Estudo das interacções de Staphylococcus aureus Com neutrófilos por citometria de fluxo e Time Lapse Microscopy

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar os efeitos do fenol estafilocócico, modlina solúvel ou PSMs em neutrófilos humanos. Isso é conseguido isolando primeiro os neutrófilos do sangue humano para análise in vitro subsequente. Em seguida, os neutrófilos são carregados com corante fluorescente e misturados com uma série de concentrações de PSMs com e sem inibidores, ou podem fagocitar bactérias S reus contendo uma construção repórter GFP promotora alfa de PSM.

Em última análise, a ativação dos neutrófilos pela estimulação do PSM pode ser monitorada por citometria de fluxo e a expressão de GFP pelo fagocitado. As bactérias podem ser analisadas por microscopia de fluorescência Por este método. Você pode estudar os efeitos de estafilococos, fenil, soja, molinas ou neutrófilos.

Claro, esse método pode ser aplicado a muitos outros tipos de células, estímulos e antagonistas. Tivemos a ideia da parte microscópica desse método ao discutir uma maneira de observar os efeitos dos PSMs dentro dos neutrófilos. O uso de uma construção de expressão de GFP bacteriana e microscopia de lapso de tempo nos permite fazer exatamente isso.

Depois de tirar cinco tubos de sangue venoso heparinizado, despeje 12 mililitros de uma solução de 1,119 gramas por mililitro de densidade em um tubo de 50 mililitros e, em seguida, sobreponha cuidadosamente 10 mililitros de uma solução de chamada FI de densidade de 1,077 gramas por mililitro. Em seguida, dilua o sangue com um volume igual de PBS e coloque 20 a 25 mililitros de sangue cuidadosamente em cada gradiente de chamada de camada dupla. Centrifugue os gradientes por 20 minutos a 396 vezes G e 22 graus Celsius sem quebrar.

Em seguida, use uma bomba de vácuo equipada com uma ponta de pipeta estéril para aspirar as camadas superiores de plasma amarelo e PBMC. E então a terceira camada branca. Agora use uma pequena pipeta de plástico para transferir o neutrófilo polimorfonuclear ou a fração PMN de cada tubo para um novo tubo de 50 mililitros.

Adicione pré-resfriado recém-preparado nosso PMI suplementado com albumina sérica humana ou RPM Em seguida, gire as células, aspire o sobrenadante com uma bomba de vácuo e votice suavemente o eritrócito vermelho e o PMN contendo pellet. Em seguida, adicione nove mililitros de água deionizada estéril às células e inicie um cronômetro.

Adicione exatamente 30 segundos. Adicione um mililitro de PBS concentrado 10 vezes para interromper o choque hiperosmótico. Em seguida, lave as células em um volume total de 50 mililitros de R-P-M-I-H-S-A frio.

Depois de remover o sobrenadante, adicione um mililitro de R-P-M-I-H-S-A a cada palato, que agora está branco devido à lise dos eritrócitos. Em seguida, resus, suspender por pipetagem e combinar os pellets em um tubo. Agora conte as células e ajuste a concentração para uma vez 10 elevado à sétima célula por mililitro.

Agora carregue cinco vezes 10 elevado à sexta célula por mililitro com dois micromolares de gripe oh 3:00 AM em R-P-M-I-H-S-A. E cubra o tubo com papel alumínio para protegê-lo da luz. Em seguida, incube as células por 20 minutos à temperatura sob agitação.

Enquanto isso, prepare uma diluição tripla em série do estímulo em 10 vezes a concentração final. Em seguida, pré-incube 30 microlitros do estímulo com um volume igual de inibidor ou tampão concentrado 10 vezes recém-preparado por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave as células em 10 mililitros de R-P-M-I-H-S-A e ressuspenda as células em R-P-M-I-H-S-A fresco em cinco vezes 10 elevado à sexta célula por mililitro.

Logo antes da análise de fluxo, dilua as células para duas vezes 10 elevado ao sexto por mililitro em R-P-M-I-H-S-A e adicione 200 microlitros de células por tubo de fax. Tomando cuidado para não ativar as células agitando ou pipetando, carregue o primeiro tubo no citômetro de fluxo. Aguarde três segundos e inicie a aquisição após um período de tempo fixo, por exemplo, oito segundos, retire o tubo e adicione rapidamente 50 microlitros da menor diluição do estímulo à amostra.

Recarregue imediatamente o tubo e continue a aquisição. Quando uma série de diluições estiver terminada, lavar a agulha do citómetro de fluxo com R-P-M-I-H-S-A nova antes de medir uma nova série. Depois de executar a última amostra, analise os dados com o software de análise de citometria de fluxo para analisar a expressão bacteriana de GFP.

Após a fagocitose de PMN crescer uma cepa S ous contendo a construção repórter de interesse durante a noite em caldo, remova qualquer GFP expressa durante a cultura durante a noite, diluindo as células para OD 6 60 0 0,01. Aumente a cultura para OD 6 60 0 0.1. Dilua as células de um a 30 e, em seguida, monitore o crescimento até que a cultura atinja novamente um OD seis 60 de 0,1.

Em seguida, colete as bactérias por centrifugação. Lave as células uma vez em DPBS e Resus. Suspenda a cultura.

Adicione um a 10 do volume original para obter uma OD seis 60 de 1,0 ou aproximadamente cinco vezes 10 elevado à oitava UFC por mililitro. Agora misture as bactérias com o PNS recém-isolado em R-P-M-I-H-S-A na proporção de 10 para um. Em seguida, adicione soro humano agrupado a um décimo volume final total de soro humano agrupado dentro da solução celular.

Estimule a fagocitose agitando a mistura celular por 10 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, dilua os PMNs carregados com bactérias em cinco vezes 10 elevado a quinta células por mililitro e transfira 250 microlitros das células para cada poço de uma lamínula de oito poços. Finalmente, a imagem das células em um microscópio invertido equipado com uma objetiva de 40 x e envolta em uma câmara de ambiente escuro e adquira imagens em vários locais nas câmaras de lamínula a cada cinco a 10 minutos no campo claro e no canal GFP para acompanhar a produção bacteriana de GFP em tempo real, incubando neutrófilos com uma série de concentrações de PSM sintético alfa três resulta em uma ativação rápida dependente da dose do células medidas pelo fluxo de cálcio.

A pré-incubação do peptídeo PSM alfa três com 0,01% 0,1% ou 1% de soro humano inibiu significativamente a capacidade do estímulo de provocar uma resposta de cálcio. Novamente de forma dependente da dose a 1% de soro. Quase nenhuma ativação é visível nessas concentrações de PSM alfa três.

Nessas imagens, dois neutrófilos contendo bactérias fagocitadas contendo uma construção repórter PSM alfa GFP são mostrados. As bactérias começam a fluorescer cerca de uma hora após a fagocitose, indicando a expressão de GFP do promotor PSM Alpha. As bactérias fora dos neutrófilos não fluorescem, indicando que a expressão do PSM alfa é rapidamente ativada apenas quando as bactérias são fagocitadas.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de sempre usar neutrófilos frescos para obter os melhores resultados. Depois de assistir a este vídeo, espero que você tenha uma boa compreensão de como medir o fluxo de cálcio por citometria de fluxo e como medir a expressão gênica bacteriana dentro de células eucarióticas usando microscopia de fluorescência.