A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em Drosophila

O objetivo geral deste procedimento é quantificar as mudanças comportamentais desencadeadas pela privação alimentar na mosca adulta Salala Melanogaster. Isso é feito pelas primeiras moscas famintas por 18 a 24 horas. O segundo passo é carregar moscas individuais em câmaras de comportamento, cada uma contendo uma fonte de odor atraente em seu centro.

Em seguida, um sistema de computador com uma câmera digital rastreia a posição de cada voo ao longo do tempo e registra. Suas coordenadas para posterior análise dos dados. A etapa final é determinar a latência de cada mosca para atingir a fonte de odor usando um software personalizado.

Em última análise, este ensaio de comportamento de pesquisa de alimentos de alto rendimento pode ser usado para estudar a relação entre a função do circuito neural e as respostas comportamentais. A principal vantagem deste ensaio sobre o método existente, como os companheiros de equipe, é que ele quantifica o comportamento quimiotático em moscas individuais. Este método pode ajudar a responder a perguntas em neurobiologia, como quais circuitos neurológicos são importantes para o comportamento quimiotático e como esses circuitos neurológicos são moderados pelo estado fisiológico interno do animal.

O objetivo deste método é obter grandes conjuntos de dados de comportamento em um curto espaço de tempo. Embora esse método tenha nos dado insights sobre o comportamento de forrageamento, ele também pode ser usado para estudar outros comportamentos, como fazer localização. A demonstração visual desse método é crítica.

O manuseio adequado da mosca e a execução do software de computador são essenciais para o sucesso deste experimento. Geralmente, o indivíduo novo neste método pode ter um pouco de dificuldade no início, porque leva algum tempo e paciência para aprender a lidar com as moscas demonstrando suavemente que o procedimento será feito na agulha. Entre em contato com um técnico do meu laboratório antes da coleta de moscas.

Traseira, as moscas experimentais sob condições controladas de temperatura e umidade em um ciclo de luz escura de 12 horas. No dia da explosão da CEE, anestesiar as moscas sob dióxido de carbono antes de sexá-las ao microscópio. Vários critérios básicos podem ser usados para diferenciar entre homens e mulheres.

Os machos têm uma mancha de cerdas pretas nas quatro patas chamadas pentes sexuais que as fêmeas não têm. Além disso, a ponta do abdômen masculino é coberta por uma cutícula escura e exibe genitália não vista nas fêmeas, coleta moscas fêmeas e coloca-as junto com quatro a cinco machos de olhos brancos em novos arquivos de alimentos com um máximo de 30 moscas por idade do frasco. As moscas por dois a cinco dias preparam as câmaras para a fome das moscas, primeiro empurrando um único tecido para o fundo de um frasco de plástico vazio, embebendo completamente o tecido com água destilada.

Em seguida, use um objeto para empurrar o tecido para baixo e esprema suavemente o excesso de água. Inverta o frasco para descartar a água extra. Deve haver água suficiente para manter as moscas hidratadas e a câmara de fome úmida, mas não o suficiente para afogar as moscas.

Cerca de 18 a 24 horas antes do início do experimento, transfira as moscas do frasco de comida para uma câmara de fome e tampe o frasco. Armazene os frascos sob condições controladas de temperatura e umidade durante a noite até o início do experimento. Prepare uma solução 1%agro adicionando 100 miligramas de aros de baixa temperatura de fusão a 10 mililitros de água destilada.

Em um frasco de vidro. Aqueça a solução agro no micro-ondas apenas até começar a ferver, mas antes de ferver, pare o micro-ondas e gire o frasco uma vez. Repita esta etapa mais duas vezes até que o aros esteja completamente dissolvido.

Manter a solução de Aros no estado líquido, mantendo o balão quente numa placa quente. Ajustado a 50 graus Celsius, adicione 990 microlitros da solução de 1% de aro e 10 microlitros de vinagre de maçã a um tubo DF de 1,5 mililitro. Para fazer uma solução de vinagre de maçã a 1%, vortex a solução até ficar misturada antes de colocá-la em uma incubadora de banho seco ajustada para 50 graus Celsius, defina a sala de teste para as condições desejadas, como temperatura e umidade.

Ligue o painel de LED de 660 nanômetros. Lave as peneiras e placas de teste com água quente e aqueça-as em um forno de secagem até que toda a umidade seja evaporada. Fresco. As peneiras e placas até a temperatura da sala de teste.

Antes de iniciar os experimentos, posicione um prato raso em cima da placa difusora e encha-o com água para aumentar a umidade local e mascarar a água na gota de aro. Por fim, posicione as peneiras sobre o prato de água. A placa de teste é feita de acrílico transparente e consiste em seis arenas de teste.

Um controle deslizante contém câmaras de retenção que permitem o carregamento de moscas, contenção temporária e liberação simultânea de seis moscas em suas respectivas câmaras. No início do experimento, miras gravadas no centro de cada arena na placa indicam que os odores devem ser pipetados. Insira os controles deslizantes na placa de teste de acrílico.

Deslize suavemente o aspirador para dentro do frasco para além do tampão de algodão e deixe entrar cerca de seis moscas no aspirador. É fundamental ser o mais gentil possível ao manuseá-los. Pode-se tirar proveito da fototática, comportamento da mosca para induzir moscas, para caminhar em direção ao aspirador apontando a abertura do frasco para uma fonte de luz fraca.

Se necessário, uma sucção suave pode ser aplicada para aspirar aproximadamente seis moscas fêmeas. Evite selecionar moscas machos de olhos brancos. Insira a ponta do aspirador no primeiro orifício da placa de teste.

Permita que uma única mosca passe para a célula de retenção e avance suavemente o controle deslizante para frente para carregar outra mosca no próximo buraco. Continue até voar. Ocupe todas as seis celas de retenção da placa.

Em seguida, pipete cinco microlitros de uma solução de agarro de vinagre de maçã a 1% diretamente no centro da mira na face interna da placa de teste. Para centralizar a placa de teste, abra o arquivo chamado Ferramenta de posicionamento vi. Execute o arquivo clicando na seta branca no canto superior esquerdo da tela.

Coloque a placa de teste em cima do sib de forma que a abertura da arena fique voltada para o piso do SIV e o alvo de odor esteja no teto da placa. Alinhe a mira da placa de teste com os ares cruzados na tela do monitor quando o alinhamento estiver concluído. Aborte a execução clicando no ponto vermelho localizado próximo ao canto superior esquerdo do monitor para rastrear e registrar as coordenadas da mosca.

Durante cada teste de pesquisa de alimentos, abra o arquivo de software de aquisição. Fly rastreando seis vi. Execute o arquivo clicando na seta branca no canto superior esquerdo do monitor.

Atribua um nome ao arquivo e clique em OK. Avance os controles deslizantes nas câmaras de teste para liberar as moscas nas arenas de teste. Tenha cuidado para não mover as câmaras de teste, pois isso levará ao registro inadequado das coordenadas.

Clique em iniciar e certifique-se de que a única fonte de luz na câmara de teste seja o painel de LED. Quando o teste terminar, remova a peneira e a câmara de comportamento. Levantar a placa de ensaio do passador e retirar as moscas submergindo a placa no gelo.

Limpe suavemente a placa com água quente e remova quaisquer detritos agros. Coloque as placas de teste em um forno de secagem para remover a umidade. Ventile a área de teste ligando um pequeno ventilador por aproximadamente dois minutos.

Desligue o ventilador e carregue o próximo grupo de moscas na próxima placa de teste. Prossiga para executar a análise de dados usando um software personalizado, conforme descrito no protocolo de texto. O software de análise de dados e o layout são usados para avaliar o desempenho de cada mosca durante seu teste de 10 minutos de acordo com um conjunto de critérios de análise.

Esses critérios são usados para determinar se os dados de cada mosca serão usados para análise de dados e são projetados para eliminar as moscas que são incapazes de realizar a tarefa de busca de alimentos devido a lesões, doenças, estresse ou falta de motivação, moscas que ficam inativas por mais de 300 segundos são consideradas inativas e são rejeitadas do conjunto de dados, a menos que já tenham conseguido localizar a fonte de alimento ou exposição. Uma velocidade média superior a 10 milímetros por segundo por pelo menos 100 segundos após o período inativo para selecionar apenas as moscas que exibem velocidades saudáveis durante os estágios iniciais do odor ativo. Pesquise apenas moscas que se movem dentro de uma certa faixa de velocidades nos primeiros 50 segundos do teste são aceitas para análise de dados moscas que não se movem por todos os quatro quadrantes da arena e vão direto para a fonte de alimento após o início do teste são rejeitadas.

As moscas que se aproximam e se afastam da fonte de alimento em um raio de 10 milímetros por um período mínimo de 50 segundos são consideradas como tendo encontrado com sucesso a fonte de alimento. O gráfico que descreve a distância da mosca da fonte de odor ao longo do tempo pode ser usado para avaliar este caso raro arenas com artefatos visíveis na posição da mosca. Trace também são rejeitados.

Os artefatos podem ser criados por qualquer evento em que o software de aquisição de dados detecte um objeto diferente da mosca. Eles geralmente aparecem como longas linhas retas que se estendem pela arena ou irradiam de seu centro. As moscas adultas que passam fome de 18 a 24 horas exibem uma maior sensibilidade olfativa aos odores relacionados aos alimentos do que suas contrapartes alimentadas.

Um gráfico gráfico da porcentagem cumulativa de moscas que localizam com sucesso uma fonte de odor de alimento mostra que 30% de todas as moscas famintas são bem-sucedidas em uma janela de 10 minutos. Em contraste, apenas 7% de todas as moscas alimentadas o fazem. As moscas famintas devem exibir uma atração significativamente maior pelo vinagre do que por um veículo agros sozinho, e essa observação pode ser usada para solucionar problemas de condições de teste.

Por exemplo, quando este experimento de busca de alimentos que foi realizado a 32 graus Celsius com uma umidade ambiental de 35% usando moscas do tipo selvagem, nenhuma diferença significativa entre a atração da mosca pelo vinagre e o controle aros foi detectada, isso provavelmente se deve a uma atração crescente pela água encontrada na gotícula agros sob temperaturas de teste mais quentes. Ao aumentar a umidade do teste para entre 50 e 60%, essa mudança comportamental foi corrigida e a diferença significativa entre a atração pelo vinagre e o veículo agros foi restaurada. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em 12, incluindo o teste experimental de 10 minutos, se for realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear as moscas com muito cuidado para evitar feri-las ou perturbá-las. Lembre-se de que as placas e peneiras de teste podem estar extremamente quentes quando no forno de secagem e, portanto, devem ser removidas usando luvas de forno após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurobiologia explorarem comportamentos quimiotáticos.

Essa técnica também pode ser adaptada para estudar a capacidade da mosca de localizar outros objetos odoríferos. Por exemplo, pode ser aplicado ao estudo do comportamento de localização de parceiros em moscas machos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como se preparar para o experimento, ajustar as condições experimentais, executar o experimento e analisar o desempenho de cada mosca, o que fornecerá um gráfico cumulativo mostrando a porcentagem de moscas que localizaram com sucesso a fonte de odor.