Name: Medição de cálcio total em neurônios por Electron Probe X-ray Microanálise (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-20T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprenda a medir cálcio total em neurônios cultivados usando microanálise por sonda eletrônica de raios X. Esta técnica de criomicroscopia eletrônica permite análise quantitativa em resolução subcelular.

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Gostaríamos de agradecer a Sra. Christine A. Winters para excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Básico de Neurociências do Programa NINDS intramuros Research, NIH (Z01 NS002610).

A abordagem descrita aqui foi desenvolvido utilizando instrumentos específicos, ferramentas e software. Porque laboratórios não vai usar a mesma configuração experimental da abordagem é generalizada sempre que possível. 1. Congelação rápida O método analítico para ser descrito é absolutamente dependente abordagens criogénicos para: 1) o &quot;criofixação&quot; de células ou tecidos de uma maneira que preserva quantitativamente a distribuição dos componentes do tecido difusíveis e elementos químicos que foram em células vivas, no momento da congelação e 2) a preparação de ultrafinos criosecções adequado para imagem e análise de TEM. Estas técnicas são brevemente descritos aqui, mas os detalhes necessários para reproduzir estes procedimentos em outros laboratórios estão fora do escopo deste artigo. Os leitores interessados ​​são encaminhados para excelentes artigos recentes 9,14. Atenção: Esta seção descreve o uso de liquetano efied, que é altamente inflamável e explosiva; devem ser tomadas precauções apropriadas. O operador deve também estar familiarizado com nitrogênio líquido (LN 2) as precauções de segurança, incluindo o revestimento protetor laboratório, óculos e luvas cryoresistant. Nota: Aqui e por toda parte, todas as ferramentas (fórceps, etc) usado para lidar com amostras congeladas devem ser pré-resfriada em LN 2 antes do uso para evitar o descongelamento acidental. Células cultivadas sobre lamínulas <ol><li> Preparar um dispositivo de congelação por condensação de imersão etano gasoso a -160 ° C na cavidade central LN 2-arrefecida. Encha até a marca e cobrir o poço com a tampa giratória de alumínio quando não estiver em uso. </li><li> Usando cunhas de papel de filtro, borrão lamelas de plástico de células cultivadas sob experimentalmente condições adequadas a um filme aquoso fino. Seque a partir da borda, de modo a evitar tocar no tecido, o filme residual ideais, determinada por tentativa e erro, é tão fino quanto possível, mas não tão them como a evaporar e permitir a secagem da superfície do tecido. </li><li> Segurando a lamela pela borda com uma pinça de fixação, mergulhe rapidamente em etano líquido, manualmente ou usando o êmbolo movido a gravidade. </li><li> Coloque a lamela congelado em uma tigela de isopor nas proximidades de LN 2, grande o suficiente para manipular o número desejado de lamelas em recipientes de armazenamento de longo prazo. Latas com tampa de rosca de alumínio que não aproveitar sob LN 2 são recomendados. </li></ol> Congelação rápida de fatias cerebrais em cultura <ol start="5"><li> Sob um microscópio de dissecação, ver e orientar uma fatia do hipocampo organotípica, imperturbável e ainda ligado à inserção da membrana cultura. Coloque pontos de referência sobre a membrana perto da borda da fatia com uma caneta de tipo Sharpie preto e fotografia. </li><li> Ainda sob o microscópio, cortar aprox. 5 x 5 milímetros quadrados de membrana com fatias individuais centradas nas praças. Evite tocar a fatia ou dobrar o membrane. </li><li> Montar uma fatia apoiado por uma membrana, amortecido por um ¼ de almofada agar diâmetro, em um disco de alumínio design personalizado feito para caber um cryoultramicrotome (descrito abaixo). Rapidamente congelar a fatia por pneumaticamente impulsionando-a contra um bloco de safira LN-2 arrefecido por meio de um dispositivo personalizado &quot;bater de congelamento&quot;. </li><li> Mover para armazenamento, tal como descrito para as células cultivadas. </li></ol> 2. Cryosectioning Ressalva: produzir com sucesso fitas de corte seco de cortes ultrafinos, enquanto simples e lógico, requer treinamento, paciência e prática considerável. <ol><li> Asse um cryoultramicrotome equipado com um cryoattachment e legal para -135 ° C. </li><li> Corte lamelas congelados em aprox. 3 x 3 quadrados mm usando uma afiada, bisturi pré-resfriada. Incorporar pedaços com culturas voltado para cima num líquido viscoso &quot;cryoglue&quot; (uma mistura de 01:06 de etanol e 2-propanol 11), no padrão 3pinos de alumínio mm de diâmetro projetado para caber o chuck espécime micrótomo. Evite vazamento cryoglue na superfície da cultura. Solidificar cryoglue, baixando a temperatura para cryobox ≤ -160 ° C. <ul class="lalpha"><li> Para fatias de cérebro congelado, fixar firmemente os discos diretamente para um mandril espécime feito por medida por meio de um colar de parafuso. </li></ul></li><li> Apare áreas selecionadas dos espécimes congelados - por exemplo, áreas ricas em células de peças lamela ou áreas identificadas fatias - a um aprox. 250 x 250 um bloco rosto e ~ 100 microns de dimensão usando uma ferramenta de diamante de corte. </li><li> Fitas seco de corte de secções finas em ca. -160 ° C utilizando um diamante cryoknife 35 °, essencialmente como descritos no referencs 4, 9. Velocidade de corte e faca ângulo de folga são determinados empiricamente, um bom ponto de partida é 0,4-0,6 mm / s em 9 °. A espessura nominal, isto é, amostra de avanço, de secções hidratadas ié tipicamente de 80 nm, embora seções são realmente de 1,5 x 2,0 x mais grosso, principalmente devido à compressão. Para o corte satisfatório, um dispositivo anti-estática é essencial. Coloque a ponta de ionização do dispositivo 0,5-1 cm da borda de faca e ajustar a potência de saída até fitas satisfatórios de seções são produzidos. </li><li> Prepare sondas cílios colando (com epóxi) cílios para varas aplicador de madeira. Usando tal sonda, pegar e seções de transferência da parte de trás da faca Onto brilho descarregada, filmes de apoio pioloform revestido de carbono emitidos mais de 100 malha grades de cobre dobrar e descansam em um índio envelope meia folha dobrada em uma prateleira atrás de trabalho a faca. Dobre a metade superior da grade e envelope, pressione com uma ferramenta de prensagem a frio. </li><li> Transferência grades envolto a uma caixa de grade conveniente e guarde em uma lata de alumínio, tal como descrito no passo 1.4. </li></ol> 3. Cryotransfer de amostras para o microscópio eletrônico O instrumento principal para EPMAneste laboratório é um microscópio eletrônico analítico operado a 120 kV e equipado para criomicroscopia, ou seja, concebido com um vácuo limpo, anticontaminator espécime-área, um de alta sensibilidade câmera digital 2k x 2k e suporte da amostra cryotransfer. Verifique com antecedência alinhamento microscópio e condições de operação em ambos os modos de baixa e de alta ampliação e confirmar um vácuo coluna satisfatório, o ideal é ≤ 10 -7 Torr. Sintonize-se, se necessário. <ol><li> Confirme se o isolamento a vácuo do componente Dewar do cryoholder é satisfatória. Bomba como necessário. </li><li> Arrefecer o cryoholder à sua temperatura mínima, pelo menos -160 ° C, enquanto em alto vácuo dentro do estágio do microscópio; retire o cabo que liga o suporte à sua caixa de controle. Incline o goniômetro 45 ° no sentido horário antes de remover o suporte para minimizar LN 2 derramando sobre superfícies de operador e de microscópio. </li><li> Prepare o cryoworkstation bancada pelo resfriamento do isolar integranted copo de ≤ 160 ° C. </li><li> Transfer (rapidamente!) o cryoholder resfriado de microscópio crio a estação de trabalho. Recolha geada escudo do titular. </li><li> Recuperar sob LN 2 um sanduíche da rede de armazenamento e lugar na mesa de trabalho do cryoworkstation. Um anel de retenção de amostra bem do detentor também é colocada sobre a mesa. </li><li> Abra o envelope de índio e mover a grade dobrável fechada para o bem do espécime cryoholder. Fixe a grade com anel de retenção usando a ferramenta chave fornecida e fechar o escudo geada. </li><li> Remover rapidamente o cryoholder do cryoworkstation e inserir na câmara do microscópio e passar a seqüência de bombeamento, o mais rapidamente possível. Na inserção, deve haver uma interrupção mínima da coluna de vácuo. </li><li> Retornar goniômetro a 0 ° de inclinação. Volte a ligar e reenergizar a caixa de controle e verifique se a temperatura da amostra é ≤ 150 ° C. </li><li> Encher o Dewar dosuporte do espécime e permitir a vácuo e temperatura para se recuperar totalmente. </li></ol> 4. Levantamento Visual das Seções <ol><li> Recolha o escudo geada do titular para expor amostra e ligar o feixe de elétrons. </li><li> Visualmente avaliar a amostra com pequeno aumento, normalmente 250X, e baixa iluminação. Tal como ilustrado na Figura 1, as secções deve ser fino e suave, não dobradas ou sobrepostas, liso e bem ligados à película de suporte, e, geralmente, não tapada por barras de grelha. </li><li> Opcionalmente fotografar seções selecionadas. (NOTA: Evite a exposição do feixe, desde cortes congelados hidratado são muito suscetíveis a danos induzidos por feixe.) Use o palco automatizado goniômetro digital para armazenar coordenadas de seções selecionadas. </li></ol> 5. Liofilização de Seções <ol><li> Liofilizar secções, aumentando a temperatura até cerca de titular. -100 ° C durante ~ 30 min. </li><li> Recool titular a -160 ° C ou abaixo. </li><li&gt; Antes de imagem, desligue unidade de controle cryoholder e cabo do controlador fisicamente desconexão para evitar imagem deriva devido a ciclos térmicos e / ou vibração pickup. </li></ol> 6. Imagens de células e organelas Imagens estruturais das secções liofilizadas são obtidas em ca. -160 ° C como de baixa dose, imagens de perda de zero gravados digitalmente usando uma câmera CCD de varredura lenta 2k x 2k controlado por software apropriado. <ol><li> Ative o EM no modo de oi-mag. </li><li> Escolha e imagem em ~ 2000 X (como TIFF, veja a Figura 2), as células selecionadas e áreas subcelulares de interesse nas seções de alta qualidade cujas localizações foram previamente gravadas e armazenadas. (NOTA: As seções secas são agora bem menos frágil e menos suscetíveis a danos por feixe de elétrons. </li><li> Avaliar as imagens a fim de selecionar as regiões de interesse (ROIs) para análise de raios-X. Este passo pode opcionalmente ser realizado fora de linha, no caso em que a EM pode ser transformadodesligado e a amostra deixada aquecer até à temperatura ambiente. </li></ol> 7. Aquisição de X-ray Spectra Espectros de raios-X pode ser gravado usando qualquer um dos vários comerciais ou de design personalizado de raios-X sistemas de análise minimamente que consistem em um raio-X (EDX) detector de energia dispersiva, eletrônica pulso processadores associados e aquisição e exibição de software compatível. (O sistema utilizado neste laboratório é descrito na Tabela 1.) <ol><li> Configurar o EM para a aquisição de raios-X por inserção do detector de EDX para a coluna (se necessário), retirando-se o objectivo da abertura, e a inserção de centragem e quaisquer aberturas de radiação parasita. Ajustar o cryoholder à temperatura mais baixa a que a contaminação geada da amostra é evitada, mas, pelo menos, abaixo de -100 ° C. </li><li> Incline o suporte de 20 ° em direção ao detector. </li><li> Sob condições de imagem de campo amplo, e assumindo que se pretende analisar a matriz de uma individual mitocôndrias, escolha uma mitocôndria para análise, movê-lo para o centro do campo e se concentrar. </li><li> Ir para o modo local (em alguns microscópios apenas convergir o feixe usando segundo foco do condensador) e aumentar a corrente de feixe até ca. 3 nA (como medido com um copo de Faraday ou semelhante) para um local de 100 nm. </li><li> Inicie o software de aquisição de espectro e começar a 100 aquisições segundo, que podem ser vistos tempo real no monitor de visualização. Guardar espectro registada (Figura 2). O formato EMSA padrão da indústria é o preferido. </li><li> Desligue o EM e transferir o arquivo (s) de múltiplos espectros para um (offline) workstation análise. </li></ol> 8. Análise de raios X Os espectros A análise qualitativa Um espectro de EDX (Figura 2, inserção) é, essencialmente, uma trama xy da intensidade dos raios-X versus a energia. Spectra conter informações qualitativas e quantitativas sobre a composição elementar de tele analisou o volume, em que a energia &quot;característica&quot; de um pico identifica o elemento que dá origem a esse pico, enquanto a intensidade reflete a quantidade desse elemento. Os picos característicos montar na parte superior de um fundo que varia lentamente, o &quot;contínuo&quot;. (A legenda da Figura 2 discute mais detalhes salientes de espectros de EDX.) A energia de pico para os colectores de toda a tabela periódica são definidos pela estrutura electrónica bem conhecido dos elementos, assim, todas as ligações de software EDX para uma base de dados que identifica automaticamente os componentes de um analito. Em um contexto fisiológico, os elementos de interesse geral que estão bem adaptados à análise EDX incluem Na (K α em 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV) e Ca (3,69 keV). <ol><li> Aproveite banco de dados de software disponíveis e rotinas de pico correspondentes para identificar os principais elementos nos espectros. Em uma amostra biológica esperar encontrar picos de Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca e. (ATENÇÃO:Os dois últimos elementos se sobrepõem!) </li></ol> A análise quantitativa A análise quantitativa do espectro de EDX consiste em extrair a área integrada dos picos identificados e converter este valor para uma concentração. Para análise biológica, a abordagem é estabelecido o método de pico / contínuo Municipal 4,7,10, que tira partido do facto de que a intensidade do contínuo (definido acima e na Figura 2) é proporcional à massa seca do volume analisado . Assim, a relação da área de superfície / contínuo pico, quando em comparação com a mesma proporção em espectros de padrões de composição conhecida, especifica a concentração no compartimento celular alvo. Note-se que esta abordagem proporciona concentrações em unidades de moles por peso, geralmente expresso como mmol / kg de peso seco. Esta unidade é incomum e de interpretação podem exigir conversão adicional de, por exemplo, mmol / l de peso molhado ou mmol / mg proteína, como descrito elsewhere 4,10. <ol start="2"><li> Extrair as áreas de pico (e estimativas de erro) de elementos biológicos entre Z = 10-20 (0,5-4,0 keV), isto é, Na, Mg, P, S, Cl, K e Ca, usando uma das rotinas de ajuste construído em software de análise (ver Tabela 1, especialmente a nota 4). Este laboratório usa Simplex ou múltipla dos mínimos quadrados montagem. Note-se que este ajuste requer muita atenção para resolver a sobreposição entre K e Ca picos (ver Figura 2). </li><li> Integrar o continuum entre 1,45-1,61 keV. Regiões alternativa livre de interferência podem ser usados. </li><li> Calcular os rácios de pico / contínuo e depois concentrações por comparação com padrões. Propagar erros durante toda a análise. </li><li> Use software e fórmulas estatística padrão para calcular as médias que refletem a variabilidade biológica. </li></ol>

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</ol>

Os autores relatam nenhum conflito de interesse.

O método analítico baseado em microscópio electrónico aqui apresentada permite a detecção, identificação, quantificação e de vários elementos de interesse biológico, incluindo Na, K, P, e especialmente Ca. Estas análises podem ser realizadas em subcelular, por exemplo, intra-organelos, a resolução devido à possibilidade de localizar e identificar as estruturas de interesse nas imagens de criocortes preparados a partir de amostras rapidamente congelados de elevada qualidade. Note que nenhuma coloração é necessár...

Os íons de cálcio são, indiscutivelmente, a entidade sinalização celular mais importante e versátil em biologia, desempenhando um papel essencial nos processos normais tão diversas como a transmissão sináptica e expressão gênica. Por outro lado, o cálcio é igualmente importante na morte celular. Em particular, a desregulamentação de cálcio é um fator-chave na lesão neuronal no AVC, Parkinson, Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas 3,5. Assim, é extremamente importante para entender quantitativamente como o cálcio é distribuído no interior das células, e como isso muda após estímulos fisiológicos ou fisiopatológicos. Este objectivo é complicada pelo facto de que o cálcio é distribuído de forma dinâmica entre dois estados físicos - livre em solução ou ligada a um substrato - e que as concentrações de cálcio celular mudar ao longo de várias ordens de grandeza, como consequência da estimulação. Embora existam vários métodos avançados disponíveis para a análise de free de cálcio intracelular, a determinação das concentrações de cálcio total em compartimentos intracelulares definidos é realisticamente limitados a uma abordagem, isto é, electrões microanálise (EPMA). EPMA é uma técnica que os casais um espectrômetro de raios-X de um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). O canhão de elétrons TEM foca, uma sonda de elétrons submicron parado em uma região subcelular de interesse e os raios-X específicos do elemento emitidas como resultado do bombardeio de elétrons são coletados e analisados ​​(ver referências 7, 4 para análises técnicas detalhadas). Vantagens de EPMA incluem resolução de nível organela única e sensibilidade submillimolar. Na prática, no entanto, requer técnicas de criofixação EPMA especializados e instrumentação para a preparação e análise de amostras. Aqui, são descritas as ferramentas, técnicas e instrumentos adequados para a medição de cálcio intracelular utilizando EPMA. Cálcio intramitocondrial é de i especialnterest em conta o papel fundamental que mitocondriais execuções de sobrecarga de cálcio em doenças neurodegenerativas.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS/MATERIALS</td></tr><tr><td>Thermanox lamínulas de plástico</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>72280</td><td></td></tr><tr><td>Inserções de cultura</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>Para placas de 6 poços</td></tr><tr><td>Criopinas</td><td>Leica Microsystems</td><td>16701952</td><td></td></tr><tr><td>aplicadores de madeira</td> ranhurada <td>EM Sciences</td><td>72300</td><td></td></tr><tr><td>Grades EM dobráveis</td><td>Ted Pella</td><td>4GC100 / 100</td><td>100 mesh</td></tr><tr><td>Folha de índio</td><td>Alfa Aesar</td><td>13982</td><td>0,25 mm de espessura</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Dispositivo de congelamento por imersão</td><td>Leica Microsystems</td><td>KF-80</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de congelamento</td><td>LifeCell</td><td>CF-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrótomo</td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Cryoattachment para micrótomo</td><td>Leica Microsystems</td><td>FC6</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de criocorte de diamante</td><td>Diatome</td><td>Cryotrim 45</td><td></td></tr><tr><td>Faca criocortadora de diamante</td><td>Diatome</td><td>Cryo 35</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo antiestático</td><td>Diatome</td><td>Hauf Linha</td><td></td>Estática</tr><tr><td>Microscópio eletrônico criogênico</td><td>Carl Zeiss Microscopia</td><td>EM912 Omega</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de amostra criogênica EM</td><td>Gatan</td><td>CT3500</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD de varredura lenta, 2k x 2k</td><td>Troendle (TRS)</td><td></td> Software de aquisição de imagem Olympus <td></td></tr><tr><td></td><td>SIS</td><td>iTEM suite</td><td></td></tr><tr><td>ED Detector de raios-x ED</td> Oxford <td>Instruments</td><td>Linksystem Processador</td> de pulso Pentafet <td></td></tr><tr><td></td><td>Oxford Instruments</td><td>XP-3</td><td></td></tr><tr><td>PCI backplane cartão</td><td>4pi Systems</td><td>Spectral Engine II</td><td></td></tr><tr><td>Computador de mesa</td><td>Apple</td><td>Qualquer modelo</td><td></td>compatível com OS9</tr><tr><td>Software de análise de raios-X</td><td>NIST</td><td>DTSA, DTSA II</td><td></td></tr><tr><td>Software de planilha</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <ol> <li>O CF100 não é mais vendido comercialmente, embora a máquina esteja disponível em muitas instalações acadêmicas, e máquinas ou peças completas podem ser encontradas on-line.</li> <li>Um tutorial em vídeo para o suporte de criotransferência CT3500 está disponível em <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li> <li>O SEII está obsoleto; o Universal Spectral Engine É um produto posterior compatível com PC com funcionalidade comparável. A 4pi cessou a fabricação e as vendas, mas ainda fornece suporte técnico ao cliente. Os sistemas usados são frequentemente encontrados online.</li> <li>O DTSA original agora está obsoleto. O NIST oferece em domínio público um sucessor atualizado, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li> </ol> </td></tr></tbody></table>

medição de cálcio total em neurônios por electron probe x-ray microanálise

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Neste artigo as ferramentas, técnicas e instrumentos adequados para medidas quantitativas de conteúdo elementar intracelular utilizando a técnica conhecida como microanálise eletrônica (EPMA) são descritos. Cálcio intramitocondrial é um foco especial por causa do papel crítico que a sobrecarga de cálcio mitocondrial desempenha nas doenças neurodegenerativas. O método baseia-se na análise de raios-X produzidos por um microscópio electrónico (EM) por interacção de um feixe de electrões com o espécime. A fim de manter a distribuição natural de elementos difusíveis em amostras de microscopia electrónica, EPMA requer &quot;criofixação&quot; de tecido, seguido pela preparação de criocortes ultrafinos. Congelamento rápido das células em cultura ou culturas organotípicas de fatias é realizada por imersão em etano líquido de congelação ou de congelação por bater contra um bloco de metal fria, respectivamente. Criosecções nominalmente 80 nm de espessura são cortadas seco, com uma faca de diamante em ca. -16076: C, montado no / grelhas de cobre revestidas com carbono pioloform, e cryotransferred num crio-EM usando um suporte cryospecimen especializado. Depois de inspecção visual e de mapeamento de localização no ≤ -160 ° C, e dose baixa de electrões, criocortes congeladas-hidratado são a -100 ° C durante ~ 30 min liofilizada. Imagens de nível Organelle de criosecções secos são registrados, também em baixas doses, por meio de uma câmera CCD-scan lento e regiões subcelulares de interesse selecionadas para análise. Raios-X emitidos por ROIs por um, focado, sonda de elétrons de alta intensidade estacionário são recolhidos por um raio-X de energia dispersiva (EDX) espectrômetro, processada pela eletrônica associados, e apresenta-se como um espectro de raios-X, ou seja, um lote de intensidade dos raios-X vs energia. O software adicional facilita: 1) identificação dos componentes elementares por suas &quot;características&quot; energias de pico e de impressões digitais e 2) análise quantitativa por extração de áreas de pico / fundo. Este artigo termina com dois exemplos que ilustram típicoAplicações EPMA, aquele em que a análise mitocondrial de cálcio fornecidos uma visão crítica sobre os mecanismos de lesão excitotoxic e outro que revelaram a base da resistência isquemia.

As células do cérebro tipicamente sustentar lesão excitotoxic como resultado da liberação de neurotransmissores patológico que ocorre em condições de isquemia. EPMA foi fundamental para descobrir como a capacidade das mitocôndrias neuronais de sequestrar grandes quantidades de cálcio subjacente ao mecanismo de lesão. A fotografia de microscopia electrónica na Figura 3 ilustra o aparecimento de mitocôndrias nos criocortes liofilizados de neurónios do hipocampo em cultura rapidamente congelados após 30 mi...

Este artigo descreve a aplicação de microscopia eletrônica cryoanalytical para a medição quantitativa de teor de cálcio total e distribuição em resolução subcelular em espécimes biológicos fisiologicamente definidos.

Medição de cálcio total em neurônios por Electron Probe X-ray Microanálise

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

O objetivo geral deste procedimento é usar microscopia eletrônica analítica para medir quantitativamente a concentração de elementos biologicamente importantes, como cálcio, em resolução subcelular em neurônios cultivados. Isso é feito primeiro congelando rapidamente as culturas de células vivas e preparando seções criogênicas ultrafinas. O segundo passo é transferir seções criogênicas para um microscópio eletrônico analítico e liofilizá-las.As próximas imagens e espectros de raios-x são necessários de regiões subcelulares selecionadas, incluindo mitocôndrias neuronais. A etapa final é analisar quantitativamente os espectros de raios-x para determinar as concentrações elementares localizadas. Em última análise, essa abordagem conhecida como EPMA é usada para revelar mudanças nas concentrações e distribuição de cálcio subjacentes à sinalização intracelular de cálcio.A principal vantagem desta técnica sobre métodos relacionados, como fluorescência, microscopia, captação de radioisótopos ou fotometria de chama, é a resolução de nível de organela única e a sensibilidade submilimolar. Demonstrando o procedimento estará a Dra. Natalia pva, uma cientista sênior da equipe de nosso laboratório. Para começar, prepare um banho de congelamento condensando etano gasoso a 160 graus Celsius negativos no poço central de um sistema resfriado a nitrogênio líquido.Em seguida, seque a borda de uma lamínula contendo células aderidas para remover tudo, exceto uma fina película de líquido. Tome cuidado para não secar a amostra. Em seguida, segure a lamínula pela borda e mergulhe rapidamente a amostra no etano líquido.Após dois a três segundos, remova a lamínula do etano e coloque-a em uma tigela de isopor com transferência de nitrogênio líquido. A tampa congelada desliza para um micrótomo criogênico pré-resfriado a 135 graus Celsius negativos. Corte as lamínulas congeladas em quadrados de três milímetros por três milímetros usando um bisturi pré-resfriado afiado.Em seguida, incorpore-os voltados para cima em um pino de alumínio de três milímetros de diâmetro em uma mistura de cola criogênica que consiste em uma parte de etanol e seis partes. Isopropanol. Solidifique a cola criogênica diminuindo a temperatura da caixa criogênica para 160 graus Celsius negativos. Em seguida, apare as áreas ricas em células da peça de lamínula para uma face de bloco de aproximadamente 250 por 250 mícrons e profundidade de 100 mícrons.Usando uma ferramenta de corte de diamante, corte fitas a seco de seções finas a 160 graus Celsius negativos usando uma faca criogênica de diamante de 35 graus, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, transfira as seções para a forma de pérola revestida de carbono descarregada com brilho. Filmes de suporte fundidos sobre 100 grades de cobre dobráveis de malha em um envelope de índio aberto.A grade está fechada. Em seguida, o envelope e o sanduíche pressionados com uma ferramenta de prensagem resfriada antes da transferência criogênica das amostras para o microscópio eletrônico. Resfrie o suporte criogênico até sua temperatura mínima de pelo menos 160 graus Celsius negativos enquanto estiver sob alto vácuo dentro do microscópio stage.Em seguida, incline o goniômetro 45 graus no sentido horário e remova o suporte. Transfira rapidamente o suporte criogênico resfriado do microscópio para a estação de trabalho criogênica resfriada e retraia a proteção contra congelamento do suporte. Em seguida, transfira a amostra para o suporte criogênico.Prenda a grade com o anel de retenção usando a ferramenta de chave fornecida e feche a proteção contra congelamento. Em seguida, remova rapidamente o suporte criogênico da estação de trabalho criogênica e insira-o na câmara de ar do microscópio. Percorra a sequência de bombeamento o mais rápido possível com o suporte criogênico de amostra no lugar.Retorne o goniômetro para uma inclinação de zero grau. Reconecte e reenergize a caixa de controle e confirme se a temperatura da amostra é menor ou igual a 150 graus Celsius negativos. Finalmente, reabasteça o fazedor do porta-amostras e permita que o vácuo e a temperatura se recuperem totalmente.Primeiro, avalie visualmente a amostra com ampliação de 250 vezes e baixa iluminação. As seções selecionadas devem ser finas e lisas, não dobradas ou sobrepostas. Eles também devem ser planos, bem presos ao filme de suporte e geralmente não obscurecidos por barras de grade.Use o estágio do goniômetro digital para armazenar as coordenadas das seções selecionadas. Em seguida, aumente a temperatura do suporte para 100 graus Celsius negativos por 30 minutos para liofilizar as seções para estabilizá-las e melhorar o contraste. Em seguida, recue as amostras de volta para 160 graus Celsius negativos ou menos.Antes da imagem de alta resolução. Desligue a unidade de controle do suporte criogênico e desconecte fisicamente o cabo do controlador para evitar desvio de imagem devido ao ciclo térmico e/ou captação de vibração. Em seguida, ative o microscópio eletrônico no modo de alta ampliação.Pesquise regiões subcelulares com ampliação de cerca de 2000 vezes que estão dentro de seções selecionadas cujos locais foram armazenados anteriormente. Grave e armazene imagens TIFF de áreas promissoras. Em seguida, avalie as imagens para selecionar e anotar regiões de interesse para análise de raios-x.Uma vez selecionadas as regiões de interesse, configure o microscópio eletrônico para aquisição de raios-x inserindo o detector EDX na coluna, retirando a abertura da objetiva e inserindo e centralizando quaisquer aberturas de radiação parasita. Incline o suporte 20 graus em direção ao detector no modo de ponto. Aumente a corrente do feixe para cerca de três nano amperes, conforme medido em um ponto de 100 nanômetros.Em seguida, aumente a temperatura do suporte criogênico para 100 graus Celsius negativos ou menos para evitar contaminação por gelo em condições de imagem de campo amplo. Escolha uma mitocôndria para análise. Retorne ao modo spot.Inicie o software de aquisição de espectro e inicie as 102ª aquisições. Salve os espectros gravados no formato de arquivo EMSA padrão. Amostra suficiente de mitocôndrias em diferentes células para garantir um conjunto de dados estatisticamente significativo.Para analisar qualitativamente um espectro EDX, utilize um banco de dados de software disponível e uma rotina de correspondência de pico, como DTSA, para identificar os principais elementos nos espectros. Identifique os elementos pelas posições de energia características de seus picos. As amostras biológicas geralmente contêm sódio, cassio, fósforo, enxofre, cloro, potássio e cálcio.Preste atenção extra aos picos de cálcio e potássio, pois eles se sobrepõem para análise quantitativa. Comece extraindo a área integrada dos picos identificados usando qualquer um dos vários algoritmos de ajuste padrão, como o método simplex incorporado ao DTSA, em seguida, estime a massa seca integrando o continuum entre 1,45 e 1,61 quilo elétron-volts. Regiões livres de interferência alternativas, por exemplo, 4,0 a 5,0 quilo elétron-volts podem ser usadas para evitar sinais não biológicos estranhos na região do contínuo primário.Finalmente, calcule as proporções de pico sobre contínuo e converta em concentrações em comparação com os padrões. Essa abordagem é conhecida como método de pico de hall sobre contínuo. Aqui é mostrada uma micrografia de um neurônio do hipocampo cultivado, rapidamente congelado após a exposição a um estímulo citotóxico, que leva à abertura de canais iônicos e cálcio em fluxo.A maioria das mitocôndrias mostradas aqui parece estruturalmente danificada, pois estão altamente inchadas e contêm inclusões pequenas e escuras. A microanálise por sonda eletrônica foi então usada para realizar análises elementares dentro e excluindo as inclusões mitocondriais. O estudo revelou que as inclusões são compostas em grande parte por quantidades extremamente altas de cálcio e fósforo.Isso explica sua extraordinária capacidade de tamponamento de cálcio e por que sobrecarregar esse mecanismo de tamponamento leva à sobrecarga de cálcio desencadeou a morte celular. O hipocampo, uma área do cérebro crítica para o aprendizado e a memória, é um dos principais locais de lesão após a isquemia. A região funcionalmente distinta denominada CA três é muito menos vulnerável à lesão isquêmica do que a microanálise de sonda eletrônica de ca uma região adjacente sinapticamente conectada após estímulos tóxicos dessas fatias mostrou elevações de cálcio muito maiores em neurônios CA um vulneráveis do que em neurônios CA três resistentes.Consequentemente, as mitocôndrias CA um exibem lesão e disfunção extensas, indicando que a disfunção mitocondrial induzida por sobrecarga de cálcio é um fator determinante na vulnerabilidade seletiva dos neurônios CA one. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a concentração de cálcio total em mitocôndrias individuais de neurônios culturais usando microanálise por sonda de coleta.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Demonstramos como alterações na concentração do cálcio intracelular livre e eficácia sináptica podem ser monitorizados simultaneamente num gânglio de...

Alterações de monitoramento da concentração de cálcio intracelular e eficácia sináptica no Molusco<em&gt; Aplysia</em

Este vídeo apresenta os conceitos por trás da imagem de cálcio e inclui um protocolo de exemplo para imagem de lapso de tempo de vermes contidos em poços de agarose moldados.

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Com o seu pequeno corpo transparente, neuroanatomia bem documentado e uma série de técnicas genéticas passíveis e...

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

Os procedimentos são descritos para realizar registros simultâneos do potencial ou corrente de membrana e alterações da concentração de cálcio intracelular. Os neurônios do núcleo supraquiasmático são preenchidos com o indicador de cálcio bis-fura-2 usando um eletrodo de patch clamp na configuração de patch clamp de célula inteira.

Registro eletrofisiológico simultâneo e imagem de cálcio de neurônios do núcleo supraquiasmático

Apresentamos um método combinando dois fotões de imagem para gravar transientes de Ca2 + em dendritos neuronais em fatias cerebral aguda e gravações de células inteiras remendo-braçadeira.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Apresentamos um protocolo de duas partes que combina imagens fluorescentes de cálcio com hibridização in situ, permitindo que o experimentador correlacione padrões de atividade de cálcio com perfis de expressão genética em um nível unicelular.

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

O protocolo descreve o método de carregar um corante de cálcio fluorescente através do nervo cortado em terminais nervosos motores do rato. Além disso, é apresentado um método único para o registro de transintes rápidos de cálcio nas terminações nervosas periféricas usando microscopia confocal.

Registro de Transintes de Cálcio na Junção Neuromuscular do Rato com Alta Resolução Temporal utilizando Microscopia Confocal

Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

O protocolo proposto envolve uma abordagem global para avaliar a formação óssea no contexto da regeneração óssea usando análises multimodais. Tem como objetivo fornecer informações qualitativas e quantitativas sobre a nova formação óssea, aumentando o rigor e a validade das investigações básicas e pré-clínicas.

Caracterização abrangente da mineralização tecidual em um modelo ex vivo

Aprenda a medir cálcio total em neurônios cultivados usando microanálise por sonda eletrônica de raios X. Esta técnica de criomicroscopia eletrônica permite análise quantitativa em resolução subcelular.

Medição de cálcio total em neurônios por Electron Probe X-ray Microanálise

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