receptores pré-incubar as células com o inibidor. 3. A análise por microscopia de fluorescência de expressão de GFP bactérias após fagocitose por PMNs <ol><li> Crescer S. estirpes de Staphylococcus que contêm uma construção repórter de interesse durante a noite em caldo (com antibióticos quando necessário para manter o plasmídeo repórter). Neste caso MW2 estirpe contendo uma construção repórter da GFP é utilizado 10 PSMα, cultivadas em um tubo de plástico de 50 ml com 5 ml de meio de cultura LB. </li><li> Para remover toda a GFP a partir de O / N expressão, dilui-se as culturas a DO660 de 0,01 e crescer a DO660 de 0,1. Redilute esta cultura 1:30, e monitorar o crescimento até a cultura atingir uma DO660 de 0,1. Recolher as bactérias por centrifugação e lavar uma vez em DPBS. Ressuspender em 1:10 do volume original para se obter uma DO 660 de 1,0 ou roughly 5.10 8 UFC / ml. </li><li> Misturar as bactérias (1,10 7 / ml) com PMN isoladas de fresco (1,10 6 / ml) em RPMI-HSA (proporção de 10:1) num microtubo de 1,5 mL e adicionar soro humano a uma concentração final de 10%. Agitar numa plataforma de agitação durante 10 min a 37 ° C para estimular a fagocitose. Diluir as PMNs carregados com bactérias para 5,10 5 PMN / ml e pipeta de 250 mL em um poço de oito bem compartimentado lamínula. </li><li> Imagem dos PMNs com bactérias em um microscópio. Um microscópio invertido equipado com uma objectiva de NA 40X/0.85 funciona bem e deverá ser encerrada em um ambiente escuro da câmara para manter o ambiente de forma estável, a 37 ° C. Adquirir imagens para uma série de posições pré-definidas utilizando a câmara a cada 5-10 min em ambos os campos luminosos e do canal de GFP para acompanhar a produção da GFP no tempo. </li></ol>

<ol><li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li>
<li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li>
<li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557(2010).</li>
<li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus%3A+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li>
<li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host & Microbe. 7, 463(2010).</li>
<li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+%28FPRL1%29+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+%28FPRL1+inhibitory+protein%29+that+inhibits+FPRL1+and+FPR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li>
<li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li>
<li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus%2C+a+bacterial+antiinflammatory+agent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606(2012).</li>
<li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination%3A+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409(2008).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , In Press (2013).</li>
<li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System%3A+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150(2008).</li>
<li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318(2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nos métodos aqui descritos alguns passos são muito crítico. Vamos destacar estes aqui. Para o isolamento dos neutrófilos, por centrifugação em gradiente de densidade é importante para não perturbar as camadas, durante ou após os passos de centrifugação. Quando a aspiração dos neutrófilos utilizando uma pipeta de plástico, certifique-se de não apertar o balão, enquanto na camada de células, tal como ejectar líquido irá perturbar as camadas. Além disso, inspecione visualmente o pellet de neutr...

Os neutrófilos (PMN) são fagócitos profissionais que desempenham um papel chave na resposta imune inata contra Staphylococcus aureus 1. A constante batalha entre o anfitrião eo micróbio levou a uma corrida armamentista de ambos. Recentemente, comunidade-associado (CA) das cepas de S. meticilina resistente aureus (MRSA) surgiram que parecem ser muito eficiente na neutralização de neutrófilos assassinato 2,3. Modulin produção excessiva solúvel fenol (PSMs) de MRSA-CA foi associada a uma maior virulência 4,5. Os neutrófilos humanos pode reconhecer estas PSMs através FPR2 que levam à activação deste acoplado à proteína G do receptor 6. Um dos primeiros eventos é a mobilização das reservas intracelulares de cálcio (Ca2 +). Ca 2 + actua como um mensageiro secundário para uma variedade de funções efectoras incluindo desgranulação de PMN e fagocitose 7. Portanto Ca2 + é um indicador muito sensível dacapacidade funcional dos PSMs para ativar PMNs. Para estudar os efeitos dos PSMs para os neutrófilos, os neutrófilos são isolados frescos e carregado com um corante que fluoresce na mobilização do cálcio. Numa experiência de citometria de fluxo, este rápido mobilização pode ser medido. Usando este método, é possível estudar os efeitos directos de componentes tóxicos e de outros para os neutrófilos, e determinar a concentração mais baixa à qual estes estão activas. Para nós, é uma ferramenta muito útil para estudar o efeito de muitas proteínas produzidas por S. aureus envolvidos na evasão imune, como FPR2 proteína inibidora (FLIPR) 8, FLIPR-like 7 e Quimiotaxia proteína inibidora de Staphylococcus aureus (CHIPS) 9. Todas estas proteínas foram mostradas para inibir a mobilização de cálcio no número de neutrófilos por ligação ao receptor que reconhece o agonista. Recentemente, o nosso grupo descrito que os PSMs estão funcionalmente inibida por lipoproteínas séricas 10 &lt;/ Sup&gt;. Estas lipoproteínas estão abundantemente presentes no sangue e no tecido humano, o que indica que os PSMs exercer a sua função, principalmente no meio intracelular. A disponibilidade do ensaio de mobilização do cálcio nos permitiu medir com precisão o efeito de lipoproteínas do soro sobre a activação dos neutrófilos por os PSMs, indicado pela inibição considerável por concentrações muito baixas de soro. Uma vez que os PSMs estão funcionalmente inibida por soro, a hipótese de que existe uma função importante para os PSMs como toxinas intracelulares. Por isso, procuraram determinar o papel de PSMs após a fagocitose. Para investigar a expressão dos PSMs no espaço intercelular, construímos fusões repórter do promotor do operão psmα para GFP. Quando essas cepas repórter de S. aureus foram fagocitados pelos neutrófilos, indução de expressão foi observado por microscopia de fluorescência de 10. Obviamente, esta technique permite o estudo da expressão de um grande número de genes em S. aureus ou outros agentes patogénicos depois de fagocitose. Uma vez que para S. aureus sobreviver no nicho intercelular é muito importante para superar o sistema imune inato 11 10 12, estudando o papel dos genes ativados neste nicho é altamente relevante para a compreensão de sua virulência.

<table><tbody><tr><td>Fluo-3,</td><td>AM Molecular Probes / Life Technologies</td><td>F-1241</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>densidade 1,077 g/ml</td></tr><tr><td>Histopaco</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>densidade 1,119 g/ml</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>52400-025</td><td>contém 25 mM HEPES e L-glutamina</td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 microscópio</td><td>Leica Microsystems, Holanda</td><td>TCS SP5</td><td>objetiva: HCX PL APO 40x/0,85 </td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>Muito importante que o tubo possa ser removido e substituído durante o processo de medição</td></tr></tbody></table>

estudo das interacções de<em&gt; staphylococcus aureus</em&gt; com neutrófilos por citometria de fluxo e time lapse microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Nós apresentamos métodos para estudar o efeito de modulins solúveis fenol (PSMs) e outras toxinas produzidas e secretadas por Staphylococcus aureus, nos neutrófilos. Para estudar os efeitos dos PSMs de neutrófilos nos isolar neutrófilos frescos utilizando centrifugação em gradiente de densidade. Estes neutrófilos são carregadas com um corante que fluoresce na mobilização do cálcio. A activação dos neutrófilos por PSMs inicia um aumento rápido e transitório na concentração de cálcio intracelular livre. Numa experiência de citometria de fluxo, este rápido mobilização pode ser medida por monitorização da fluorescência de um corante pré-carregada, que reage com o aumento da concentração de Ca2 + livre. Usando esse método, podemos determinar a concentração PSM necessário para ativar os neutrófilos, e medir os efeitos de inibidores específicos e gerais da ativação de neutrófilos. Para investigar a expressão dos PSMs no espaço intracelular, we foram construídas fusões repórter do promotor do operão PSMα para GFP. Quando essas cepas repórter de S. aureus são fagocitados pelos neutrófilos, a indução da expressão pode ser observada por meio de microscopia de fluorescência.

Citometria de fluxo para análise da mobilização de cálcio em PMNs humanos A incubação de neutrófilos com uma série de concentração de PSMα3 sintéticos, resultando em activação rápida medida pelo fluxo de cálcio, o que é mostrado por um aumento no sinal em FL-1. Pré-incubação de PSMα3 sintético com 0,01%, 0,1% ou 1% de soro humano inibiu significativamente a capacidade de provocar fluxos de cálcio (Figura 1). Análise da expressão da GFP em bactérias, ap...

Nós apresentamos métodos para estudar o efeito de PSMs e outras toxinas segregadas por<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Em neutrófilos utilizando citometria de fluxo e microscopia de fluorescência.

Estudo das interacções de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Com neutrófilos por citometria de fluxo e Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar os efeitos do fenol estafilocócico, modulina solúvel ou PSMs sobre neutrófilos humanos. Isso é alcançado primeiramente isolando neutrófilos do sangue humano para análise subsequente in vitro. Em seguida, os neutrófilos são carregados com corante fluorescente e misturados a uma série de concentrações de PSMs com e sem inibidores, ou então são deixados para fagocitar bactérias S. aureus contendo uma construção repórter GFP sob o promotor alfa de PSM.Por fim, a ativação dos neutrófilos pela estimulação com PSM pode ser monitorada por citometria de fluxo e pela expressão de GFP pelos bacterianos fagocitados. As bactérias podem ser analisadas por microscopia de fluorescência com este método. Você pode estudar os efeitos de estafilococos, fenil, soja, molinas ou neutrófilos.É claro que este método pode ser aplicado a muitos outros tipos celulares, estímulos e antagonistas. Tivemos pela primeira vez a ideia da parte de microscopia deste método ao discutir uma maneira de observar os efeitos dos PSMs dentro dos neutrófilos. Utilizar uma construção de expressão bacteriana de GFP e microscopia com lapso de tempo permite-nos fazer exatamente isso.Após coletar cinco tubos de sangue venoso heparinizado, despeje 12 mililitros de uma solução em fial com densidade de 1,119 gramas por mililitro em um tubo de 50 mililitros e, em seguida, sobreponha cuidadosamente 10 mililitros de uma solução FI call com densidade de 1,077 gramas por mililitro. Em seguida, dilua o sangue com um volume igual de PBS e sobreponha cuidadosamente 20 a 25 mililitros de sangue sobre cada gradiente dual de fi call. Centrifugue os gradientes por 20 minutos a 396 vezes G e 22 graus Celsius sem frear.Em seguida, utilize uma bomba de vácuo equipada com uma ponteira estéril para aspirar as camadas superior amarela de plasma e de PBMC. Depois, a terceira camada branca. Agora, use uma pipeta plástica pequena para transferir a fração de neutrófilos polimorfonucleares ou PMN de cada tubo para um novo tubo de 50 mililitros.Adicione a cada tubo 50 mililitros de PMI recém-preparado e pré-resfriado, suplementado com albumina sérica humana ou R-P-M-I-H-S-A, para atingir um volume total de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue as células, aspire o sobrenadante com uma bomba de vácuo e vortexe suavemente o pellet contendo eritrócitos vermelhos e PMN. A seguir, adicione nove mililitros de água estéril desionizada às células e inicie um cronômetro.Adicione exatamente 30 segundos. Adicione um mililitro de PBS 10 vezes concentrado para interromper o choque hiperosmótico. Em seguida, lave as células em um volume total de 50 mililitros de R-P-M-I-H-S-A frio.Após a remoção do sobrenadante, adicione um mililitro de R-P-M-I-H-S-A a cada palato, que agora está branco devido à lise dos eritrócitos. Em seguida, ressuspenso, suspenda por pipetagem e combine os pellets em um único tubo. Agora conte as células e ajuste a concentração para um vezes 10 à sétima células por mililitro.Agora, carregue cinco vezes 10 à sexta células por mililitro com dois micromolares de flu oh 3:00 AM em R-P-M-I-H-S-A. E cubra o tubo com folha de alumínio para protegê-lo da luz. Em seguida, incube as células por 20 minutos à temperatura ambiente sob agitação.Enquanto isso, prepare uma diluição serial triplicada do estímulo a 10 vezes a concentração final. Em seguida, pré-incube 30 microlitros do estímulo com volume igual de inibidor recém-preparado 10 vezes concentrado ou tampão por 10 minutos à temperatura ambiente. A seguir, lave as células em 10 mililitros de R-P-M-I-H-S-A e re-suspenda as células em R-P-M-I-H-S-A fresco a cinco vezes 10 à sexta células por mililitro.Imediatamente antes da análise de fluxo, dilua as células até duas vezes 10 à sexta células por mililitro em R-P-M-I-H-S-A e adicione 200 microlitros de células por tubo FACS. Tendo o cuidado de não ativar as células agitando ou pipetando, coloque o primeiro tubo no citômetro de fluxo. Aguarde três segundos e, em seguida, inicie a aquisição; após um período fixo, por exemplo, oito segundos, retire o tubo e adicione rapidamente 50 microlitros da diluição mais baixa do estímulo à amostra.Recarregue imediatamente o tubo e continue a aquisição. Quando uma série de diluições for concluída, lave a agulha do citômetro de fluxo com R-P-M-I-H-S-A fresco antes de medir uma nova série. Após a execução da última amostra, analise os dados com software de análise de citometria de fluxo para avaliar a expressão bacteriana de GFP.Após a fagocitose por PMN, cultive uma cepa S. ous contendo a construção do repórter de interesse durante a noite em caldo, removendo qualquer GFP expressa durante o cultivo noturno por meio da diluição das células para uma DO 660 de 0,01. Cultive a amostra até atingir uma DO 660 de 0,1. Dilua as células na proporção de 1 para 30 e, em seguida, monitore o crescimento até que a cultura alcance novamente uma DO 660 de 0,1.Em seguida, recolha as bactérias por centrifugação. Lave as células uma vez em DPBS e Resus. Suspenda a cultura.Adicione de um a 10 do volume original para obter uma DO600 de 1,0 ou aproximadamente cinco vezes 108 UFC por mililitro. Agora, misture as bactérias com o SNP recém-isolado em R-P-M-I-H-S-A numa proporção de 10 para um. Em seguida, adicione soro humano em pool até um volume final total de um décimo de soro humano em pool na solução celular.Estimule a fagocitose agitando a mistura celular por 10 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, dilua os neutrófilos carregados com bactérias até cinco vezes 10 à quinta células por mililitro e transfira 250 microlitros das células para cada poço de uma lâmina de fundo com oito poços. Por fim, visualize as células em um microscópio invertido equipado com uma objetiva de 40 x e inserido em uma câmara com ambiente escuro, adquirindo imagens em múltiplos locais nas câmaras da lâmina a cada cinco a 10 minutos, tanto no contraste de campo claro quanto no canal GFP, para acompanhar a produção bacteriana de GFP em tempo real. A incubação de neutrófilos com uma série de concentrações do PSM alfa três sintético resulta em uma ativação rápida e dependente da dose das células, conforme medido pelo fluxo de cálcio.A pré-incubação do peptídeo PSM alfa três com 0,01%, 0,1% ou 1% de soro humano inibiu significativamente a capacidade do estímulo de provocar uma resposta de cálcio. Novamente, de maneira dependente da dose, a 1% de soro, quase nenhuma ativação é visível nessas concentrações de PSM alfa três.Nestas imagens, são mostrados dois neutrófilos contendo bactérias fagocitadas que possuem uma construção relatora PSM alfa GFP. As bactérias começam a fluorescer cerca de uma hora após a fagocitose, indicando a expressão de GFP a partir do promotor PSM alfa. Bactérias fora dos neutrófilos não fluorescem, indicando que a expressão de PSM alfa é rapidamente ativada somente quando as bactérias são fagocitadas.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de sempre usar neutrófilos frescos para obter resultados ideais. Após assistir a este vídeo, espero que você tenha uma boa compreensão de como medir o fluxo de cálcio por citometria de fluxo e como medir a expressão gênica bacteriana no interior de células eucarióticas utilizando microscopia de fluorescência.

studying-interactions-staphylococcus-aureus-with-neutrophils-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este artigo primeiro descreve um procedimento para isolar células endoteliais humanas a partir de veias umbilicais e, em seguida, mostra como usar estas células para examinar transmigração de neutrófilos em condições de escoamento. Ao utilizar uma câmara de fluxo de baixo volume feita a partir de um polímero com as características ópticas do vidro, ao vivo de células imagem fluorescente de populações de células raras é também possível.

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para estudar a interação neutrófilo-biofilme. As bactérias patogênicas embutidas no biofilme e neutrófilos isolados foram marcadas usando marcadores fluorescentes, e a resposta imune pelos neutrófilos e a evasão da resposta imune pelas bactérias foram avaliadas usando um microscópio de fluorescência.

Um ensaio in vitro para estudar a interação entre neutrófilos e biofilme

O vídeo demonstra um método para investigar o impacto das células estromais no recrutamento de leucócitos. Em um modelo de câmara de fluxo de placas paralelas, citocinas pró-inflamatórias induzem a expressão de receptores de adesão pelas células endoteliais, facilitando o recrutamento e a migração de neutrófilos. A conversa cruzada entre células estromais e células endoteliais diminui o recrutamento de neutrófilos para as células endoteliais.

Uma investigação de fluxo in vitro do efeito das células estromais no recrutamento de leucócitos

Os leucócitos atravessam a monocamada endotelial utilizando o paracelular ou o percurso intracelular. Foi desenvolvido um ensaio simples para seguir a distribuição de juncional endógeno VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial de leucócitos sob fluxo fisiológico para discriminar entre as duas vias de transmigração.

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

A capacidade do endotélio inflamado para recrutar leucócitos do fluxo é regulado por células estromais mesenquimais. Descrevemos dois modelos in vitro que incorporam as células humanas primárias que podem ser utilizadas para avaliar o recrutamento de neutrófilos a partir do caudal e examinar o papel que as células estromais mesenquimatosas jogar na regulação neste processo.

Análise dos efeitos de células estromais no recrutamento de leucócitos de Fluxo

Este estudo descreve o monitoramento microscópico da adesão pneumococcus às cordas do fator von Willebrand produzidas na superfície de células endotélias primárias humanas diferenciadas estresse de cisalhamento em condições de fluxo definidas. Este protocolo pode ser estendido à visualização detalhada de estruturas celulares específicas e quantificação de bactérias aplicando procedimentos diferenciais de imunocoloração.

Infecção pneumocócica de células endotélias humanas primárias em fluxo constante

Este protocolo de imagem celular live-bacteria permite a visualização de interações entre múltiplas espécies bacterianas no nível de célula única ao longo do tempo. A imagem de lapso de tempo permite a observação de cada espécie bacteriana em monocultura ou cocultura para interrogar interações entre espécies em comunidades bacterianas multiespécies, incluindo motilidade e viabilidade celular individual.

Visualização cinética de interespécies interespécies unicelulares interespécies

O presente protocolo descreve o estudo das interações neutrófilo-biofilme. Os biofilmes de Staphylococcus aureus são estabelecidos in vitro e incubados com neutrófilos humanos derivados do sangue periférico. A resposta de explosão oxidativa dos neutrófilos é quantificada e a localização dos neutrófilos dentro do biofilme é determinada por microscopia.

Ensaios In vitro padronizados para visualizar e quantificar interações entre neutrófilos humanos e biofilmes de Staphylococcus aureus

Este protocolo descreve uma abordagem quantitativa para medir a autoagregação microbiana usando citometria de fluxo de imagem.

Citometria de fluxo de imagem para estudar a autoagregação microbiana

Neste manuscrito, fornecemos um protocolo abrangente para avaliar a sobrevida de antibióticos para Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, transformando plasmídeos em P. aeruginosa e S. aureus para criar cepas repórteres e visualizar variantes fenotípicas, como persistentes, por microscopia de epifluorescência de lapso de tempo.

Imagem de microscopia de epifluorescência de lapso de tempo de fenótipos heterogêneos de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus

Aprenda a estudar a ativação de neutrófilos humanos por PSMs de Staphylococcus aureus usando citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Este método permite analisar respostas imunes in vitro.

Estudo das interacções de

Explorar mais vídeos