Name: Registro eletrofisiológico simultâneo e imagem de cálcio de neurônios do núcleo supraquiasmático (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprenda a realizar registros eletrofisiológicos simultâneos e imagem de cálcio em neurônios do núcleo supraquiasmático usando patch clamp com bis-fura-2. Este método permite estudar a interação entre potencial de membrana e concentração intracelular de cálcio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O trabalho foi financiado por uma bolsa do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (GM096972).

1. Preparação de fatias cerebrais hipotalâmicas
<ol>
	<li>Obtenha, com antecedência, a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) para qualquer procedimento que envolva animais. Os procedimentos em animais descritos aqui são consistentes com as Diretrizes da AVMA para a Eutanásia de Animais de 2013 e foram aprovados antecipadamente pela Oregon Health & Science University IACUC.</li>
	<li>Prepare 500 ml do tampão de fatiamento sem o MgCl2 e CaCl2 (Tabela 1). Borbulhe a solução com 95% de O2 e 5% de CO2 à temperatura ambiente e adicione o MgCl2 e o CaCl2 enquanto continua a arejar. Ajuste a osmolaridade para 300 mOsm com sacarose. A osmolaridade é medida com um osmômetro de pressão de vapor.</li>
	<li>Prepare 1 L do meio de gravação sem o MgCl2 e CaCl2 (Tabela 2). Borbulhe a solução com 95% de O2 e 5% de CO2 e, em seguida, adicione o MgCl2 e o CaCl2 enquanto continua a arejar. Ajustar o pH para 7,2-7,4 com NaOH (10 N) e a osmolaridade para 300 mOsm com sacarose. A adição de tampão HEPES é opcional e foi usada para estabilizar ainda mais o pH.</li>
	<li>As soluções de fatiamento e registro podem ser armazenadas na geladeira por vários dias antes do uso.</li>
	<li>Prepare agarose a 3% e despeje em uma placa de Petri estéril (6 mm de profundidade) e leve à geladeira.</li>
	<li>Corte três cubos de agarose com cerca de 6 mm x 6 mm x 6 mm.</li>
	<li>Anestesiar profundamente um rato Sprague-Dawley de quatro a oito semanas com isoflurano. Teste a profundidade da anestesia. A profundidade da anestesia é considerada apropriada quando não há reflexo de retirada do membro posterior após pinçamento da almofada do pé. Uma vez devidamente anestesiado, o rato é sacrificado por decapitação rápida. </li>
	<li>Remova rapidamente o cérebro tomando cuidado para cortar os nervos ópticos primeiro, e coloque em uma solução de fatiamento gelada saturada com 5% de CO2 e 95% de O2 e deixe esfriar por 2-3 min.</li>
	<li>Apare o cérebro. Coloque o cérebro usando uma pinça em um papel de filtro circular umedecido (com solução para fatiar) colocado em uma placa de Petri de vidro apoiada no gelo.</li>
	<li>Corte o cérebro coronalmente para remover o cerebelo e o tronco cerebral restantes, depois o córtex rostral e os lados, para deixar um bloco de cérebro contendo o hipotálamo, preservando cuidadosamente o lado que contém o SCN, nervos ópticos e quiasma óptico.</li>
	<li>Espalhe uma fina camada de cola cianoacrílica grande o suficiente para prender o cérebro e os blocos de agarose em uma câmara de corte de micrótomo gelada, mas seca.</li>
	<li>Transfira o lado caudal do bloco cerebral gelado para baixo para a cola com o lado contendo o SCN posicionado para cortar primeiro com os nervos ópticos formando um "V" apontando para cima.</li>
	<li>Coloque os blocos de agarose nos outros 3 lados. Encha a câmara com tampão de corte gelado continuamente borbulhado com 5% de CO2 e 95% de O2. A cola cianoacrílica solidifica com a umidade que mantém o cérebro e os blocos de agarose no lugar.</li>
	<li>Corte fatias hipotalâmicas coronais (220-250 μm de espessura) contendo o SCN com o micrótomo da lâmina vibratória. Normalmente, uma fatia é escolhida onde o quiasma óptico tem cerca de 2-4 mm de diâmetro, aparecendo como uma faixa branca com SCN apenas dorsal aparecendo como duas pequenas "reentrâncias" no quiasma óptico em ambos os lados do3º ventrículo (Figura 1A).</li>
	<li>Coloque as fatias na câmara de registro (36 °C) montada no palco de um microscópio Leica DMLFS. A câmara é preenchida com solução de registro de fluxo contínuo (2 ml/min) aerada com 95% de O2 e 5% de CO2 e pré-aquecida com um aquecedor em linha.</li>
	<li>Realize registros de grampo de contato de células inteiras e imagens de cálcio em neurônios SCN 0,5-8 horas após a preparação da fatia.</li>
</ol>
2. Gravação de grampo de patch
<ol>
	<li>Prepare a solução de eletrodo (intracelular) na metade do volume final total de água.</li>
	<li>Ajustar a solução a pH 7,3 com KOH (1 N).</li>
	<li>Adicione a água restante. A osmolaridade final da solução deve estar na faixa de 280-290 mOsm.</li>
	<li>Passar a solução do eléctrodo através de um filtro de 0,2 μm, alíquota (0,5 ml) para tubos de microcentrífugas e conservar a -20 °C.</li>
	<li>Prepare a solução de estoque de sal hexapotássico bis-fura-2 da sonda de cálcio (10 mM) misturando 1 mg de sal hexapotássico bis-fura-2 com 99,29 μl de água filtrada de 0,2 μm.</li>
	<li>Alíquota em tubos separados (2-5 μl cada) e congelar (-20 °C).</li>
	<li>Descongelar uma alíquota da solução interna e a sonda de Ca2+ pouco antes da utilização. Adicionar 2 μl da solução-mãe bis-fura-2 a 400 μl da solução interna para obter uma concentração final de 50 μM da sonda de cálcio. Triturar brevemente para misturar as soluções. A concentração da sonda de cálcio (10-250 μM) varia dependendo do projeto experimental e do sistema de imagem. Observe que bis-fura-2 é composto por duas moléculas de fura-2 ligadas.</li>
	<li>Puxe os eletrodos de contato de células inteiras, em dois estágios, para um diâmetro de ponta externa de aproximadamente 1 μm e resistências de 7-10 MΩ quando preenchido com a solução intracelular.</li>
	<li>Encha o eletrodo com alguns μl da solução interna contendo a sonda de cálcio filtrada com um filtro de seringa de 4 mm (0,2 μm) para amostras de baixo volume por meio de um tubo Microfil.</li>
	<li>Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva ao eletrodo enquanto ele é guiado para dentro da câmara de gravação sob iluminação de luz vermelha enquanto é visualizado em um monitor de vídeo. </li>
	<li>Coloque o microeletrodo sobre o SCN usando uma objetiva de baixa potência (4X). O NSQ é identificado como as duas áreas translúcidas de cada lado do terceiro ventrículo e dorsal ao quiasma óptico (Figura 1A).</li>
	<li>Mude o microscópio para uma ampliação de alta potência (40X ou 63X). Sub-regiões do SCN e neurônios SCN individuais podem ser direcionados para registro em maior ampliação.</li>
	<li>Aplique uma leve pressão positiva no microeletrodo à medida que ele avança na superfície de um neurônio.</li>
	<li>Aplique uma leve pressão negativa no microeletrodo para formar uma vedação com resistências de 3-10 GΩ.</li>
	<li>Ajuste a tensão da membrana para -60 mV com o amplificador controlado com software de aquisição.</li>
	<li>Aplique pressão negativa adicional ao eletrodo para romper a membrana celular para o modo de célula inteira.</li>
	<li>Ao entrar no modo de célula inteira, o soma do neurônio SCN e os dendritos se enchem de sonda fluorescente.</li>
	<li>A tensão da membrana é medida no modo de pinça de corrente ou a corrente no modo de pinça de tensão enquanto os dados da imagem da sonda de cálcio estão sendo monitorados e armazenados (descritos abaixo). Veja as imagens adquiridas junto com um gráfico de dados de fluorescência de 340 nm/380 nm durante o experimento.</li>
</ol>
3. Medição de Ca2+ intracelular
<ol>
	<li>As medições quantitativas de Ca2+ são obtidas gravando um par de imagens excitando rapidamente o tecido com luz UV a 340 nm e 380 nm por meio de um monocronômetro com largura de banda de 10 nm e passado por um filtro óptico UG11 para restringir comprimentos de onda harmônicos acima de 400 nm, um DCLP dicróico de 400 nm e luz emitida através de um filtro de emissão de 510±40 nm.</li>
	<li>As imagens são adquiridas usando uma câmera CCD resfriada com tempo de aquisição e binning ajustados para minimizar o fotobranqueamento e maximizar a velocidade de gravação.</li>
	<li>O software de imagem quantitativa é usado para adquirir e exibir as imagens.</li>
	<li>Selecione as regiões de interesse da imagem inicial a serem convertidas em dados de unidade de intensidade de fluorescência relativa (ou seja, soma, dendrito, etc.). Selecione também uma região para medição da fluorescência de fundo (Figura 1B).</li>
	<li>Imagens brutas e dados ópticos quantificados são continuamente salvos durante o experimento. Após o experimento, as imagens salvas geralmente são reanalisadas quando mais tempo pode ser gasto para selecionar com mais precisão as regiões de interesse a serem quantificadas.</li>
	<li>Os dados podem ser apresentados como a concentração intracelular estimada de cálcio (Est[Ca, 2+]i). Para calculara concentração de cálcio, utiliza-se a razão (R) entre a luz emitida após a excitação e a subtracção de fundo a 340 nm, dividida por 380 nm, juntamente com a fluorescência máxima e mínima a 340 nm e 380 nm. A subtração de fundo e outros cálculos são realizados usando um software de análise de dados.</li>
	<li>Uma determinação in vitro da fluorescência máxima e mínima de bis-fura-2 pode ser realizada usando 10 mM de CaCl2 para condições ligadas a Ca2+ e 10 mM EGTA para condições livres de Ca2+. A constante de dissociação de Ca2+, Kd da sonda, é considerada 370 nM para bis-fura-2 (Invitrogen).</li>
</ol>

<ol><li>Bading, H., Ginty, D. D., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gene+expression+in+hippocampal+neurons+by+distinct+calcium+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of gene expression in hippocampal neurons by distinct calcium signaling pathways.</a> Science. 260, 181-186 (1993).</li>
<li>Ghosh, A., Ginty, D. D., Bading, H., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+gene+expression+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of gene expression in neuronal cells.</a> J. Neurobiol. 25, 294-303 (1994).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high+resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Higley, M. J., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+dendrites+and+spines%3A+practical+and+functional+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in dendrites and spines: practical and functional considerations.</a> Neuron. 59, 902-913 (2008).</li>
<li>Colwell, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+calcium+levels+in+cells+in+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of calcium levels in cells in the suprachiasmatic nucleus.</a> Eur. J. Neurosci. 12, 571-576 (2000).</li>
<li>Ikeda, M., Yoshioka, T., Allen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+circadian+changes+in+Ca2%2B+mobilization+mediated+by+GABAA+and+NMDA+receptors+in+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Developmental and circadian changes in Ca2+ mobilization mediated by GABAA and NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus.</a> Eur. J. Neurosci. 17, 58-70 (2003).</li>
<li>Irwin, R. P., Allen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+signaling+induces+divergent+neuronal+Ca2%2B+responses+in+the+suprachiasmatic+nucleus+network%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic signaling induces divergent neuronal Ca2+ responses in the suprachiasmatic nucleus network.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 1462-1475 (2009).</li>
<li>Berson, D. M., Dunn, F. A., Takao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+by+retinal+ganglion+cells+that+set+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phototransduction by retinal ganglion cells that set the circadian clock.</a> Science. 295, 1070-1073 (2002).</li>
<li>Hattar, S., Liao, H. W., Takao, M., Berson, D. M., Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-containing+retinal+ganglion+cells%3A+architecture%2C+projections%2C+and+intrinsic+photosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity.</a> Science. 295, 1065-1070 (2002).</li>
<li>Hartwick, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Evoked+Calcium+Responses+of+Isolated+Melanopsin-Expressing+Retinal+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-Evoked Calcium Responses of Isolated Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells.</a> J. Neurosci. 27, 13468-13480 (2007).</li>
<li>Castel, M., Belenky, M., Cohen, S., Ottersen, O. P., Storm-Mathisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-like+immunoreactivity+in+retinal+terminals+of+the+mouse+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate-like immunoreactivity in retinal terminals of the mouse suprachiasmatic nucleus.</a> Eur. J. Neurosci. 5, 368-381 (1993).</li>
<li>Card, J. P., Moore, R. Y. The organization of visual circuits influencing the circadian activity of the suprachiasmatic nucleus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCard%2C+JP+%22In+Suprachiasmatic+Nucleus+-+The+Mind%27s+Clock%22">In Suprachiasmatic Nucleus - The Mind's Clock</a>. Reppert, S. M., Klein, D. C., Moore, R. Y. , Oxford University Press. Oxford. 51-76 (1991).</li>
<li>Shigeyoshi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+resetting+of+a+mammalian+circadian+clock+is+associated+with+rapid+induction+of+the+mPer1+transcript%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Light-induced resetting of a mammalian circadian clock is associated with rapid induction of the mPer1 transcript.</a> Cell. 91, 1043-1053 (1997).</li>
<li>Albrecht, U., Sun, Z. S., Eichele, G., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+response+of+two+putative+mammalian+circadian+regulators%2C+mper1+and+mper2%2C+to+light%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A differential response of two putative mammalian circadian regulators, mper1 and mper2, to light.</a> Cell. 91, 1055-1064 (1997).</li>
<li>Yan, L., Silver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+induction+and+localization+of+mPer1+and+mPer2+during+advancing+and+delaying+phase+shifts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential induction and localization of mPer1 and mPer2 during advancing and delaying phase shifts.</a> Eur. J. Neurosci. 16, 1531-1540 (2002).</li>
<li>Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+the+mammalian+circadian+system%3A+Photic+entrainment%2C+circadian+pacemaker+mechanisms%2C+and+posttranslational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of the mammalian circadian system: Photic entrainment, circadian pacemaker mechanisms, and posttranslational regulation.</a> Annu. Rev. Genet. 34, 533-562 (2000).</li>
<li>Ding, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+the+biological+clock%3A+Mediation+of+nocturnal+circadian+shifts+by+glutamate+and+NO%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting the biological clock: Mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO.</a> Science. 266, 1713-1717 (1994).</li>
<li>Ding, J. M., Fairman, L. E., Hurst, W. J., Kuriashkina, L. R., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+the+biological+clock%3A+mediation+of+nocturnal+CREB+phosphorylation+via+light%2C+glutamate%2C+and+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Resetting the biological clock: mediation of nocturnal CREB phosphorylation via light, glutamate, and nitric oxide.</a> J. Neurosci. 17, 667-675 (1997).</li>
<li>Ding, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+ryanodine+receptor+mediates+light-induced+phase+delays+of+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A neuronal ryanodine receptor mediates light-induced phase delays of the circadian clock.</a> Nature. 394, 381-384 (1998).</li>
<li>Bollmann, J. H., Helmchen, F., Borst, J. G., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+Ca2%2B+influx+mediated+by+three+different+pathways+during+synaptic+transmission+at+a+calyx-type+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic Ca2+ influx mediated by three different pathways during synaptic transmission at a calyx-type synapse.</a> J. Neurosci. 18, 10409-10419 (1998).</li>
<li>Irwin, R. P., Allen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Response+to+Retinohypothalamic+Tract+Synaptic+Transmission+in+Suprachiasmatic+Nucleus+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium Response to Retinohypothalamic Tract Synaptic Transmission in Suprachiasmatic Nucleus Neurons.</a> J. Neurosci. 27, 11748-11757 (2007).</li>
<li>Smetters, D., Majewska, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+action+potentials+in+neuronal+populations+with+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting action potentials in neuronal populations with calcium imaging.</a> Methods. 18, 215-221 (1999).</li>
<li>Spruston, N., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforated+patch-clamp+analysis+of+the+passive+membrane+properties+of+three+classes+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Perforated patch-clamp analysis of the passive membrane properties of three classes of hippocampal neurons.</a> J. Neurophysiol. 67, 508-528 (1992).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).</li>
<li>Marty, A., Neher, E. Tight-seal whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarty%2C+A+%22Single-channel+recording%22">Single-channel recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. 2, Plenum Press. New York. 31-52 (1995).</li>
<li>Sarantopoulos, C., McCallum, J. B., Kwok, W. M., Hogan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-escin+diminishes+voltage-gated+calcium+current+rundown+in+perforated+patch-clamp+recordings+from+rat+primary+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Beta-escin diminishes voltage-gated calcium current rundown in perforated patch-clamp recordings from rat primary afferent neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 139, 61-68 (2004).</li>
<li>Hatae, J., Fujishiro, N., Kawata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+properties+of+fluorescence+dye+fura-2+with+various+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic properties of fluorescence dye fura-2 with various divalent cations.</a> Jap. J. Physiol. 46, 423-429 (1996).</li>
<li>Poenie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+intracellular+Fura-2+fluorescence+by+viscosity%3A+a+simple+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Alteration of intracellular Fura-2 fluorescence by viscosity: a simple correction.</a> Cell Calcium. 11, 85-91 (1990).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os métodos descritos acima fornecem uma ferramenta poderosa para registrar simultaneamente a ligação entre a atividade elétrica da membrana do neurônio e a concentração de cálcio intracelular. O método tem vários pontos fortes, pois combina dois métodos muito bem caracterizados - registro de grampo de adesivo de célula inteira e medição de cálcio intracelular usando corantes fluorescentes. Nossa abordagem é semelhante às descritas por outros pesquisadores6,23.
Vários iten...

Sabe-se que ocorrem alterações na expressão gênica nos neurônios como consequência da sinalização sináptica. A sinalização pelo neurotransmissor excitatório glutamato pode despolarizar o potencial da membrana neuronal, levando eventualmente à transcrição e tradução do gene1,2. A ativação de receptores ionotrópicos pelo glutamato permite que íons de cálcio extracelulares entrem na célula, que se acredita desempenhar um papel crítico como um segundo mensageiro na ativação da transcrição gênica. A avaliação da relação entre a atividade elétrica da membrana, como a frequência de disparo do potencial de ação, e as alterações da concentração de cálcio intracelular requer a combinação de dois métodos - clampeamento de adesivo de células inteiras e imagem quantitativa de sondas fluorescentes de cálcio3-5, permitindo que a relação seja estudada em neurônios individuais. A técnica de registro de célula única permite o registro da atividade de neurônios individuais em partes identificáveis do cérebro. A técnica de gravação de toda a célula permite que a tensão ou corrente da membrana seja controlada, permitindo a manipulação experimental de correntes específicas do canal iônico. O uso de micropipetas cheias de sondas fluorescentes de cálcio também garante que o neurônio esteja bem preenchido com sonda de cálcio. Essa técnica tem uma clara vantagem ao trabalhar com preparações de fatias de cérebro de preparações de fatias de adultos, uma vez que esses neurônios são particularmente difíceis de carregar usando as sondas permeáveis de células mais comuns e reduzem possíveis problemas de fluorescência de fundo6-8.
A luz é a principal maneira pela qual os mamíferos ajustam seu relógio circadiano, que está localizado no núcleo supraquiasmático hipotalâmico (SCN). A informação luminosa transduzida na retina é transmitida 9-11 através do trato retino-hipotalâmico (TRH), onde o glutamato é liberado no NSQ12,13. O glutamato abre os receptores ionotrópicos NMDA e AMPA localizados nos neurônios SCN, produzindo um influxo de cálcio e sódio e iniciando uma cascata de sinalização intracelular que, em última análise, leva à alteração da expressão de uma família de genes do relógio14-17 e mudanças na fase do relógio circadiano18-20. No entanto, o cálcio pode entrar nos neurônios diretamente por meio de receptores ionotrópicos de glutamato ou por meio da despolarização da membrana e ativação de canais de cálcio dependentes de voltagem (VDCC)21. Portanto, desenvolvemos um protocolo experimental para investigar a relação entre a concentração intracelular de cálcio e a atividade elétrica da membrana em neurônios do NSQ, como ocorre com o disparo do potencial de ação e a partir da entrada sináptica22.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&bull; H2O</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull; 2H2O</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>D-gluconato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato dipotássico sal di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>Guanosina 5&prime;-trifosfato tris sal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (ultrapuro)</td><td>Vida Tecnologias</td><td>15510-027</td><td>Gel poroso em placa de Petri estéril Camada de 6 mm de espessura</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5881</td><td></td></tr><tr><td>Bis-fura-2, sal hexapotássico</td><td>Invitrogen</td><td>B6810</td><td>Célula impermeável</td></tr><tr><td>Nome do equipamento Número de</td><td>catálogo</td><td>da empresa</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Micrótomo</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td>Fatiamento de tecido</td></tr><tr><td>Cola cianoacrílica (Roti-Coll1)</td><td>Carl Roth GmbH+Co</td><td>Art-Nr. 0258.1</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de microeletrodo</td><td>Narshige International USA</td><td>PP-83</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares de microeletrodo</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfil 34 g</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa</td><td>Corning</td><td>#431212</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Leica</td><td>DM LFS</td><td>Com objetivas 4X, 40X UV e 63X UV, e epifluorescência</td></tr><tr><td>Câmera CCD</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA ER</td><td>12 bit CCD</td></tr><tr><td>Fura-2 Filtro</td><td>Cube Chroma</td><td>71500A</td><td>Conjunto com filtro UG11</td></tr><tr><td>Policromado IV</td><td>Até Photonics GmBH</td><td></td><td>Monocronômetro</td></tr><tr><td>Óculos de segurança com bloqueio</td><td>ultravioleta Produtos ultravioleta Amplificador</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPC-9</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metafluor</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software de imagem</td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td>Software de aquisição de dados</td></tr><tr><td>Igor versão 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Electrophysiology & Ca2+ Análise de Dados</td></tr><tr><td>VAPRO 5520</td><td>Westcor</td><td></td><td>Osmômetro de pressão de vapor</td></tr></tbody></table>

registro eletrofisiológico simultâneo e imagem de cálcio de neurônios do núcleo supraquiasmático

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Métodos simultâneos de registro de imagens eletrofisiológicas e fluorescentes foram usados para estudar o papel das mudanças do potencial ou corrente da membrana na regulação da concentração intracelular de cálcio. Mudanças nas condições ambientais, como o ciclo claro-escuro, podem modificar a atividade neuronal e da rede neural e a expressão de uma família de genes do relógio circadiano dentro do núcleo supraquiasmático (SCN), a localização do relógio circadiano mestre no cérebro dos mamíferos. A transmissão sináptica excitatória leva a um aumento na concentração pós-sináptica de Ca2+, que se acredita ativar as vias de sinalização que alteram a expressão rítmica dos genes do relógio circadiano. Cortes hipotalâmicos contendo o NSQ foram clampeados com microeletrodos preenchidos com uma solução interna contendo o indicador de cálcio bis-fura-2. Depois que um selo foi formado entre o microeletrodo e a membrana neuronal do SCN, a membrana foi rompida usando sucção suave e a sonda de cálcio se difundiu no neurônio preenchendo o soma e os dendritos. Medidas raciométricas quantitativas da concentração de cálcio intracelular foram registradas simultaneamente com o potencial ou corrente de membrana. Usando esses métodos, é possível estudar o papel das mudanças na concentração de cálcio intracelular produzidas pela atividade sináptica e pelo potencial de ação disparado de neurônios individuais. Nesta apresentação, demonstramos os métodos para registrar simultaneamente a atividade eletrofisiológica junto com o cálcio intracelular de neurônios SCN individuais mantidos em fatias cerebrais.

Utilizando fatias cerebrais hipotalâmicas, registramos simultaneamente alterações no cálcio intracelular no modo de célula inteira sob condições de fixação de tensão e de fixação de corrente. O microeletrodo mostrado na Figura 1A é posicionado com ampliação elevada (objetivas UV de 40X ou 63X) aplicando-se uma pequena pressão positiva. Após tocar o neurônio, um selo gigohm é formado com sucção suave. No modo de fixação de tensão, após ajustar o potencial da membrana celular para -60 mV, uma sucção adicio...

Os procedimentos são descritos para realizar registros simultâneos do potencial ou corrente de membrana e alterações da concentração de cálcio intracelular. Os neurônios do núcleo supraquiasmático são preenchidos com o indicador de cálcio bis-fura-2 usando um eletrodo de patch clamp na configuração de patch clamp de célula inteira.

Registro eletrofisiológico simultâneo e imagem de cálcio de neurônios do núcleo supraquiasmático

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

O objetivo geral do experimento a seguir é examinar a interação entre mudanças na voltagem ou corrente, como mudanças na ação, frequência de disparo potencial e a concentração de cálcio intracelular em neurônios do núcleo supramático. Isso é conseguido preparando a fatia do cérebro para o registro dos neurônios do núcleo da SMA usando um microeletrodo preenchido com a sonda sensível ao cálcio. Como segunda etapa, o microeletrodo é selado com a membrana neuronal.Em seguida, a membrana neuronal selada com o microeletrodo é rompida para introduzir a sonda fluorescente de cálcio em neurônios individuais e para registrar junto com a membrana os resultados da atividade elétrica são obtidos que mostram medições de tensão ou corrente e imagens de fluorescência da sonda de cálcio em dois comprimentos de onda, alteração na proporção de fluorescência nesses comprimentos de onda reflete a mudança de cálcio intracelular dentro do neurônio. A análise subsequente pode ser realizada para determinar a concentração de cálcio da célula. A principal vantagem desta técnica é que as mudanças na atividade elétrica da membrana e no cálcio intracelular produzido pela ativação sináptica podem ser medidas simultaneamente em neurônios individuais do núcleo supracosmético.Demonstrando essa técnica estará meu colega Dr. Robert Irwin. Comece este procedimento colocando o cérebro do rato em um papel de filtro circular umedecido com solução de corte em uma placa de Petri de vidro, descansando no gelo, corte a coroa cerebral apenas para remover o cerebelo e o tronco encefálico e corte partes dos lados direito e esquerdo do córtex, deixando um bloco de cérebro contendo o hipotálamo e preservando cuidadosamente o lado ventral do cérebro contendo os nervos ópticos SCN e o quiasma óptico. Depois disso, espalhe uma fina camada de cola acrílica Sano, grande o suficiente para prender o cérebro e os blocos de aros em uma câmara de corte de micrótomo gelada.Transfira o bloco cerebral gelado para baixo para a cola com o lado contendo o SCN posicionado para cortar primeiro e os nervos ópticos formando um V apontando para cima coloque os blocos aros em três outros lados. Em seguida, encha a câmara com tampão de corte gelado e borbulhe continuamente com carbogênio. A cola acrílica Sano solidifica com a umidade e mantém os blocos cerebrais e aros no lugar.Em seguida, corte as fatias hipotalâmicas coronais contendo o SCN com espessura de 220 a 250 mícrons. Observe que o bloco aros esquerdo se soltou durante o corte. Isso pode acontecer se não for aplicada cola suficiente.Depois disso, identifique a fatia que contém o SCN. Normalmente, uma fatia é escolhida onde o quiasma óptico tem cerca de dois a quatro milímetros de diâmetro, aparecendo como uma faixa branca com o SCN apenas dorsal, aparecendo como duas pequenas reentrâncias no quiasma óptico em ambos os lados do terceiro ventrículo. Transfira uma fatia para a câmara de registro de 36 graus Celsius montada no palco de um microscópio.A câmara é preenchida com solução de gravação de fluxo contínuo a dois mililitros por minuto. Aerado com 95% de carbogênio e pré-aquecido com um aquecedor em linha. Identifique o SCN observando os dois núcleos translúcidos do SCN em ambos os lados do terceiro ventrículo, dorsal ao quiasma óptico que aparece como uma faixa preta quando iluminado pela luz transmitida.Para preparar o microeletrodo para registro, encha-o com a solução interna contendo a sonda de cálcio filtrada com um filtro de seringa de quatro milímetros por meio de um tubo de microenchimento. Em seguida, coloque o microeletrodo no suporte do microeletrodo. Em seguida, aplique uma pequena quantidade de pressão positiva contínua ao eletrodo.Abaixe o microeletrodo na câmara de gravação com a orientação da iluminação de luz vermelha. Em seguida, coloque o microeletrodo sobre o SCN usando uma objetiva de baixa potência. Depois disso, mude o microscópio para uma ampliação de alta potência para selecionar uma sub-região de SCN e um neurônio SCN individual.Continue a aplicar uma leve pressão positiva ao microeletrodo à medida que ele avança na superfície da célula. Uma vez na superfície, aplique uma leve pressão negativa para formar uma vedação com resistência de três a 10 giga ohms. Depois disso, ajuste a tensão da membrana para menos 60 milivolts.Em seguida, aplique pressão negativa adicional ao eletrodo para romper a membrana celular, a fim de formar o grampo de remendo de toda a célula. Ao entrar no modo de célula inteira, o soma e os dendritos do neurônio SCN serão preenchidos com a sonda fluorescente. Meça a tensão da membrana no modo de pinça de corrente ou a corrente no modo de pinça de tensão.Enquanto os dados da imagem da sonda de cálcio estão sendo monitorados e armazenados, as imagens adquiridas podem ser visualizadas junto com um gráfico de dados de fluorescência de 340 nanômetros e 380 nanômetros. Durante o experimento, um cronômetro mono é usado para obter as medições de cálcio quantitativamente, expondo rapidamente o SCN à luz ultravioleta. A 340 nanômetros e 380 nanômetros, a luz de excitação passa por um filtro óptico UG 11 para restringir comprimentos de onda harmônicos acima de 400 nanômetros e um espelho dicróico DCLP de 400 nanômetros reflete a luz no tecido.A luz emitida passa por um filtro de emissão de 510 nanômetros e é capturada pela câmera. Para analisar o resultado, selecione uma região de interesse da imagem inicial e uma região de fundo a ser convertida em unidades de intensidade de fluorescência relativa. Os dados da região de interesse são vistos em tempo real durante o experimento.O plano de fundo é usado posteriormente na análise de dados subsequente. Aqui está uma imagem de campo brilhante de uma fatia coronal do hipotálamo contendo o SCN e o quiasma óptico. Um microeletrodo de vidro preenchido com solução interna contendo BISRA dois é selado em um único neurônio.Aqui são mostradas as respostas de cálcio a uma série de 50 etapas de voltagem registradas a partir de um neurônio SCN pinçado por voltagem. As correntes de sódio dependentes de voltagem foram inibidas com TTX 0,5 micromolar, e esta é uma imagem de captura de tela das regiões somáticas e dendríticas de interesse correspondentes às respostas de cálcio. Estes são os exemplos de respostas de cálcio a um número variável de etapas de tensão.Esta figura mostra o registro simultâneo da voltagem da membrana e do cálcio intracelular. Em um neurônio SCN, o experimento de pinça de corrente foi realizado na presença de ritoxina 50 micromolar. Uma pequena despolarização do potencial de membrana desencadeou vários surtos de ação, disparo potencial com um aumento correspondente e subsequente queda de cálcio intracelular.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar fatias de cérebro de núcleo supracosmético saudáveis e realizar experimentos eletrofisiológicos e de imagem simultâneos. Não se esqueça de que trabalhar com luz ultravioleta pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar proteção adequada para os olhos devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.

simultaneous-electrophysiological-recording-calcium-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Gravação eletrofisiológica simultânea e imagem de cálcio dos neurônios do núcleo supraquiasmático

Nós desenvolvemos um método para ressonância magnética funcional simultânea e gravação eletrofisiológicas no cérebro de roedores, proporcionando uma plataforma para a investigação da relação entre a atividade neural e sinalizar o nível de oxigenação do sangue (BOLD) dependente de ressonância magnética.

FMRI simultânea e Eletrofisiologia no cérebro de roedores

De gravação simultânea de sinais de cálcio dos neurônios identificados e comportamento alimentar de Drosophila melanogaster</em

A compreensão da função do sistema nervoso central, dos vertebrados requer gravações de muitos neurónios porque a função cortical surge no nível de populações de neurónios. Aqui nós descrevemos um método óptico para registrar a atividade neural supraliminares com resolução de uma única célula e um único ponto, pontilhado de acesso aleatório de digitalização. Este método registra somáticas fluorescência sinais de cálcio de até 100 neurônios com alta resolução temporal. Um algoritmo de máxima...

A gravação ótica da atividade neural supraliminares com resolução de uma única célula e um único pico

A preparação de fatias cerebrais agudas de isolado hipocampo, assim como as gravações simultâneas electrofisiológicas de astrócitos e neurónios...

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Nós descrevemos a preparação de fatias finas de retina aquático salamandras tigre...

Gravações Whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio Retinal Slice Preparação

Gravações de longo prazo simultâneos extracelulares de duas neuropiles cerebrais diferentes ou dois setores anatômicas diferentes foram estabelecidos em abelhas. Essas gravações permitem a investigação de aspectos temporais de processamento neuronal em diferentes áreas do cérebro, no único neurônio, bem como a nível conjunto em um animal se comportar.

Gravações simultâneas de longo prazo em dois estágios de processamento neuronal em comportar abelhas

Este protocolo descreve um método simples para gravação simultânea de co localizada Eletroencefalografia (EEG) e multi-laminar local campo potencial em um rato anestesiado. Um orifício de trépano, perfurado o crânio para a inserção de um microeléctrodo é mostrado para produzir distorção negligenciável do sinal EEG.

Gravação simultânea de eletroencefalografia co localizada e potencial do campo Local em roedores

Este estudo apresenta um método para a gravação simultânea dos potenciais do campo local no cérebro, eletrocardiogramas, electromyograms e respirando os sinais de um rato andando livremente. Esta técnica, o que reduz custos experimentais e simplifica a análise de dados, irá contribuir para a compreensão das interacções entre o cérebro e os órgãos periféricos.

Gravações simultâneas de potenciais de campo corticais Local, eletrocardiograma, eletromiograma e respirar o ritmo de um rato andando livremente

As próteses retinianas têm a capacidade de gerar percepções visuais. Para avançar no desenvolvimento de novas próteses, são necessários métodos ex vivo para testar os dispositivos antes do implante. Este artigo fornece um protocolo abrangente para o estudo da atividade do cálcio na camada de células ganglionares da retina quando submetido à estimulação elétrica.

Imagem de cálcio em retinas planas eletricamente estimuladas

Esse protocolo fornece uma descrição abrangente de um método para o registro simultâneo de sinais de cálcio de neurônios e astrócitos em múltiplas regiões cerebrais relacionadas à memória e demonstra sua aplicação durante um paradigma de aprendizagem e comportamento da memória.

Um método de fotometria de fibra bicolorida para registrar a atividade dos neurônios dos astrócitos em múltiplas regiões cerebrais durante comportamentos de aprendizagem e memória

Aprenda a realizar registros eletrofisiológicos simultâneos e imagem de cálcio em neurônios do núcleo supraquiasmático usando patch clamp com bis-fura-2. Este método permite estudar a interação entre potencial de membrana e concentração intracelular de cálcio.

Registro eletrofisiológico simultâneo e imagem de cálcio de neurônios do núcleo supraquiasmático

Explorar mais vídeos