Name: Membrana-COLUNA: Uma Ferramenta bioquímicos na identificação de interações proteína-proteína de Proteínas de Membrana In Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprenda a identificar interações proteína-proteína in vivo de proteínas de membrana usando a técnica Membrane-SPIN com reticulação por formaldeído, purificação por afinidade e espectrometria de massa.

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Esta pesquisa foi apoiada por doações da Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 e SFB940 a SH

Nota: Informações detalhadas sobre tampões indicados no protocolo está disponível na Tabela 1. 1. Fixação de interações proteína-proteína por formaldeído Cross-ligando em células vivas <ol><li> Para começar a preparar meios de cultura, soluções de reserva e de tampão P1 <ol><li> Prepare 500 ml meio: O meio deve proporcionar condições que suportam a interação entre a proteína isca membrana e proteínas presas. Além disso, um experimento deve ser realizado sob condições em que se espera nenhuma interação (por exemplo, sem cross-linking). Nota: Nós comparamos interações proteína-proteína em bactérias estressados ​​e não-estressados. Portanto, podemos preparar 500 ml de Luria Bertani (LB) (Tabela 1) que complementar com um agente de indução de stress (por exemplo, NaCl a 0,5 M) num frasco de 2 L de Erlenmeyer. Para o controle, usamos meio LB normal com 0,17 M de NaCl (pH 7,0). </li><li> Preparar tampão Tris (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) e 0,1 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), pH 8,0 solução de estoque (Tabela 1). </li><li> Prepare tampão P1. Dissolve-se a sacarose a uma concentração final de 0,5 M em tampão Tris. Esterilizar tampão P1 por filtração e armazená-lo a 4 ° C. </li></ol></li><li> Crescer as células que expressam a proteína de membrana de isco com uma fusão C-terminal de Strep-tag de um vector. Induzem a expressão de proteínas de membrana de isco durante um tempo suficiente. Nota: Foram induzir a expressão de proteínas de membrana bacterianas isca em fase-log precoce (A 600 = 0,3) pela adição de 250 ul de 1 M isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) para 500 ml de meio (concentração final: 0,5 mM) . Para permitir uma expressão suficiente, que incuba-se as bactérias até à fase de fim de registo (A 600 = 1,2). </li><li> Prepare-se para cada uma cultura de duas provetas de centrifugação com um volume mínimo de 300 ml de cada um e colocá-las sobre gelo. </li><li> Realize formaldeído cross-linking. CAUÇÃO: O formaldeído é altamente tóxico Recomendamos trabalhando sob uma coifa de segurança.. <ol><li> Transfira o recipiente de cultura sob uma coifa de segurança. Dividir cada amostra em duas amostras, uma omissão de reticulação (- X) e uma incluindo o formaldeído de reticulação (+ X). Adicionar 4 ml de solução de formaldeído a 37% e 250 ml de cultura para atingir uma concentração final de 0,6%. </li></ol></li><li> Transfira os recipientes de cultura para trás e cultivar células por mais 20 min como antes. </li><li> Preencha seus culturas dentro dos tubos de centrífuga sob uma coifa de segurança. Recolher as células por centrifugação a 3000 xg durante 30 min. </li><li> Elimine o sobrenadante com cuidado pipetando-lo sob uma coifa de segurança. Colete tóxico sobrenadante contendo formaldeído e descartá-la adequadamente. </li><li> A fim de atingir o rendimento ideal durante a preparação de proteínas de membrana, preparar esferoplastos primeiro. Aqui, nós fornecemos um protocolo para a formação de esferoplastos de bactérias Gram-negativas: <ol><li> Prepartampão e P2 (Tabela 1) a partir de pó liofilizado. Suavemente dissolver 2 mg de lisozima em 0,1 M de EDTA, pH 8, num tubo de 1,5 ml. Sempre preparar tampão P2 na hora para o dia do experimento. </li><li> Prepare Tris-buffer com inibidor de protease (P3 buffer). A 10 ml de tampão Tris, adicionar 0,1 ml de 1 M de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (Tabela 1) para uma concentração final de 10 mM. Use o tampão imediatamente, para garantir o funcionamento adequado da PMSF como inibidor da protease. </li><li> Os sedimentos de células Ressuspender em 10 ml de tampão Tris com inibidor de protease e solução de transferência para um tubo de 15 ml. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão P2 e incubar em gelo durante 30 min. </li><li> Recolhe esferoplastos por centrifugação a 3000 xg durante 30 minutos e descartar o sobrenadante cuidadosamente. </li></ol></li><li> Incubar as pelotas de esferoplastos a noite a -20 ° C. </li></ol> 2. Purificação de Strep-tag Membrane Protein (Bait) <ol><li> Coloque esferoplasto pellet no gelo. &lt;/ Li&gt; <li> Durante o tempo dos peletes de esferoplastos descongelar em gelo, 10 ml de preparar P3 tampão para cada preparação de esferoplastos. Suavemente dissolver 1 mg ADNasel em 10 ml de tampão Tris. Adicionar 0,1 ml de 1 M de PMSF imediatamente antes da utilização. </li><li> Ressuspender o sedimento em 6 ml P3 preparada de fresco. Sonicar a amostra quatro vezes durante 1 min de forma contínua em gelo com 1 min de pausa entre cada explosão, de forma a interromper os esferoplastos. </li><li> Centrifugar a amostra a 10.000 xg durante 10 minutos para colher os detritos celulares. Transferir o sobrenadante com uma pipeta para um tubo de ultracentrifugação. </li><li> Sedimentar a fracção de membrana a 100.000 xg durante 30 min. Lavar o sedimento cuidadosamente em Tris-tampão sem dissolver. Seque o tubo com um lenço de papel (por exemplo, lenços de papel). Evitar perturbar o sedimento, em qualquer momento. </li><li> Ressuspender o sedimento (= membranas) cuidadosamente em 1 ml de tampão Tris. Use uma alíquota de 20 ul para determinar a concentração de proteína pelo ensaio de BCA por exemplo. Neste passo, as membranas podem ser congelados em choque liquid azoto e armazenada a -80 ° C. </li></ol> 3. Purificação de Strep-tag Membrana Isca proteína e SDS-PAGE <ol><li> Normalizar a concentração de proteína da fracção de membrana de 5 mg / ml com tampão Tris. Tome 2,5 ml da fracção de membrana (5 mg / ml) num tubo de ultracentrifugação e adicionar 0,25 ml de 20% Triton X-100 para se atingir uma concentração final de 2%, a fim de solubilizar as proteínas da membrana. Adicionar uma haste de micro-magnético e agita-se em gelo durante 1 hr. Nota: Apesar de, em geral, temos bons resultados com o Triton X-100 como detergente, pode ser útil para mudar o detergente para otimização. A este respeito, temos os melhores resultados com os detergentes utilizados para a purificação funcional da respectiva proteína isco membrana. </li><li> Embora a realização do passo 3.1, preparar 50 ml de tampão W e 5 ml de tampão E (Tabela 1). Encha-se 10 mL de 5x tampão W concentrado para 50 ml e adicionar 150 ul de 20% de Triton X-100. <ol><li> Encha-se 1 ml de 5x buffer E concentrado para 10 ml e adicionar 30 ul de 20% de Triton X-100. Equilibrar um Strep-Tactin coluna de fluxo de 1 ml superfluxo gravidade com 8 ml de tampão de W. Nota: É essencial para adicionar o detergente utilizado para a solubilização em uma concentração de 10 vezes acima da concentração micelar crítica (CMC) em qualquer solução durante o processo de purificação. </li></ol></li><li> Retirar a vareta micro-magnético a partir da amostra de solubilização e de ultracentrifugação a 100000 xg durante 30 minutos, para sedimentar a fracção de membrana insolúvel. Retirar o sobrenadante utilizando uma pipeta para purificação adicional. </li><li> Carrega-se o sobrenadante para a coluna. Executar a coluna só com fluxo por gravidade. Lavar a coluna com 5 ml de tampão W. Repetir esta etapa de lavagem 5x. </li><li> Eluir as proteínas de membrana de isca com 1 ml de tampão E. Repita este passo de eluição de 4x. </li><li> Concentra-se as fracções de eluição 2, 3 e 4, até 300 ml, com uma unidade de filtração centrífuga. </li><li> Misturar 200 ul de cada amostra com 50 mL de 5x de SDS-PAGCorante de carga de E. Divida cada preparação em 125 mL alíquotas. Ferver uma alíquota de cada preparação durante 20 min a 95 ° C, para reverter ligações cruzadas de formaldeído. Deixe as amostras arrefecer para a temperatura ambiente durante pelo menos 10 min, em cima da bancada. </li><li> Carga de 30 ul de cada amostra para uma única pista de um gel de poliacrilamida-gel adequado para imunoblotting. Use um marcador prestained peso molecular para uma melhor orientação e executar SDS-PAGE 10. </li></ol> 4. Análise Imunoblot para confirmar parceiros de interação <ol><li> Uma vez que o passo 3.8 for concluída, proteínas de transferência para uma membrana de nitrocelulose por exemplo semidry. </li><li> Bloquear a membrana para evitar a marcação não específica. Preparar o tampão de bloqueio por pesagem de albumina sérica bovina (BSA) para atingir o peso de 3% por volume em soro fisiológico tamponado com Tris suplementado com uma concentração final de 0,05% de Tween-20 (TBS-T). Utilizar um volume suficiente de tampão de bloqueio para cobrir a membrana. Bloquear a membrana durante 1 hora a RT. </li><li> Diluir umaª incubar o primeiro anticorpo específico da proteína presa como de costume. Usar um anticorpo ligado a HRP como o segundo anticorpo. </li><li> Desenvolver a imunotransferência utilizando um kit de detecção quimioluminescente com alta sensibilidade. Monitorar o sinal através de um procedimento de processamento de filmes clássicos ou equipamentos de imagem digital. </li></ol> 5. NanoLC-ESI-MS/MS de alta resolução Experimentos para identificar parceiros de interação <ol><li> No caso em que nenhum anticorpo específico está disponível para a proteína presa ou parceiros de interacção desconhecidos devem ser identificadas, utilizar a espectrometria de massa (MS) para a identificação. A fim de evitar a contaminação da queratina, usar géis precasted para a separação de proteínas. </li><li> Prata manchar a SDS-PAGE utilizando um kit de coloração MS-compatível de acordo com o protocolo do fabricante. Execute todas as etapas de coloração e lavagem de tanques de vidro. </li><li> Especiais de Consumo respectivas bandas e analisar estes de alta resolução por LC / MS 9. </li></ol>

<ol><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model%3A+application+to+complete+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).</li>
<li>Bakheet, T. M., Doig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+identification+of+human+protein+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Properties and identification of human protein drug targets.</a> Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).</li>
<li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-target+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Drug-target network.</a> Nat. Biotechnol. 25, (2007).</li>
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<li>Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-SPINE%3A+An+improved+method+to+identify+protein-protein+interaction+partners+of+membrane+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo.</a> Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).</li>
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<li>Weber, R. F., Silverman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cpx+proteins+of+Escherichia+coli+K12+%3A+Structure+of+the+CpxA+polypeptide+as+an+inner+membrane+component%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component.</a> J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

Análise Membrane coluna vertebral é uma abordagem bioquímica que permite que se confirmar e identificar este ponto parceiros de interação desconhecidos de proteínas de membrana. Membrana COLUNA combina in vivo cross-linking por formaldeído com purificação de uma proteína de membrana isca Strep-marcado. A combinação com imunotransferência facilita a confirmação de parceiros de interacção previstas (Figura 2). Além disso, a combinação com análise MS permite a identificação de parceiros de interac...

Para entender a função de uma proteína que é essencial conhecer os seus parceiros de interação. Várias técnicas clássicas estão disponíveis para a identificação de parceiros de interacção de proteínas solúveis. No entanto, estas técnicas não são facilmente transferíveis para a membrana proteínas, devido à sua natureza hidrofóbica 4. Para ultrapassar esta limitação, foi desenvolvido o Strep-proteína de membrana interacção experimento (Membrane-SPINE) 6. Ele baseia-se no método da coluna vertebral, que era apenas adequado para proteínas solúveis 7. Benefícios membrana da coluna vertebral de duas vantagens do formaldeído agente de reticulação: primeiro, o formaldeído pode facilmente penetrar as membranas e, consequentemente, gera uma imagem precisa da interactoma de uma célula viva 8. Em segundo lugar, formaldeído ligações cruzadas pode ser revertida por ebulição 9. Aqui, estas duas vantagens são usados ​​para identificar não só IPP permanentes, mas também transientes de prote membranains 6. Em resumo, um Strep-tag está fundido com o terminal C da proteína de membrana integral isca. As células que expressam a proteína de membrana de isca são incubadas com formaldeído, que as ligações cruzadas atacam proteínas para a proteína isco membrana (Figura 1). Modificações de proteínas presas não são necessários. Em seguida, a fracção de membrana é preparado. Portanto, as proteínas da membrana são solubilizados por tratamento com detergente e isca proteínas são co-purificados com suas proteínas presas utilizando a purificação por afinidade. Subsequentemente, a ligação transversal é invertida por ebulição, e o isco e suas proteínas presa co-eluidas são separadas por SDS-PAGE. Finalmente, as proteínas de presa pode ser identificado por análise de imunotransferência ou espectrometria de massa.

<table><tbody><tr><td>37% de formaldeído</td><td>Roth</td><td>4979.1</td><td>Não deve ter mais de um ano</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Haste micromagnética</td><td>Roth</td><td>0955.2</td><td>5 mm de comprimento, 2 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td>detergente padrão para solubilização</td></tr><tr><td>n-Dodecil-&beta;-maltosídeo</td><td>Glycon</td><td>D97002-C</td><td>o melhor detergente para solubilizar CpxA</td></tr><tr><td>1 ml de coluna de fluxo gravitacional de superfluxo de estreptococo</td><td>tactina IBA</td><td>2-1207-050</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de tampão de purificação de proteínas Strep-tag</td><td>IBA</td><td>2-1002-001</td><td>Contém tampão W e tampão E</td></tr><tr><td>Filtro centrífugo Amicon Ultra-4</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Substrato quimioluminescente</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>SilverQuest Silverstaining kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>FireSilver Staining</td><td>Kit Proteome Factory</td><td>P-S-2001</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

membrana-coluna: uma ferramenta bioquímicos na identificação de interações proteína-proteína de proteínas de membrana in vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

As proteínas da membrana são essenciais para a viabilidade celular e, portanto, são alvos terapêuticos importantes 1-3. Desde que funcionam nos complexos de 4, métodos para identificar e caracterizar as suas interacções são necessárias 5. Para isso, desenvolvemos a membrana Strep-proteína experimento interação, chamada de membrana-espinha 6. Esta técnica combina in vivo de ligação cruzada utilizando o formaldeído reversível de reticulação com a purificação por afinidade de uma proteína de membrana de isca Strep-tag. Durante o procedimento, as proteínas presa reticulados são co-purificados com a proteína de membrana de isca e, subsequentemente, separado por ebulição. Assim, duas grandes tarefas podem ser executadas quando se analisa as interações proteína-proteína (IBP) de proteínas de membrana usando Membrane-espinha: primeiro, a confirmação de um parceiro de interação proposto por immunoblotting e, segundo, a identificação de novos parceiros de interação através da análise de espectrometria de massa . Além disso, mesmo low afinidade PPIs transientes são detectáveis ​​por esta técnica. Finalmente, Membrane-espinha é adaptável a praticamente qualquer tipo de célula, tornando-o aplicável como ferramenta de triagem para identificar poderoso PPIs de proteínas de membrana.

A análise da membrana COLUNA permite co-purificação de proteínas da membrana e transitoriamente interagindo parceiros proteicos. O co-purificação é conseguido usando o agente formaldeído cross-linking. Dois parâmetros são críticos para evitar inespecíficas ligações cruzadas: a concentração de formaldeído e o tempo de reticulação. A utilização suficientes, mas não excessivas de formaldeído pode ser facilmente controlada por imunotransferência. Complexos proteicos formaldeído reticulado pode ser separado por ebulição mas ...

A abordagem bioquímica é descrita a identificação in vivo de interacções proteína-proteína (PPI), de proteínas de membrana. O método combina a proteína de ligação cruzada, de purificação por afinidade e espectrometria de massa, e é adaptável para quase qualquer tipo de célula ou organismo. Com esta abordagem, embora a identificação de IPP transientes torna-se possível.

Membrana-COLUNA: Uma Ferramenta bioquímicos na identificação de interações proteína-proteína de Proteínas de Membrana In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar proteínas in vivo, interações proteicas de proteínas de membrana por meio de um experimento de interação de proteínas estreptocócicas de membrana ou coluna vertebral de membrana. Isso é feito por reticulação in vivo usando o reticulador reversível para formaldeído. O segundo passo é purificar a proteína de isca de membrana marcada com strept junto com as proteínas de presa reticuladas.Em seguida, a reticulação é revertida por fervura. A etapa final é a separação da proteína de isca de membrana e das proteínas de presa co-purificadas por sulfato de dessalinização de sódio, eletroforese em gel de poliacrilamida ou página SDS. Em última análise, a análise de immunoblotting e espectrometria de massa é usada para identificar as proteínas da presa, permitindo a análise das interações das proteínas da membrana.Eu sou Sabina Hunka e vamos mostrar hoje a tecnologia da coluna vertebral de membrana. A principal vantagem dessa tecnologia sobre os métodos existentes, como co IP, é que ela permite detectar interações proteína-proteína de baixa afinidade ou transitórias. Kline Shaana demonstrará o procedimento.Ela é uma das minhas alunas de doutor

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