Name: Usando Click Chemistry medir o efeito da infecção viral sobre a síntese de RNA do Host-Cell (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprenda a usar click chemistry para medir alterações na transcrição celular após infecção pelo vírus da febre do Vale do Rift. Este método não radioativo permite visualização por microscopia de fluorescência ou análise quantitativa por citometria de fluxo.

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Agradecemos RB Tesh para fornecer o mouse policlonal anti-RVFV soro e M. Griffin da UTMB Citometria de Fluxo Núcleo Facilidade para obter ajuda com citometria de fluxo. Este trabalho foi apoiado por cinco U54 AI057156 através do Centro Regional de Excelência Ocidental, NIH concessão R01 AI08764301 e financiamento do Centro de Sealy de Desenvolvimento de Vacinas no UTMB.BK foi apoiado pelo Fundo de W. James McLaughlin Fellowship em UTMB.OL foi apoiado por R. Hilleman Early-Stage Investigator Award Carreira Maurice.

Análise da transcrição por microscopia de fluorescência 1. Infectar as células com o MP-12 e etiqueta RNA nascentes com a UE <ol><li> Coloque lamínulas redondas de 12 mm na placa de cultura de tecidos de 12 poços, uma lamela por poço. </li></ol> Nota: Se as células têm dificuldade em aderir a lamelas, casaco com poli-L-lisina (≥ 70.000 MW), antes de colocar em poços. Para este objectivo, lamelas submersas numa solução estéril de 0,1 mg / mL em H2O de poli-L-lisina, durante 5 min. Enxágüe com lamelas estéril H 2 O e ar seco por pelo menos 2 horas. <ol start="2"><li> Para semear as células 293 em lamelas, adicionar 4 de 5 x 10 células em 1 ml de meio de crescimento (DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 100 U / ml de penicilina e 100 mg / ml de estreptomicina) por poço. Incubar numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2 S / N. </li><li> Infectar as células com MP-12 a uma multiplicidade de infecção (moi) de 3. Inclua pelo menos duas<html> poços não infectados: um dos dois poços servirá como controlo não infectado, o outro será tratado com actinomicina D (ActD) no passo 1.5 como um controlo para a supressão transcricional. Remova o meio de crescimento e diluir o estoque de vírus de modo a que o volume total adicionado a cada poço é de 200 ml. Incubar durante 1 hora numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> Nota: Em vez de infectar as células, as células podem também ser transfectadas com ADN de plasmídeo ou de ARN sintetizado in vitro que codifica uma proteína viral específica. Para este objectivo, transfectar células com um reagente apropriado de transfecção química de acordo com as instruções do fabricante e prosseguir para a etapa 1.5 em 16 horas após a transfecção. É aconselhável para otimizar as condições de transfecção e tempo de incubação antes de rotulagem RNA e fixação. <ol start="4"><li> Remover inoculo e adicionar 1 ml de meio de crescimento fresco por poço. Incubar a 37 ° C durante 15 horas. </li></ol>ove_content &quot;&gt; Nota:. Se adaptar este protocolo para utilização com um outro vírus, é aconselhável realizar uma experiência de evolução no tempo para determinar o ponto de tempo óptimo para a rotulagem de RNA e fixação Definir este curso de tempo, de modo que os tempos de infecção são escalonados e todos As amostras podem ser marcados, fixadas e coradas no mesmo tempo. <ol start="5"><li> Aos 15 horas pós-infecção (hpi), substitua meio de crescimento com meio contendo 1 mM UE. Para um dos poços infectadas falsas, também adicionam-se 5 ug / ml de ActD. Isto servirá como controle para a supressão da transcrição, como ActD inibe a síntese de ARN dependente de ADN. Retorno células na incubadora. </li><li> Aos 16 hpi, remover o meio e lava-se as lamelas uma vez com 1 ml de PBS (KCI 0,20 g / l, KH 2 PO 4 0,20 g / L, NaCl a 8,00 g / L, Na 2 HPO 4 1,15 g / l, pH 7,4) por poço. Fixar as células por adição de 1 ml de 4% de paraformaldeído (PFA) por poço e incubando durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li></ol>Nota: Para preparar a solução de fixação PFA a 4%, dissolver 10 g de paraformaldeído em 150 ml de H2O aquecida a 60 ° C num agitador magnético aquecido. Adicionar 500 mL de NaOH 1M e continue a mexer até que a solução se torna claro. Filtrar a solução através de um filtro de PFA de papel para remover partículas e adicione 62,5 ml de tampão fosfato (77 mM de NaH 2 PO 4, 287 mM de Na 2 HPO 4, pH 7,4). Adicionar H 2 O para um volume total de 250 ml. Congelar a -20 ° C em alíquotas de uso único. <ol start="7"><li> Lavar uma vez com 1 ml de PBS por poço. Sem o tempo de incubação é necessário para este e todos os passos de lavagem subsequentes. Proceder de imediato para o passo 2. </li></ol> Nota: É importante a proceder imediatamente à reacção clique, como o RNA degenera se manteve nesta fase, por períodos prolongados de tempo, uma perda do sinal de fluorescência do RNA já pode ser observado se as células são mantidas durante 1 hora a 4 ° C, . De igual modo, se porformando um experimento de evolução no tempo, não se esqueça de etiqueta, corrigir e mancha todas as amostras ao mesmo tempo. 2. Clique reação para detectar RNA Rotulado <ol><li> Permeabilizar células por adição de 1 ml de 0,2% de Triton X-100 em PBS. Incubar durante 10 minutos à RT. </li></ol> Nota: Todas as soluções usadas nos passos 2.1 e 2.3 devem ser livre de nuclease. <ol start="2"><li> Lavar três vezes com 1 ml de PBS por poço. </li><li> Remover lamelas placa de 12 poços e para dentro da câmara de transferência de humidade. Cobrir cada lamela com 50 - solução de coloração clique 100 ul (100 mM Tris pH 8,5, CuSO4 1 mM, 20 mM de azida fluorescente [excitação / emissão máximo: 590/617 nm], ácido ascórbico a 100 mM) a cada. Incubar durante 1 h à RT, no escuro. </li></ol> Nota: Para montar a câmara húmida, a linha inferior de uma cultura de células ou de uma placa de Petri com um diâmetro de 10 cm com uma película de plástico de parafina. Forrar o interior da borda da dish com toalhas de papel úmidas. Coloque as lamelas sobre a película de plástico de parafina. Nota: Tenha cuidado para não deixar que as lamelas secar durante este ou qualquer outro passo no protocolo. É melhor adicionar a solução de coloração para cada lamela directamente depois de ter sido colocado na câmara de humidade. Nota: Preparar a solução de coloração clique fresco imediatamente anterior a esta etapa. As soluções de reserva de 1,5 M de Tris pH 8,5, 100 mM de CuSO 4, e 500 mM de ácido ascórbico pode ser armazenado a 4 ° C. No entanto, descartar qualquer solução de ácido ascórbico, que tornou-se amarelo. Nota: Certifique-se de selecionar um fluoróforo que coincide com os filtros em seu microscópio fluorescente. <ol start="4"><li> Remover lamelas de câmara úmida e coloque em uma placa de 12 poços fresco e lavar três vezes com 1 ml de PBS por poço. </li></ol> Nota: Se nenhum deprotecção das proteínas virais é desejada, lamelas pode ser montado e fotografada após este passo (avançar para o passo 3.3.) 3. Imunofluorescência para detectar a expressão de proteínas virais <ol><li> Adicionar 1 ml de tampão de bloqueio (3% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA) em PBS) a cada poço e incubar durante 30 min à RT, no escuro. </li><li> Remover lamelas placa de 12 poços, a transferência para a câmara húmida e cobrir com 50-100 jul de anticorpo primário (anti-RVFV, uma simpática oferta do Dr. RB Tesh, UTMB), diluídas em tampão (1:500) de bloqueio. Incubar durante 1 h à RT, no escuro. </li></ol> Nota: Quando este protocolo de adaptação para o uso com um vírus diferente, determinar a diluição óptima para o seu primeiro anticorpo primário. Observação: Como alternativa, este passo pode ser realizado de O / N a 4 ° C no escuro. <ol start="3"><li> Remover lamelas de câmara úmida e coloque de volta na placa de 12 poços e lavartrês vezes com 1 ml de PBS por poço. </li><li> Remover lamelas de 12 poços lugar, o local em câmara húmida e cobrir com 50-100 uL de anticorpo secundário (anti-IgG de ratinho conjugado com corante fluorescente [excitação / emissão máximo: 495/519 nm]) diluído em tampão de bloqueio (1: 500). Incubar durante 1 h à RT, no escuro. </li></ol> Nota: Certifique-se de selecionar um anticorpo secundário que pode reconhecer o seu anticorpo primário e coincide com os filtros em seu microscópio fluorescente. Nota: Se for desejado, 200 ng / ml de DAPI podem ser adicionados à diluição do anticorpo secundário para visualizar núcleos. <ol start="5"><li> Remover lamelas da câmara húmida e local de volta para placa de 12 poços e lava-se três vezes com 1 ml de PBS por poço. </li><li> Monte lamelas, colocando uma gota (ca. 15 mL) de Fluoromount-G em uma lâmina de microscópio. Mergulhar o lamela em H2O, remover o excesso de H 2 O, tocando thlado e contra uma toalha de papel e coloque do lado do celular para dentro da gota de Fluoromount-G. Secar ao ar durante 5 min. </li></ol> Nota: Se a imagem em um microscópio invertido, permitir Fluoromount-G para solidificar a 4 ° CO / N ou apor as lamelas para a lâmina de microscópio, selando a borda com unha polonês transparente. Nota: As lâminas podem ser visualizados de imediato ou armazenados a 4 ° C no escuro até uma semana. 4. Aquisição de Dados <ol><li> Imagem usando um microscópio fluorescente. </li></ol> Nota: Certifique-se de selecionar fluorophores adequadas que podem ser visualizadas através de seu microscópio. Para referência, são os seguintes os fluoróforos e conjuntos de filtros usados ​​para adquirir as imagens apresentadas nesta publicação. DAPI: Filtro de excitação: BP 330-385 Dichromatic espelho: 400 DM Filtro de emissão: LP 420 Filtro de excitação: BP 460-490 Dichromatic espelho: 505 DM Filtro de emissão: LP 510 Fluoróforo com uma excitação / emissão máxima de 590/617: Filtro de excitação: BP 545-580 Dichromatic espelho: 600 DM Filtro de emissão: LP 610 Análise de citometria de fluxo por transcrição 5. Infectar as células com o MP-12 e etiqueta RNA nascentes com a UE <ol><li> Semente de células 293 em placas de cultura de tecidos de 6 poços em meio de crescimento (DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina). Incubar numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2, até que as células tenham atingido 80 - 100% de confluência. </li><li> Infectar as células com MP-12 a uma moi de 3. Incluir pelo menos dois dos poços não infectados: um dos dois poços servirão como controlo não infectado, o outro será tratado com ActD no passo5.4. Remova o meio de crescimento e diluir o estoque de vírus de modo a que o volume total adicionado a cada poço é de 400 uL. Incubar durante 1 hora numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Remover inoculo e adicionar 2 ml de meio de crescimento fresco por poço. Incubar a 37 ° C durante 12 horas. </li></ol> Nota: Se a adaptação deste protocolo para utilização com um outro vírus, é aconselhável realizar uma experiência de evolução no tempo para determinar o ponto de tempo óptimo para a rotulagem e colheita. Estabelecer esta evolução no tempo de modo a que os tempos de infecção são escalonados e todas as amostras podem ser marcados, colhidas e coradas ao mesmo tempo. <ol start="4"><li> Aos 12 hpi, substitua meio de crescimento com meio contendo UE 0,5 mM. Para um dos poços infectadas falsas, também adicionam-se 5 ug / ml de ActD. Isto servirá como controle para a supressão da transcrição, como ActD inibe a síntese de ARN dependente de ADN. Retorno células na incubadora. </li><li> Aos 13 hpi, lave as células uma vez a sagacidadeh PBS e colheita das células por tripsinização. Lave as células colhidas três vezes com PBS contendo EDTA a 1 mM (PBS-EDTA). </li></ol> Nota: Durante este e os passos subsequentes, não centrifugar células mais rápido do que 500 - 1000 xg para evitar a ruptura da célula. Centrifugar células para 1 - 2 min de sedimentos. Nota: Se um immunostaining superfície está prevista após a reação click, colheita usando um policial de borracha ou raspador de células descartáveis ​​vez. <ol start="6"><li> Fixar as células por ressuspensão em 1 ml de 4% de PFA e incubar durante 30 min à TA. Consulte o passo 1.6 para obter instruções sobre como preparar PFA 4%. </li><li> Lavar uma vez com 1 ml de PBS-EDTA por cavidade. Prossiga imediatamente para a etapa 6. </li></ol> Nota: É importante a proceder imediatamente à reacção clique, como o RNA degenera se manteve nesta fase, por períodos prolongados de tempo. Do mesmo modo, se executar um tempo cexperiência ourse, não se esqueça de etiquetar, corrigir e mancha todas as amostras ao mesmo tempo. 6. Clique reação para detectar RNA Rotulado <ol><li> Permeabilizar células por ressuspensão em 0,5 ml de 0,2% de Triton X-100 em PBS. Incubar durante 10 minutos à RT. </li></ol> Nota: Todas as soluções usadas nos passos 6,1-6,3 necessidade de ser livre de nuclease. Nota: Se as células não sedimentos adequadamente durante esta etapa, aumenta o tempo de centrifugação de 5 min. Comportamento de sedimentação irá melhorar quando as células são suspensas em tampão FACS (passo 6.4). <ol start="2"><li> Lavar uma vez com 1 ml de PBS. </li></ol> Nota: Não use EDTA nesta etapa, pois isso quelar o Cu 2 + íons necessária para a reação clique. <ol start="3"><li> Ressuspender as células em 200 ul de solução de coloração clique (Tris 100 mM pH 8,5, CuSO4 1 mM, azida de 200nM marcado com corante fluorescente [excacreditação / emissão máximo: 650/665 nm], ácido ascórbico a 100 mM). Incubar durante 1 h à RT, no escuro. </li></ol> Nota: Preparar a solução de coloração clique fresco imediatamente anterior a esta etapa. As soluções de reserva de 1,5 M de Tris pH 8,5, 100 mM de CuSO 4, e 500 mM de ácido ascórbico pode ser armazenado a 4 ° C. No entanto, descartar qualquer solução de ácido ascórbico, que tornou-se amarelo. Nota: Se as células se agregam durante esta etapa, ressuspender pipetando cima e para baixo várias vezes. Nota: Certifique-se de selecionar um fluoróforo que pode ser detectado pelo citômetro de fluxo. Nota: se preparar também uma amostra de células não infectadas que são submetidos ao processo de coloração clique, estes irão ser necessários para a calibração do citómetro de fluxo. Ou utilizar metade das células infectadas, ou incluir um poço adicional infectadas no passo 5.2. Estes controlo células serão imunocoradas no passo 7.1. <ol start="4"><li> Lavar duas vezes com tampão FACS (PBS contendo EDTA 1 mM e 0,5% (w / v) BSA). </li></ol> Nota: Se nenhum imunomarcação de proteínas virais é desejado, as células podem ser analisadas imediatamente (prosseguir para o passo 8). 7. Imunofluorescência para detectar a expressão de proteínas virais <ol><li> Ressuspender as células em 200 ul do anticorpo primário (anti-RVFV) diluído em tampão de SCAF (1:10.000) e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro. </li></ol> Observação: Como alternativa, este passo pode ser realizado de O / N a 4 ° C no escuro. Nota: se preparar também uma amostra de células não infectadas, que foram submetidas ao procedimento de coloração clique, mas não vai ser corada, estes irão ser necessários para a calibração do citómetro de fluxo. Ou utilizar metade das células infectadas por simulação ou incluir um poço adicional não infectadas empasso 5.2. Nota: Quando este protocolo de adaptação para o uso com um vírus diferente, determinar a diluição óptima para o seu primeiro anticorpo primário. <ol start="2"><li> Lave as células duas vezes em tampão de SCAF. </li><li> Ressuspender as células em 200 uL de anticorpo secundário (anti-IgG de ratinho conjugado com corante fluorescente [excitação / emissão máximo: 495/519 nm]) diluído em tampão de SCAF (1:1.000) e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lave as células uma vez em tampão de FACS. </li></ol> Nota: Neste ponto, as células podem ser armazenadas O / N a 4 ° C no escuro. 8. Aquisição de Dados <ol><li> Ressuspender as células em 500 ul de tampão de FACS, transferência para tubos de 5 ml e analisam poliestireno, utilizando um citómetro de fluxo. Utilize-12 MP células infectadas (nenhum clique reacção, só a coloração anti-RVFV) e células infectadas simuladas (click reacção apenas) para calibrar o instrumento. </li></ol> Nãoe: Não se esqueça de selecionar fluorophores adequadas que podem ser detectados por seu instrumento. Para referência, são as seguintes as linhas de laser e conjuntos de filtros utilizados para obter os dados mostrados nesta publicação. Com um fluoróforo de excitação / emissão de espectro de 495/519: Laser: 488 nm Filtro: 530/30 Com um fluoróforo de excitação / emissão de espectro de 650/665: Laser: 640 nm Filtro: 670/20

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Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo fornecido descreve um método para medir o efeito da infecção virai em transcrição da célula hospedeira através da incorporação do análogo de uridina UE em ARN nascentes. Este método possui várias vantagens sobre os métodos anteriores: é rápido, sensível e que não contam com a utilização de isótopos radioactivos. Além disso, o método pode ser adaptado para se obter dados qualitativos através de microscopia de fluorescência ou de dados quantitativos através de citometria de fluxo, utilizando essencialmente os ...

<html> Tradicionalmente, a actividade de transcrição foi medida através da incorporação de qualquer radioactivos (3 H-uridina) 1 ou halogenados (BRU) em dois nucleósidos de ARN nascentes. Estes análogos de uridina são absorvidos pelas células, convertida em uridina-trifosfato (UTP), através da via de recuperação de nucleósido, e subsequentemente incorporada no ARN recém-sintetizado. 3H-uridina pode ser detectada por auto-radiografia, o que pode ser demorado, ou cintilação de contagem, o que requer equipamento especializado. Além disso, a utilização de isótopos radioactivos podem não ser prático em um certo número de configurações de laboratório, incluindo os de alta laboratórios biossegurança contenção. BrU pode ser detectada através de coloração imunológica com anticorpos anti-Bru, que podem exigir a permeabilização duras para garantir o acesso do anticorpo ao núcleo parcial ou desnaturação do ARN, com a estrutura secundária do ARN pode ser um impedimento estereoquímico à ligação de anticorpos. _content &quot;&gt; O protocolo aqui descrito utiliza a recentemente desenvolvida clique química 3 para medir a actividade de transcrição em células infectadas com a estirpe RVFV MP-12. Instruções química baseia-se num cobre altamente selectivo e eficiente (I) catalisada por reacção de cicloadição entre um e alcino uma porção de azida de 4,5. Neste protocolo, o ARN nascentes em células infectadas é rotulado pela primeira vez através da incorporação de uridina analógico UE. Num segundo passo, o UE incorporado é detectado por meio de reacção com um azeto fluorescente. As principais vantagens deste método são (1) que não requerem a utilização de isótopos radioactivos e (2), que não requer a permeabilização dura ou desnaturação do ARN. Com um peso molecular de menos de 50 Da, o acesso da azida fluorescente não é impedida por insuficiente estrutura secundária permeabilização ou RNA. Além disso, os pesquisadores não estão limitadas na sua escolha de anticorpos primários ao combinar a detecção de ARN com uma classeimmunostaining iCal para proteínas virais. Dois métodos diferentes são descritas neste protocolo: uma para a visualização de transcrição através de microscopia de fluorescência (passos 1-4), e uma para quantificar a transcrição através de citometria de fluxo (passos 5-8). Ambos os métodos combinam rotulagem de ARN nascentes com uma imunocoloração intracelular para as proteínas virais, o que permite estabelecer uma correlação entre a actividade de transcrição e infecção viral numa base célula-por-célula. Os autores usaram com sucesso o protocolo aqui descrito para determinar a actividade de transcrição em células infectadas com a estirpe RVFV MP-12 6, as células infectadas com diferentes MP-12 mutantes 7,8, 9, e as células infectadas com o vírus da Toscana (TOSV) 10. O protocolo aqui descrito pode ser facilmente adaptado para ser utilizado com vírus diferentes e tem o potencial de ser modificado para incluir a coloração por imunofluorescência de proteínas virais ou celulares específicos.

<table><tbody><tr><td>5-etinil-uridina</td><td>Berry Associates</td><td>PY 7563</td><td>dissolver em DMSO para estoque de 100 mM</td></tr><tr><td>lamínulas redondas de 12 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Actinomicina D (ActD)</td><td>Sigma</td><td>9415</td><td>dissolver em DMSO para estoque de 10</td></tr><tr><td>mM Alexa Fluor 488 cabra anti-mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA) </td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2323</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>C-8027</td><td>dissolver em H2O para estoque de 100 mM</td></tr><tr><td>DAPI </td><td>Sigma</td><td>D-9542</td><td>dissolver em H2O para estoque de 5 mg/ml</td></tr><tr><td>DMEM </td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Azida fluorescente Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>(acoplada a Alexa Fluor 594)</td>Azida fluorescente <td>Invitrogen</td><td>A10270</td><td></td></tr><tr><td>(acoplada a Alexa Fluor 657)</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A-5960</td><td>dissolver em H2O para 500 mM </td></tr><tr><td>filtro de papel</td><td>VWRbrand</td><td>28333-087</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeído </td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina (MW &#8805; 70000)</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>dissolver em H2O para estoque de 1,5 M, pH 8,5</td></tr><tr>Microscópio <td>de</td> Fluorescência<td></td><td></td> de Tripsina-EDTA Invitrogen 25200056<td></td></tr><tr><td></td><td>e.g. Citômetro</td>de Fluxo Olympus IX71e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

usando click chemistry medir o efeito da infecção viral sobre a síntese de rna do host-cell

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Muitos vírus RNA evoluíram a capacidade para inibir a transcrição da célula hospedeira como um meio para contornar as defesas celulares. Para o estudo destes vírus, é, por conseguinte, é importante ter uma forma rápida e fiável de medir a actividade de transcrição em células infectadas. Tradicionalmente, a transcrição foi medida quer por incorporação de nucleótidos radioactivos tais como 3 H-uridina seguido por detecção através de autoradiograf ia ou contagem de cintilações, ou incorporação de análogos de uridina derivados halogenados tais como 5-bromouridine (BRU), seguido por detecção por imunocoloração. O uso de isótopos radioactivos, no entanto, exige equipamento especializado e não é viável em um certo número de configurações de laboratório, ao passo que a detecção de BrU pode ser complicado e pode sofrer de uma baixa sensibilidade. A química clique recentemente desenvolvidos, o que envolve uma formação de triazole catalisada por cobre a partir de uma azida e um alcino, proporciona agora uma rápida e highly alternativa sensíveis a estes dois métodos. Instruções química é um processo de dois passos em que ARN nascentes é rotulado pela primeira vez por incorporação do análogo de uridina 5-etiniluridina (UE), seguido de detecção do rótulo com uma azida fluorescente. Estas azidas estão disponíveis como vários fluoróforos diferentes, permitindo uma grande variedade de opções para visualização. Este protocolo descreve um método para medir a supressão de transcrição em células infectadas com o vírus da febre de Rift Valley (RVFV) estirpe MP-12, utilizando química do clique. Ao mesmo tempo, a expressão de proteínas virais nestas células é determinada por imunocoloração intracelular clássica. Etapas de 1 a 4 detalhar um método para visualizar supressão transcricional via microscopia de fluorescência, enquanto os passos 5 a 8 pormenor um método para quantificar a supressão da transcrição via citometria de fluxo. Este protocolo é facilmente adaptável para utilização com outros vírus.

A protea de NSS RVFV (Bunyaviridae família, género Phlebovírus) 11 inibe a transcrição geral da célula hospedeira através de dois mecanismos distintos: (i) por sequestrar a subunidade p44 do factor de transcrição basal TFIIH 11 e (ii), promovendo a degradação da p62 proteossômica subunidade de TFIIH 6. O RVFV MP-12 estirpe 13 de vacina tem sido usada para os experimentos descritos neste protocolo, desde MP-12 estirpe pode ser tratado em nível de laboratório d...

Este método descreve o uso de mouse química para medir as mudanças na transcrição da célula hospedeira após a infecção com o vírus da febre do Vale do Rift (RVFV) tensão MP-12. Os resultados podem ser visualizados por meio de microscopia de fluorescência qualitativamente ou quantitativamente, obtido através de citometria de fluxo. Este método é adaptável para utilização com outros vírus.

Usando Click Chemistry medir o efeito da infecção viral sobre a síntese de RNA do Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar a atividade transcricional em células infectadas por vírus. Primeiro, infecte as células 293 com o vírus da febre do Vale do Rift, MP-12. Em seguida, marque as células com o análogo de uridina 5-etiniluridina, que é incorporado ao RNA recém-sintetizado. Depois, acople a 5-etiniluridina incorporada a um azoto fluorescente para visualizar o RNA recém-sintetizado. Os resultados obtidos permitiram avaliar as diferenças na quantidade de RNA recém-sintetizado entre células infectadas e não infectadas, com base em microscopia fluorescente ou citometria de fluxo.Diferentemente da marcação com uridina tritiada ou uridina 5-bromo, esta abordagem de química click não requer o uso de isótopos radioativos. Também é mais rápida e sensível do que a imunomarcação com anti-uridina bromo. A ideia para este método surgiu da nossa necessidade de uma maneira rápida e confiável de medir a supressão da transcrição em células infectadas com diferentes cepas do vírus da febre do Vale do Rift, MP-12. Coloque lamínulas redondas de 12 milímetros em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços. Em seguida, semeie células 293 em um mililitro de meio DMEM completo. Incube as células em incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite. De acordo com o delineamento experimental, dilua o estoque viral de modo que a infecção das células com MP-12 ocorra com uma multiplicidade de infecção de três em um volume total de 200 microlitros por poço. Designe um poço como controle não infectado e outro como controle para supressão transcricional. Agora, remova o meio de crescimento. Adicione o inóculo viral e incube por uma hora na incubadora umidificada. Aspire o inóculo. Adicione um mililitro de meio de crescimento fresco por poço e incube a 37 graus Celsius. Após 15 horas pós-infecção, substitua o meio de crescimento por meio contendo um milimolar do análogo de uridina, 5-etinil-uridina. Em um dos poços infectados simuladamente, adicione também cinco microgramas por mililitro do inibidor da síntese de RNA dependente de DNA, actinomicina-D. Retorne as células à incubadora. Após 16 horas pós-infecção, remova o meio e lave as lamínulas uma vez com um mililitro de PBS por poço. Fixe as células com um mililitro de paraformaldeído a 4% por poço. Enxágue uma vez com um mililitro de PBS por poço.Para montar a câmara úmida, forre o fundo de uma placa de cultura celular ou de uma placa de Petri com diâmetro de 10 centímetros com filme plástico de parafina. Forre o interior da borda da placa com toalhas de papel umedecidas. Para permeabilizar as células, adicione um mililitro de Triton X-100 0,2% em PBS. Incube por 10 minutos à temperatura ambiente. Após três lavagens com PBS, transfira as lamínulas para a câmara úmida. Para a reação de "click" para detecção de RNA marcado, cubra cada lamínula com 50 a 100 microlitros de solução de marcação "click" recém-preparada. Incube por uma hora à temperatura ambiente, no escuro.Adicione um mililitro de PBS aos poços de uma nova placa de 12 poços e transfira as lamínulas para os poços. Lave mais duas vezes com um mililitro de PBS por poço. Para montar as células para microscopia de fluorescência, coloque uma gota de fluoromount-G em uma lâmina de microscopia. Mergulhe a lamínula na água, removendo o excesso de água. Posicione a lamínula com o lado das células voltado para baixo na gota de fluoromount G e deixe secar ao ar por cinco minutos.Conforme o delineamento experimental, infecte as células 293 com MP 12 a uma MOI de três. Remova o meio de crescimento e adicione o estoque viral diluído, incubando por uma hora em incubadora úmida a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Substitua o inóculo por dois mililitros de meio de crescimento fresco por poço e incube a 37 graus Celsius pelo tempo ideal para marcação e colheita viral. Em seguida, substitua o meio de crescimento por meio contendo 0,5 milimolar de 5-etinil-uridina em um dos poços mock infectados. Adicione também cinco microgramas por mililitro de actinomicina-D. Retorne as células à incubadora por uma hora. Após uma lavagem com PBS, colete as células por tripsinização. Lave as células coletadas três vezes com PBS contendo um milimolar de EDTA. Para fixar as células, re-suspenda o pellet em um mililitro de PFA 4% e incube por 30 minutos à temperatura ambiente. Lave uma vez com um mililitro de PBS-EDTA por tubo. Em seguida, permeabilize as células em 0,5 mililitros de Triton X-100 0,2% em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente. Lave uma vez com um mililitro de PBS livre de nucleases. Para a reação de "click", re-suspenda o pellet celular em 200 microlitros de solução de coloração contendo o corante fluorescente. Se as células aglomerarem, re-suspenda por pipetagem. Incube por uma hora à temperatura ambiente no escuro. Lave duas vezes com tampão FACS.Neste experimento, células 293 foram infectadas com o MP-12 e com um vírus mutante por deleção que não possui a capacidade de suprimir a transcrição da célula hospedeira. Nas células mock infectadas, os núcleos aparecem vermelho brilhante devido à transcrição em andamento. Como as células foram marcadas apenas com EU por uma hora, seguida de fixação imediata, a maioria dos RNAs permanece no núcleo. Em contraste, quando as células foram tratadas com Actinomicina-D para inibir farmacologicamente a transcrição, a fluorescência vermelha dos núcleos é acentuadamente reduzida. Essa fluorescência também é reduzida quando as células são infectadas com o MP-12, mas não com o mutante por deleção, que não suprime a transcrição do hospedeiro. Aqui, as células foram transfectadas com mRNA sintetizado in vitro, em vez de infectadas com o vírus vivo. O sinal fluorescente vermelho nos núcleos indica que, em comparação com células não transfectadas, as células transfectadas com mRNA codificando a proteína verde fluorescente não alteraram a atividade transcricional. Apenas a transfeção com mRNA codificando o fator de virulência NSs do vírus da febre do Vale do Rift resulta em diminuição da fluorescência vermelha. Quando quantificados, os dados de citometria de fluxo obtidos podem ser representados como gráficos de dispersão, com o sinal fluorescente da incorporação de EU em RNA recém-sintetizado plotado no eixo Y e o sinal da coloração anti-vírus da febre do Vale do Rift plotado no eixo X. Os limites dos quadrantes foram definidos de modo que a maioria das células mock infectadas estivesse situada no quadrante superior esquerdo. A maioria das células tratadas com actinomicina-D estava situada no quadrante inferior esquerdo e a maioria das células infectadas estava situada na metade direita do gráfico. Quando as células foram infectadas com MP-12, 81,5% do total de células, ou 93% das células positivas para anti-febre do Vale do Rift, mostraram atividade transcricional reduzida. Em contraste, quando as células foram infectadas com o MP-12, clone 13-tipo, 91,6% do total de células, ou 97% das células positivas para anti-febre do Vale do Rift, mostraram atividade transcricional comparável à das células mock infectadas. Esses dados também podem ser representados na forma de um histograma para a marcação fluorescente de RNA com incorporação de EU. Após este procedimento, outros métodos, como imunomarcação intracelular, podem ser realizados para visualizar a expressão de proteínas virais nessas células. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar a química click para visualizar a atividade transcripcional em células infectadas por vírus, seja por microscopia fluorescente ou por citometria de fluxo.Não se esqueça de que trabalhar com vírus infecciosos pode ser extremamente perigoso; portanto, tome precauções, como usar EPI adequado e evitar a inalação de aerossóis.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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Modificação de Superfícies quimiosseletiva virais através Química Clique Bioorthogonal

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Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

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