Name: A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-04T21:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Aprenda a quantificar mudanças comportamentais em Drosophila melanogaster causadas pela privação alimentar usando um ensaio automatizado de busca por odor. Este método rastreia a latência das moscas para localizar a fonte de alimento.

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Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação para JWW do Instituto Nacional de Saúde (R01DK092640) e National Science Foundation (0.920.668).

1. Fly Recolha e fome <ol><li> Rear as moscas experimentais sob condições de temperatura e umidade controladas (por exemplo, 21 ° C, 50-60% de umidade relativa) em um ciclo claro / escuro de 12 horas. </li><li> Colete feminino voa no dia da eclosão e colocá-los, juntamente com 4-5 machos, em novos frascos de alimentos (máximo de 30 por frasco). Idade voa de 2-5 dias. </li><li> Prepare as câmaras, fly fome. <ol><li> Empurrar um único tecido (4,8 x 8,4 polegadas) para a parte inferior de um frasco de plástico vazio. Molhar o tecido com água destilada. Use um objeto para empurrar para baixo sobre o tecido e esprema delicadamente o excesso de água. </li><li> Inverta o frasco para descartar a água extra. Deve haver água suficiente para manter as moscas hidratado e da câmara de fome úmido, mas não o suficiente para afogar as moscas. </li></ol></li><li> Transfira as moscas do frasco de comida em uma câmara de fome e ligar o frasco cerca de 18-24 horas antes do experimento começa. Armazenar ofrascos sob condições de temperatura e humidade controladas durante a noite até que o experimento começa no dia seguinte. </li></ol> 2. Preparação do Odor Alimentação <ol><li> Prepara-se uma solução de agarose a 1% através da adição de 0,1 g de agarose de baixa temperatura de fusão de 10 ml de água destilada em um balão de vidro. Aquecer a solução de agarose em um forno de microondas apenas até que comece a ferver, mas bem antes que ferve. <ol><li> Pare o microondas e agite o frasco uma vez. Repita este passo mais duas vezes até que a agarose foi completamente dissolvido. Manter a solução de agarose, num estado líquido, mantendo o frasco quente numa placa de aquecimento fixada em 50 ° C. </li></ol></li><li> Adicionar 990 mL da solução de agarose a 1% e 10 ml de vinagre de maçã para um tubo de 1,5 ml Eppendorf para fazer uma solução de 1% de vinagre de maçã. Vortex a solução até mista e coloque em uma incubadora de banho seco definido como 50 ° C. </li></ol> 3. Quarto Testing and Behavior Setup Câmara <ol><li&gt; Definir a sala de ensaios para as condições desejadas (por exemplo, temperatura e umidade). </li><li> Ligue o painel de LED (660 nm). </li><li> Lavar as peneiras e placas de teste com água quente e aquecê-los em um forno de secagem até que toda a umidade evapore. Arrefecer as peneiras e placas para baixo para a temperatura ambiente de testes antes dos experimentos iniciais. </li><li> Posicionar um prato raso na parte superior da placa difusora e enchê-lo com água para aumentar a humidade local e para mascarar a água na gota de agarose. </li><li> Posicione as peneiras sobre o prato de água. </li></ol> 4. Voar Carregando nas placas de teste Diagramas com especificações para placas de teste pode ser encontrada na seção de arquivos complementares. A placa de teste é feita de acrílico transparente e é composto por 6 arenas de teste. Um controle deslizante simples contém câmaras de exploração que permitem o carregamento mosca, a contenção temporária e lançamento simultâneo de 6 moscas em suas respectivas câmaras emo início da experiência. -Mira gravadas no centro de cada área na placa indicar onde odorantes deve ser pipetada. <ol><li> Insira os controles deslizantes para a placa de testes de acrílico. </li><li> Deslize suavemente o aspirador para o frasco após o tampão de algodão e permitir que cerca de 6 moscas para entrar no aspirator.it é fundamental para ser o mais suave possível em manuseá-los. Pode-se tirar proveito do comportamento da mosca fototáxico para induzir moscas a rastejar em direção ao aspirador, apontando a abertura do frasco para uma fonte de luz fraca. Se necessário, pode-se também aplicar sucção suave para aspirar aproximadamente 6 moscas do sexo feminino. </li><li> Inserir a extremidade do aspirador no primeiro orifício da placa de teste. Permitir uma única mosca passar para a cela e gentilmente avançar o controle deslizante para a frente para carregar uma mosca para o próximo buraco. Continue até que todos os 6 moscas ocupam celas da placa. </li><li> Pipetar 5 ul de solução de agarose de vinagre de cidra de maçã 1% directamente sobre o centro da crOSS-pêlos na face interior da placa de teste. </li></ol> 5. Posicionando a placa de teste <ol><li> Para centralizar a placa de teste, abra o arquivo chamado &quot;Posicionamento Tool.vi.&quot; &quot;LabVIEW VI para o posicionamento da ferramenta. vi podem ser encontrados na seção Arquivos Suplementar. Execute o arquivo, clicando na seta branca no canto superior esquerdo da tela. </li><li> Colocar a placa de teste no topo do crivo de modo a que a área de abertura voltada para o chão peneira e o alvo é o odor no tecto da placa. Alinhe a mira gravado em volta da placa de teste com a mira na tela do monitor. </li><li> Quando o alinhamento tenha sido concluída, abortar a execução clicando no ponto vermelho localizado perto do canto superior esquerdo do monitor. </li></ol> 6. Registre o Fly Posição durante o experimento <ol><li> Para acompanhar e registrar as coordenadas da mosca durante cada tentativa de busca de alimentos, abra o arquivo de software de aquisição de &quot;Fly Tracking - Seis Zones.vi &quot;LabVIEW VIs para&quot; Fly Tracking -. Seis Zones.vi &quot;pode ​​ser encontrado na seção Arquivos Suplementar Execute o arquivo, clicando na seta branca no canto superior esquerdo do monitor. . </li><li> Atribua um nome ao arquivo e clique em &quot;OK&quot;. </li><li> Avance os controles deslizantes nas câmaras de teste para liberar as moscas nas arenas de teste. Tenha cuidado para não mover as câmaras de teste, pois isso levará a alinhamento impróprio com coordenadas de software de análise. </li><li> Clique em &quot;Start&quot; (gravação começa) e garantir que a única fonte de luz na câmara de teste é o painel de LED a 660 nm. </li><li> Quando o julgamento for concluído, retire a peneira e câmara de comportamento. Levante a placa de testes da peneira e remover as moscas, submergindo a placa de gelo. Limpe suavemente a placa com água quente e remover todos os detritos de agarose. Colocar as placas de ensaio em uma estufa de secagem para remover a humidade. </li><li> Ventile a área de teste, rodando em um small fã durante cerca de 2 min. Gire o ventilador desligado e carregar o próximo grupo de moscas na próxima placa de teste. </li></ol> 7. Análise de Dados Utilizando Software &quot;Análise de Dados para Fly rastreamento em seis zonas&quot; podem ser encontrados na seção Arquivos Suplementar. Durante a aquisição de dados, coordena o programa de aquisição de registros de posição mosca individual para cada ponto de tempo em um arquivo de texto. A única câmera digital posicionada acima das placas de teste adquire imagens com uma taxa de quadros de 0,5 Hz. O programa de software de análise de &quot;Análise de Dados para a mosca-Tracking seis zonas&quot; extrai informações a partir desse arquivo de texto para a) calcular a velocidade média, b) determinar o ponto de tempo em que uma mosca localizado com sucesso a fonte odor, e c) construir janelas gráficas que permitem que o usuário vista: localização, distância da mosca voar a partir da fonte odor ao longo do tempo e velocidade média mosca ao longo do tempo. Ele também formata os dados para facilitar a exportação em um spreprograma adsheet. Nesta macro, a latência de pesquisa alimento é definida como o ponto temporal em que voa passar, pelo menos, 5 segundos dentro de um raio de 5 mm acima do centro da arena. <ol><li> Abra o arquivo de software de análise de &quot;Análise de Dados para Fly Tracking - seis zonas&quot;. Na aba &quot;Windows&quot;, clique em &quot;Create New Table&quot;. Repita este passo até seis mesas foram criadas. </li><li> Na guia &quot;macros&quot;, clique em &quot;Foodfinding&quot;. Um painel principal deve aparecer com as seguintes opções: Open Data Arquivo primas para layout; Open Data Arquivo primas para arquivo de dados; Fly Localização; Distância; velocidade; layout; FormatDataFile. </li><li> Para visualizar os dados brutos, sem acréscimo de valores em um arquivo de texto, clique em &quot;Abrir arquivo de dados brutos para o Layout.&quot; Localize e selecione o arquivo de dados experimental na janela do navegador que aparece. Clique em &quot;Abrir&quot;. </li><li> Clique em &quot;Fly Location&quot; para ver a localização de cada mosca em cada uma das seis arenas (seis parcelas XY retratando cada mosca &#39;s posição ao longo do tempo deve aparecer na tela). </li><li> Clique em &quot;Distância&quot; para ver a distância de cada mosca da fonte de odor (seis parcelas retratando distância da mosca da fonte de odor ao longo do tempo deve aparecer na tela). A linha horizontal em y 5 mm indica o limiar para o qual a mosca é considerado para ser localizado na fonte de alimento. </li><li> Clique em &quot;Speed&quot; para ver a velocidade média de cada mosca durante o julgamento (seis parcelas retratando a velocidade da mosca ao longo do tempo deve aparecer na tela). </li><li> Clique em &quot;Layout&quot; para exibir um layout com todos os localização mosca, distância, velocidade e gráficos, além de a velocidade média (durante os primeiros 50 seg) e latência de encontrar a fonte de odor para cada mosca (Figura 1). Para visualizar adequadamente a disposição, pode ser necessário ajustar as margens. Para fazer isso, primeiro clique na janela de layout. Sob a guia &quot;Arquivo&quot;, clique em &quot;Configurar Página para Layout.&quot; Repor as margens para0,2 polegadas e clique em &quot;OK&quot;. Imediatamente deixou de cada parcela localização é uma pequena mesa com os títulos de &quot;Speed&quot; e &quot;Latência&quot;. Os valores inseridos em cada ponto indicam a velocidade média em mm / seg e pesquisa de alimentos latência em segundos. Entradas em branco sob Latência indicam a mosca não conseguiu localizar a fonte de odor. Alimentação latência de pesquisa é definido como o ponto no tempo em que as moscas passou pelo menos 5 segundos dentro de um raio de 5 mm a partir do centro da câmara. </li><li> Para imprimir um layout, clique na área de layout (atualizações de layout para o arquivo atual). Clique em &quot;Arquivo&quot; e depois clique em &quot;Layout de impressão.&quot; </li><li> Para visualizar o próximo arquivo, basta clicar em &quot;Abrir Arquivo de Dados-prima para Layout.&quot; Clique no seguinte arquivo de dados brutos que você deseja ver e clique em &quot;OK&quot;. Clique na janela de Layout para atualizar a janela com o novo arquivo de dados. </li><li> As configurações podem ser salvos em um arquivo de experimento para uso posterior. </li></ol> 8. Exportar dados deo software de análise de dados para um programa de planilha <ol><li> Para exportar dados de velocidade e latência para cada arquivo, clique em &quot;Open Data Arquivo primas para arquivo de dados.&quot; Selecione um arquivo de dados experimentais e clique em &quot;Abrir&quot;. Uma nova janela do navegador aparecerá. </li><li> Na nova janela do navegador, clique com o botão direito em &quot;Novo&quot; e depois clique em &quot;Documento de texto.&quot; Nome do novo documento de texto. Selecione o arquivo de texto recém-nomeado e clique em &quot;Abrir&quot;. Ele armazena os dados do arquivo de dados brutos para o arquivo de texto. </li><li> Para exportar dados de outro arquivo, clique em &quot;Abrir Arquivo de Dados-prima para arquivo de dados.&quot; Clique em outro arquivo e clique em &quot;Abrir&quot;. Selecione o arquivo de texto a partir do passo 8.2). Continue esse processo para os arquivos de dados restantes que deseja exportar. </li><li> Uma vez que todos os arquivos de dados desejadas tenham sido adicionadas ao arquivo de texto, clique em &quot;Formato de Arquivo de Dados.&quot; Selecione o documento de texto usado para armazenar os dados dos passos anteriores e clique em &quot;Abrir&quot; (um novo window irá abrir automaticamente). </li><li> Crie um novo documento de texto na janela, atribuir um nome ao arquivo e clique em &quot;Salvar&quot;. Isso cria um arquivo de texto que contém o nome do arquivo, velocidade média, e latência para cada voar e pode ser importado para um programa de planilha. </li><li> Parcelas cumulativas são construídos a partir de dados sobre o número total de moscas que atingem o alvo odor de alimentos como uma função do tempo (Figura 3). </li><li> Conjuntos de dados experimentais são analisados ​​para significância estatística usando um teste z para proporções. </li></ol>

<ol><li>Dethier, V. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDethier%2C+VG+%22The+hungry+fly+%3A+a+physiological+study+of+the+behavior+associated+with+feeding%22">The hungry fly : a physiological study of the behavior associated with feeding</a>. , Harvard University Press. (1976).</li>
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<li>Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+responses+of+Drosophila+to+biogenic+levels+of+carbon+dioxide+depend+on+life-stage%2C+sex+and+olfactory+context%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context.</a> J. Exp. Biol. 209, 2739-2748 (2006).</li>
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<li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li>
<li>Kitamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+modification+of+behavior+in+Drosophila+by+targeted+expression+of+a+temperature-sensitive+shibire+allele+in+defined+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons.</a> J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).</li>
<li>Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+expression+of+tetanus+toxin+light+chain+in+Drosophila+specifically+eliminates+synaptic+transmission+and+causes+behavioral+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects.</a> Neuron. 14, 341-351 (1995).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
</ol>

Os autores declaram que não há interesse financeiro concorrente.

Neste protocolo, descrevemos um procedimento passo-a-passo para o ensaio de comportamento de busca de alimentos. Além de odores alimentares relacionados com, mas também pode ser adaptada para o estudo da capacidade de voar para localizar outros objectos de odor. Por exemplo, ele pode ser aplicado para o estudo do comportamento de localização mate em moscas macho 3 Há várias considerações adicionais para este protocolo que vamos mencionar aqui em relação a este procedimento.: Em pr...

Unidos da fome promover dois tipos de comportamentos apetitivas: busca de alimentos e consumo de alimentos 1. Este ensaio comportamental simples é útil para o estudo de comportamentos quimiotáticos associados forrageamento 2,3. Especificamente, ele rastreia a posição da mosca, velocidade de caminhada e latência para localizar um alvo odor de alimentos. Latência de encontrar comida serve como métrica para medir as mudanças na sensibilidade do sistema de detecção de odor da mosca a jusante das alterações no seu estado appetitive interno. Uma versão manual deste ensaio foi utilizado anteriormente para mostrar a sinalização do receptor de GABA-B é importante para o comportamento odor localização em moscas adultas 3. A versão automatizada atual do ensaio foi fundamental para o estudo de como curto-neuropeptídeo F (SNPF) sinalização remodela o mapa olfativo em Drosophila e influências apetitivo comportamentos 2. O teste é realizado a uma temperatura e humidade ambiente escuro, controlado. Digitalcâmeras de vídeo definidas acima das placas de teste de acrílico transparente controlar moscas backlit pelo 660-nm iluminação LED. Informações da câmara é processada em tempo real por um computador estacionado próximo à área de testes. Nós usamos o software de aquisição de dados para gravar e salvar as coordenadas de posições voar durante o período de testes. Neste paradigma, o sujeito é liberado em uma arena que contém um odor de alimentos no centro, o objeto odor cria um gradiente de odor de alimentos dentro da arena, que induz o comportamento de busca de alimentos em tempo real. Um protocolo semelhante busca odor tem sido aplicado para o estudo de chemosensation em larvas Drosophila único 7. Enquanto outros ensaios comportamentais, tais como o de quatro campos olfatômetro 4,5 ou o t-labirinto 6 avaliar odor aversão ou atração comportamentos, este paradigma é o mais adequado para avaliar a sensibilidade e de quimiotaxia comportamentos olfativos. Vários principais vantagens acompanhar esta assay. Primeiro, ele permite a aquisição rápida de grandes conjuntos de dados, porque a coleta de dados e análise são principalmente automatizado. Em segundo lugar, este ensaio isola e mede o comportamento das moscas individuais, eliminando, assim, os sinais sociais olfativos que podem influenciar seus comportamentos. Em terceiro lugar, a simplicidade do protocolo e design experimental simples fazer o teste eficiente e fácil de ensinar aos outros. Além disso, este ensaio pode ser usado para investigar mais circuitos neurais subjacentes ao comportamento de busca de alimentos combinando-a com o grande conjunto de ferramentas genéticas disponíveis para Drosophila melanogaster 8. Expressão Targeted de transgenes que o silêncio ou excitar neurônios pode ser conseguido com ferramentas como o sistema GAL4-UAS, bem como o TS1 UAS-Shibire, UAS-tétano-toxina, e UAS-TRPA1 (B) transgenes 9-12.

<table><tbody><tr><td>Espectro</td><td></td> <td>de vinagre de maçã</td><td>disponível comercialmente</td></tr><tr><td>Agarose, Tipo VII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td>baixa temperatura gelificante agarose</td></tr><tr>Placa <td></td> de<td>teste de acrílico</td><td>placa personalizada</td><td>contém 6 arenas. Cada arena tem 60 mm de diâmetro e 6 mm de altura. Consulte os diagramas de placas de teste para medições específicas.</td></tr><tr><td>LabVIEW V.8.5</td> Plataforma <td>776670-09</td> da <td>National Instruments</td><td>para programas: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTA: "elapsed time.vi", "time into file.vi" e "two object detect.vi" são sub-rotinas incluídas que devem estar disponíveis para que o programa principal de aquisição de dados "FlyTracking--Six zones.vi" seja executado.</td></tr><tr><td>LabVIEW Vision 8.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de aquisição LabVIEW Vision 8.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW Vision Builder AI 3.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro V.6</td><td>Wavemetric, Inc.</td><td></td><td>plataforma para macro: Análise de Dados para Rastreamento de Moscas--Seis Zonas</td></tr><tr><td>Basler scA1390-17fm</td><td>National Instruments</td><td>779980-01</td><td>Câmera Digital NOTA: driver para câmera disponível em lente Baslerweb.com</td></tr><tr><td>8 mm</td><td>National Instruments</td><td>780024-01</td><td>Lente para Câmera Digital Basler</td></tr><tr><td>Placa Difusora de Vidro Moído</td><td>Edmund Optics</td><td>personalizado</td><td>Difunde luz, 25 cm x 30 cm</td></tr><tr><td>US Std. No. 100</td><td>Fischer Scientific</td><td>04-881X</td><td>Peneira com abertura nominal de 150 &mu; m</td></tr><tr><td colspan="4">Opção de iluminação 1</td></tr><tr><td>LED retroiluminação LED 660 nm (20 cm x 20 cm)</td><td>Spectra West</td><td>BL47192</td><td>uma opção de iluminação mais simples, mas mais cara.</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação para LED</td><td>Backlight Spectra West</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Opção de iluminação 2</td></tr><tr><td>660 nm LEDs</td><td>Superbrightleds</td><td>RL5R1330</td><td>Comprimento de onda 660 nm (aproximadamente 7 x 7 matriz de LED para um painel de 14,7 polegadas x 9,75 polegadas)</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação DC linear</td><td>GW Instek</td><td>GPS-1830D</td><td>Fonte de alimentação para painel de LED</td></tr><tr><td>Placa de ensaio sem solda</td><td>Digikey</td><td>922354-ND</td><td>Placa de ensaio para LEDs</td></tr></tbody></table>

a single-fly ensaio para comportamento de forrageamento em drosophila

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

Para muitos animais, a fome promove mudanças no sistema olfativo de uma forma que facilita a busca de fontes de alimentos apropriados. Neste artigo de vídeo, descrevemos um método automatizado para medir o efeito de fome ou saciedade em olfativo comportamento de busca de alimentos dependente na fruta Drosophila melanogaster mosca adulta. Em uma caixa à prova de luz iluminado por uma luz vermelha que é invisível para as moscas de fruta, uma câmera ligada ao software de aquisição de dados personalizado monitora a posição de seis moscas simultaneamente. Cada mosca se limita a caminhar em arenas individuais contendo um odor de alimentos no centro. As arenas de ensaio repousar sobre um piso poroso que funciona para prevenir a acumulação de odor. A latência para localizar a fonte de odor, uma métrica que reflecte a sensibilidade olfactiva em diferentes estados fisiológicos, é determinada por análise de software. Aqui, discutimos os mecanismos críticos de executar este paradigma comportamental e abranger questões específicas sobre mosca loading, a contaminação odor, temperatura do ensaio, a qualidade dos dados e análise estatística.

O software de análise de dados e a disposição, um exemplo dos quais pode ser visto na Figura 1, são utilizados para avaliar o desempenho de cada mosca durante a sua 10 min ensaio de acordo com um conjunto de critérios de análise. Os seguintes critérios são utilizados para determinar se os dados de cada mosca serão utilizados para análise de dados e são projetados para eliminar as moscas que não são capazes de realizar a tarefa de busca de alimentos, devido a lesão, doença, estresse ou falta de motivação...

Neste artigo de vídeo, descrevemos um método automatizado para medir o efeito de fome ou saciedade em olfativo comportamento de busca de alimentos dependente na fruta Drosophila melanogaster mosca adulta.

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar as mudanças comportamentais desencadeadas pela privação alimentar na mosca adulta Salala Melanogaster. Isso é feito pelas primeiras moscas famintas por 18 a 24 horas. O segundo passo é carregar moscas individuais em câmaras de comportamento, cada uma contendo uma fonte de odor atraente em seu centro.Em seguida, um sistema de computador com uma câmera digital rastreia a posição de cada voo ao longo do tempo e registra. Suas coordenadas para posterior análise dos dados. A etapa final é determinar a latência de cada mosca para atingir a fonte de odor usando um software personalizado.Em última análise, este ensaio de comportamento de pesquisa de alimentos de alto rendimento pode ser usado para estudar a relação entre a função do circuito neural e as respostas comportamentais. A principal vantagem deste ensaio sobre o método existente, como os companheiros de equipe, é que ele quantifica o comportamento quimiotático em moscas individuais. Este método pode ajudar a responder a perguntas em neurobiologia, como quais circuitos neurológicos são importantes para o comportamento quimiotático e como esses circuitos neurológicos são moderados pelo estado fisiológico interno do animal.O objetivo deste método é obter grandes conjuntos de dados de comportamento em um curto espaço de tempo. Embora esse método tenha nos dado insights sobre o comportamento de forrageamento, ele também pode ser usado para estudar outros comportamentos, como fazer localização. A demonstração visual desse método é crítica.O manuseio adequado da mosca e a execução do software de computador são essenciais para o sucesso deste experimento. Geralmente, o indivíduo novo neste método pode ter um pouco de dificuldade no início, porque leva algum tempo e paciência para aprender a lidar com as moscas demonstrando suavemente que o procedimento será feito na agulha. Entre em contato com um técnico do meu laboratório antes da coleta de moscas.Traseira, as moscas experimentais sob condições controladas de temperatura e umidade em um ciclo de luz escura de 12 horas. No dia da explosão da CEE, anestesiar as moscas sob dióxido de carbono antes de sexá-las ao microscópio. Vários critérios básicos podem ser usados para diferenciar entre homens e mulheres.Os machos têm uma mancha de cerdas pretas nas quatro patas chamadas pentes sexuais que as fêmeas não têm. Além disso, a ponta do abdômen masculino é coberta por uma cutícula escura e exibe genitália não vista nas fêmeas, coleta moscas fêmeas e coloca-as junto com quatro a cinco machos de olhos brancos em novos arquivos de alimentos com um máximo de 30 moscas por idade do frasco. As moscas por dois a cinco dias preparam as câmaras para a fome das moscas, primeiro empurrando um único tecido para o fundo de um frasco de plástico vazio, embebendo completamente o tecido com água destilada.Em seguida, use um objeto para empurrar o tecido para baixo e esprema suavemente o excesso de água. Inverta o frasco para descartar a água extra. Deve haver água suficiente para manter as moscas hidratadas e a câmara de fome úmida, mas não o suficiente para afogar as moscas.Cerca de 18 a 24 horas antes do início do experimento, transfira as moscas do frasco de comida para uma câmara de fome e tampe o frasco. Armazene os frascos sob condições controladas de temperatura e umidade durante a noite até o início do experimento. Prepare uma solução 1%agro adicionando 100 miligramas de aros de baixa temperatura de fusão a 10 mililitros de água destilada.Em um frasco de vidro. Aqueça a solução agro no micro-ondas apenas até começar a ferver, mas antes de ferver, pare o micro-ondas e gire o frasco uma vez. Repita esta etapa mais duas vezes até que o aros esteja completamente dissolvido.Manter a solução de Aros no estado líquido, mantendo o balão quente numa placa quente. Ajustado a 50 graus Celsius, adicione 990 microlitros da solução de 1% de aro e 10 microlitros de vinagre de maçã a um tubo DF de 1,5 mililitro. Para fazer uma solução de vinagre de maçã a 1%, vortex a solução até ficar misturada antes de colocá-la em uma incubadora de banho seco ajustada para 50 graus Celsius, defina a sala de teste para as condições desejadas, como temperatura e umidade.Ligue o painel de LED de 660 nanômetros. Lave as peneiras e placas de teste com água quente e aqueça-as em um forno de secagem até que toda a umidade seja evaporada. Fresco. As peneiras e placas até a temperatura da sala de teste.Antes de iniciar os experimentos, posicione um prato raso em cima da placa difusora e encha-o com água para aumentar a umidade local e mascarar a água na gota de aro. Por fim, posicione as peneiras sobre o prato de água. A placa de teste é feita de acrílico transparente e consiste em seis arenas de teste.Um controle deslizante contém câmaras de retenção que permitem o carregamento de moscas, contenção temporária e liberação simultânea de seis moscas em suas respectivas câmaras. No início do experimento, miras gravadas no centro de cada arena na placa indicam que os odores devem ser pipetados. Insira os controles deslizantes na placa de teste de acrílico.Deslize suavemente o aspirador para dentro do frasco para além do tampão de algodão e deixe entrar cerca de seis moscas no aspirador. É fundamental ser o mais gentil possível ao manuseá-los. Pode-se tirar proveito da fototática, comportamento da mosca para induzir moscas, para caminhar em direção ao aspirador apontando a abertura do frasco para uma fonte de luz fraca.Se necessário, uma sucção suave pode ser aplicada para aspirar aproximadamente seis moscas fêmeas. Evite selecionar moscas machos de olhos brancos. Insira a ponta do aspirador no primeiro orifício da placa de teste.Permita que uma única mosca passe para a célula de retenção e avance suavemente o controle deslizante para frente para carregar outra mosca no próximo buraco. Continue até voar. Ocupe todas as seis celas de retenção da placa.Em seguida, pipete cinco microlitros de uma solução de agarro de vinagre de maçã a 1% diretamente no centro da mira na face interna da placa de teste. Para centralizar a placa de teste, abra o arquivo chamado Ferramenta de posicionamento vi. Execute o arquivo clicando na seta branca no canto superior esquerdo da tela.Coloque a placa de teste em cima do sib de forma que a abertura da arena fique voltada para o piso do SIV e o alvo de odor esteja no teto da placa. Alinhe a mira da placa de teste com os ares cruzados na tela do monitor quando o alinhamento estiver concluído. Aborte a execução clicando no ponto vermelho localizado próximo ao canto superior esquerdo do monitor para rastrear e registrar as coordenadas da mosca.Durante cada teste de pesquisa de alimentos, abra o arquivo de software de aquisição. Fly rastreando seis vi. Execute o arquivo clicando na seta branca no canto superior esquerdo do monitor.Atribua um nome ao arquivo e clique em OK. Avance os controles deslizantes nas câmaras de teste para liberar as moscas nas arenas de teste. Tenha cuidado para não mover as câmaras de teste, pois isso levará ao registro inadequado das coordenadas.Clique em iniciar e certifique-se de que a única fonte de luz na câmara de teste seja o painel de LED. Quando o teste terminar, remova a peneira e a câmara de comportamento. Levantar a placa de ensaio do passador e retirar as moscas submergindo a placa no gelo.Limpe suavemente a placa com água quente e remova quaisquer detritos agros. Coloque as placas de teste em um forno de secagem para remover a umidade. Ventile a área de teste ligando um pequeno ventilador por aproximadamente dois minutos.Desligue o ventilador e carregue o próximo grupo de moscas na próxima placa de teste. Prossiga para executar a análise de dados usando um software personalizado, conforme descrito no protocolo de texto. O software de análise de dados e o layout são usados para avaliar o desempenho de cada mosca durante seu teste de 10 minutos de acordo com um conjunto de critérios de análise.Esses critérios são usados para determinar se os dados de cada mosca serão usados para análise de dados e são projetados para eliminar as moscas que são incapazes de realizar a tarefa de busca de alimentos devido a lesões, doenças, estresse ou falta de motivação, moscas que ficam inativas por mais de 300 segundos são consideradas inativas e são rejeitadas do conjunto de dados, a menos que já tenham conseguido localizar a fonte de alimento ou exposição. Uma velocidade média superior a 10 milímetros por segundo por pelo menos 100 segundos após o período inativo para selecionar apenas as moscas que exibem velocidades saudáveis durante os estágios iniciais do odor ativo. Pesquise apenas moscas que se movem dentro de uma certa faixa de velocidades nos primeiros 50 segundos do teste são aceitas para análise de dados moscas que não se movem por todos os quatro quadrantes da arena e vão direto para a fonte de alimento após o início do teste são rejeitadas.As moscas que se aproximam e se afastam da fonte de alimento em um raio de 10 milímetros por um período mínimo de 50 segundos são consideradas como tendo encontrado com sucesso a fonte de alimento. O gráfico que descreve a distância da mosca da fonte de odor ao longo do tempo pode ser usado para avaliar este caso raro arenas com artefatos visíveis na posição da mosca. Trace também são rejeitados.Os artefatos podem ser criados por qualquer evento em que o software de aquisição de dados detecte um objeto diferente da mosca. Eles geralmente aparecem como longas linhas retas que se estendem pela arena ou irradiam de seu centro. As moscas adultas que passam fome de 18 a 24 horas exibem uma maior sensibilidade olfativa aos odores relacionados aos alimentos do que suas contrapartes alimentadas.Um gráfico gráfico da porcentagem cumulativa de moscas que localizam com sucesso uma fonte de odor de alimento mostra que 30% de todas as moscas famintas são bem-sucedidas em uma janela de 10 minutos. Em contraste, apenas 7% de todas as moscas alimentadas o fazem. As moscas famintas devem exibir uma atração significativamente maior pelo vinagre do que por um veículo agros sozinho, e essa observação pode ser usada para solucionar problemas de condições de teste.Por exemplo, quando este experimento de busca de alimentos que foi realizado a 32 graus Celsius com uma umidade ambiental de 35% usando moscas do tipo selvagem, nenhuma diferença significativa entre a atração da mosca pelo vinagre e o controle aros foi detectada, isso provavelmente se deve a uma atração crescente pela água encontrada na gotícula agros sob temperaturas de teste mais quentes. Ao aumentar a umidade do teste para entre 50 e 60%, essa mudança comportamental foi corrigida e a diferença significativa entre a atração pelo vinagre e o veículo agros foi restaurada. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em 12, incluindo o teste experimental de 10 minutos, se for realizada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear as moscas com muito cuidado para evitar feri-las ou perturbá-las. Lembre-se de que as placas e peneiras de teste podem estar extremamente quentes quando no forno de secagem e, portanto, devem ser removidas usando luvas de forno após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurobiologia explorarem comportamentos quimiotáticos.Essa técnica também pode ser adaptada para estudar a capacidade da mosca de localizar outros objetos odoríferos. Por exemplo, pode ser aplicado ao estudo do comportamento de localização de parceiros em moscas machos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como se preparar para o experimento, ajustar as condições experimentais, executar o experimento e analisar o desempenho de cada mosca, o que fornecerá um gráfico cumulativo mostrando a porcentagem de moscas que localizaram com sucesso a fonte de odor.

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