Registro eletrofisiológico simultâneo e imagem de cálcio de neurônios do núcleo supraquiasmático

O objetivo geral do experimento a seguir é examinar a interação entre mudanças na voltagem ou corrente, como mudanças na ação, frequência de disparo potencial e a concentração de cálcio intracelular em neurônios do núcleo supramático. Isso é conseguido preparando a fatia do cérebro para o registro dos neurônios do núcleo da SMA usando um microeletrodo preenchido com a sonda sensível ao cálcio. Como segunda etapa, o microeletrodo é selado com a membrana neuronal.

Em seguida, a membrana neuronal selada com o microeletrodo é rompida para introduzir a sonda fluorescente de cálcio em neurônios individuais e para registrar junto com a membrana os resultados da atividade elétrica são obtidos que mostram medições de tensão ou corrente e imagens de fluorescência da sonda de cálcio em dois comprimentos de onda, alteração na proporção de fluorescência nesses comprimentos de onda reflete a mudança de cálcio intracelular dentro do neurônio. A análise subsequente pode ser realizada para determinar a concentração de cálcio da célula. A principal vantagem desta técnica é que as mudanças na atividade elétrica da membrana e no cálcio intracelular produzido pela ativação sináptica podem ser medidas simultaneamente em neurônios individuais do núcleo supracosmético.

Demonstrando essa técnica estará meu colega Dr. Robert Irwin. Comece este procedimento colocando o cérebro do rato em um papel de filtro circular umedecido com solução de corte em uma placa de Petri de vidro, descansando no gelo, corte a coroa cerebral apenas para remover o cerebelo e o tronco encefálico e corte partes dos lados direito e esquerdo do córtex, deixando um bloco de cérebro contendo o hipotálamo e preservando cuidadosamente o lado ventral do cérebro contendo os nervos ópticos SCN e o quiasma óptico. Depois disso, espalhe uma fina camada de cola acrílica Sano, grande o suficiente para prender o cérebro e os blocos de aros em uma câmara de corte de micrótomo gelada.

Transfira o bloco cerebral gelado para baixo para a cola com o lado contendo o SCN posicionado para cortar primeiro e os nervos ópticos formando um V apontando para cima coloque os blocos aros em três outros lados. Em seguida, encha a câmara com tampão de corte gelado e borbulhe continuamente com carbogênio. A cola acrílica Sano solidifica com a umidade e mantém os blocos cerebrais e aros no lugar.

Em seguida, corte as fatias hipotalâmicas coronais contendo o SCN com espessura de 220 a 250 mícrons. Observe que o bloco aros esquerdo se soltou durante o corte. Isso pode acontecer se não for aplicada cola suficiente.

Depois disso, identifique a fatia que contém o SCN. Normalmente, uma fatia é escolhida onde o quiasma óptico tem cerca de dois a quatro milímetros de diâmetro, aparecendo como uma faixa branca com o SCN apenas dorsal, aparecendo como duas pequenas reentrâncias no quiasma óptico em ambos os lados do terceiro ventrículo. Transfira uma fatia para a câmara de registro de 36 graus Celsius montada no palco de um microscópio.

A câmara é preenchida com solução de gravação de fluxo contínuo a dois mililitros por minuto. Aerado com 95% de carbogênio e pré-aquecido com um aquecedor em linha. Identifique o SCN observando os dois núcleos translúcidos do SCN em ambos os lados do terceiro ventrículo, dorsal ao quiasma óptico que aparece como uma faixa preta quando iluminado pela luz transmitida.

Para preparar o microeletrodo para registro, encha-o com a solução interna contendo a sonda de cálcio filtrada com um filtro de seringa de quatro milímetros por meio de um tubo de microenchimento. Em seguida, coloque o microeletrodo no suporte do microeletrodo. Em seguida, aplique uma pequena quantidade de pressão positiva contínua ao eletrodo.

Abaixe o microeletrodo na câmara de gravação com a orientação da iluminação de luz vermelha. Em seguida, coloque o microeletrodo sobre o SCN usando uma objetiva de baixa potência. Depois disso, mude o microscópio para uma ampliação de alta potência para selecionar uma sub-região de SCN e um neurônio SCN individual.

Continue a aplicar uma leve pressão positiva ao microeletrodo à medida que ele avança na superfície da célula. Uma vez na superfície, aplique uma leve pressão negativa para formar uma vedação com resistência de três a 10 giga ohms. Depois disso, ajuste a tensão da membrana para menos 60 milivolts.

Em seguida, aplique pressão negativa adicional ao eletrodo para romper a membrana celular, a fim de formar o grampo de remendo de toda a célula. Ao entrar no modo de célula inteira, o soma e os dendritos do neurônio SCN serão preenchidos com a sonda fluorescente. Meça a tensão da membrana no modo de pinça de corrente ou a corrente no modo de pinça de tensão.

Enquanto os dados da imagem da sonda de cálcio estão sendo monitorados e armazenados, as imagens adquiridas podem ser visualizadas junto com um gráfico de dados de fluorescência de 340 nanômetros e 380 nanômetros. Durante o experimento, um cronômetro mono é usado para obter as medições de cálcio quantitativamente, expondo rapidamente o SCN à luz ultravioleta. A 340 nanômetros e 380 nanômetros, a luz de excitação passa por um filtro óptico UG 11 para restringir comprimentos de onda harmônicos acima de 400 nanômetros e um espelho dicróico DCLP de 400 nanômetros reflete a luz no tecido.

A luz emitida passa por um filtro de emissão de 510 nanômetros e é capturada pela câmera. Para analisar o resultado, selecione uma região de interesse da imagem inicial e uma região de fundo a ser convertida em unidades de intensidade de fluorescência relativa. Os dados da região de interesse são vistos em tempo real durante o experimento.

O plano de fundo é usado posteriormente na análise de dados subsequente. Aqui está uma imagem de campo brilhante de uma fatia coronal do hipotálamo contendo o SCN e o quiasma óptico. Um microeletrodo de vidro preenchido com solução interna contendo BISRA dois é selado em um único neurônio.

Aqui são mostradas as respostas de cálcio a uma série de 50 etapas de voltagem registradas a partir de um neurônio SCN pinçado por voltagem. As correntes de sódio dependentes de voltagem foram inibidas com TTX 0,5 micromolar, e esta é uma imagem de captura de tela das regiões somáticas e dendríticas de interesse correspondentes às respostas de cálcio. Estes são os exemplos de respostas de cálcio a um número variável de etapas de tensão.

Esta figura mostra o registro simultâneo da voltagem da membrana e do cálcio intracelular. Em um neurônio SCN, o experimento de pinça de corrente foi realizado na presença de ritoxina 50 micromolar. Uma pequena despolarização do potencial de membrana desencadeou vários surtos de ação, disparo potencial com um aumento correspondente e subsequente queda de cálcio intracelular.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar fatias de cérebro de núcleo supracosmético saudáveis e realizar experimentos eletrofisiológicos e de imagem simultâneos. Não se esqueça de que trabalhar com luz ultravioleta pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar proteção adequada para os olhos devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.