Membrana-COLUNA: Uma Ferramenta bioquímicos na identificação de interações proteína-proteína de Proteínas de Membrana In Vivo

O objetivo geral deste procedimento é identificar proteínas in vivo, interações proteicas de proteínas de membrana por meio de um experimento de interação de proteínas estreptocócicas de membrana ou coluna vertebral de membrana. Isso é feito por reticulação in vivo usando o reticulador reversível para formaldeído. O segundo passo é purificar a proteína de isca de membrana marcada com strept junto com as proteínas de presa reticuladas.

Em seguida, a reticulação é revertida por fervura. A etapa final é a separação da proteína de isca de membrana e das proteínas de presa co-purificadas por sulfato de dessalinização de sódio, eletroforese em gel de poliacrilamida ou página SDS. Em última análise, a análise de immunoblotting e espectrometria de massa é usada para identificar as proteínas da presa, permitindo a análise das interações das proteínas da membrana.

Eu sou Sabina Hunka e vamos mostrar hoje a tecnologia da coluna vertebral de membrana. A principal vantagem dessa tecnologia sobre os métodos existentes, como co IP, é que ela permite detectar interações proteína-proteína de baixa afinidade ou transitórias. Kline Shaana demonstrará o procedimento.

Ela é uma das minhas alunas de doutorado que desenvolveu o Protocolo para iniciar este procedimento, Cultive células bacterianas expressando a proteína de isca de membrana com uma fusão de etiqueta estreptocócica terminal C induzir a expressão de proteínas de isca de membrana na fase logarítmica inicial pela adição de 0,5 milimolar IPTG a 500 mililitros de meio para permitir expressão suficiente. Incube as bactérias até a fase logarítmica tardia. Prepare-se para realizar a reticulação de formaldeído sob uma capela de segurança devido à toxicidade do formaldeído.

Transfira o recipiente de cultura para um exaustor de segurança. Divida cada amostra em duas amostras, uma omitindo a reticulação e outra, incluindo a reticulação do formaldeído. Adicione quatro mililitros de solução de formaldeído a 37% a uma cultura de 250 mililitros para atingir uma concentração final de 0,6%Transfira os vasos de cultura de volta e faça crescer as células por mais 20 minutos como antes.

Em seguida, encha as culturas em tubos de centrífuga sob uma capela de segurança. Coletar as células por centrifugação a 3000 vezes G por 30 minutos. Eliminar o sobrenadante, em primeiro lugar, por decantação e, por sucção.

Usando uma pipeta sob uma coifa de segurança, descarte os sobrenadantes descartando adequadamente o formaldeído tóxico contendo sobrenadante. Para alcançar o rendimento ideal durante a preparação da proteína da membrana, primeiro prepare as placas de Sphero para começar a dissolver suavemente dois miligramas de lisozima em 0,1 molar E-D-T-A-P-H oito em um tubo de 1,5 mililitro. Preparar o tampão P dois, que deve ser feito fresco no dia do experimento.

Resus suspenda os grânulos celulares em 10 mililitros de tampão trissacarose recém-preparado com inibidor de protease e transfira a solução para um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione um mililitro de tampão P dois e incube no gelo por 30 minutos. Recolher as placas de Sphero por centrifugação a 3000 vezes G durante 30 minutos e rejeitar o sobrenadante.

Incube cuidadosamente os pellets Sphero plast durante a noite a 20 graus Celsius negativos trabalhando no gelo. Resus suspende o palato Sphero Plast em seis mililitros de tampão recém-preparado. P três.

Sonicar a amostra quatro vezes durante um minuto continuamente no gelo, com uma pausa de um minuto entre cada rajada. Para interromper o Sphero plast, centrifugue a amostra a 10.000 vezes G por 10 minutos para coletar detritos celulares após a centrifugação. Transferir o sobrenadante utilizando uma pipeta para um tubo de ultracentrífuga.

Pulverizar a fracção da membrana a 100 000 vezes G durante 30 minutos. Lave cuidadosamente o pellet em tampão tris 20 milimolares pH oito sem dissolvê-lo. Em seguida, conduza um tubo com um lenço de papel, evitando perturbar o pellet a qualquer momento.

Para ressuspender o pellet contendo as membranas, adicione um mililitro de tris, tampone uma haste micromagnética e ressuspenda o pellet, parcialmente com uma pipeta mexa no gelo por uma hora, use uma alíquota de 20 microlitros para determinar a concentração de proteína. Normalize a concentração de proteína da fração de membrana para cinco miligramas por mililitro com tampão tris pipeta 2,5 mililitros da fração de membrana para um tubo de ultracentrífuga e adicione 0,25 mililitros de 20% Triton X 100 para atingir uma concentração final de 2% para solubilizar as proteínas da membrana. Em seguida, adicione uma haste micromagnética e mexa no gelo por uma hora.

Equilibre uma coluna de fluxo de gravidade de super fluxo de actina de um mililitro com oito mililitros de buffer. W. Remova a haste micromagnética da amostra de solubilização e ultracentrifuge a 100.000 vezes G por 30 minutos para granular a fração de membrana insolúvel após a conclusão da execução, remova o sato usando uma pipeta. Para uma maior purificação, aplicar o sobrenadante à coluna utilizando o fluxo por gravidade.

Lave a coluna com quatro mililitros de tampão W Repetindo esta etapa de lavagem cinco vezes. Eluir as proteínas da isca de membrana com um mililitro de tampão E. Repita esta eluição. Etapa quatro vezes, concentre as frações aludidas.

Dois, três e quatro a 300 microlitros com uma unidade de filtro centrífugo. Misture 200 microlitros de cada amostra com 50 microlitros de cinco x como corante de carregamento de página DS. Divida cada preparação em alíquotas de 125 microlitros antes de ferver.

Uma alíquota de cada preparação por 20 minutos a 95 graus Celsius para reverter as ligações cruzadas do formaldeído. Deixe as amostras esfriarem até a temperatura ambiente por pelo menos 10 minutos na bancada. Carga superior de 30 microlitros de cada amostra para uma única pista de um gel de poliacrilamida adequado para immuno blotting.

Use um marcador de peso molecular prestado para a melhor orientação e execute como página DS após a transferência de proteínas para uma membrana de nitrocelulose. Bloqueie a membrana para evitar rotulagem não específica por uma hora. À temperatura ambiente, dilua e incube o anticorpo primário específico da proteína da presa.

Use um anticorpo ligado a HRP como anticorpo secundário e desenvolva o immunoblot usando um kit de detecção quimioluminescente com alta sensibilidade. Monitore o sinal usando um procedimento clássico de processamento de filme ou equipamento de imagem digital. Se nenhum anticorpo específico estiver disponível para a presa, proteína ou interação desconhecida, os parceiros devem ser identificados.

Use espectrometria de massa ou MS para identificação. Mancha de prata na página SDS usando um kit de coloração compatível com MS. De acordo com o protocolo do fabricante, execute todas as etapas de coloração e lavagem em tanques de vidro.

Extirpar as respectivas bandas antes de analisá-las por LCMS de alta resolução como proteína de isca. A proteína de membrana integral CPXA de VISIA coli foi usada. O CPXA é uma quinase do sensor e consiste em um domínio do sensor terminal N com dois domínios transmembrana integrando um grande domínio do sensor citoplasmático extra e um domínio catalítico citoplasmático altamente conservado do terminal C.

Após a estimulação, o CPXA ativa seu regulador de resposta cognato, o CPXR ativado por CPXR se difunde para mediar a resposta da coluna vertebral da membrana. A marca estreptocócica foi fundida ao terminal C do CPX. Uma análise da coluna vertebral da membrana revela que o estreptococo CPXA reticulado com outras proteínas ou complexos proteicos indicados por um esfregaço na amostra tratada com formaldeído revelado.

Sem tratamento com formaldeído, esse esfregaço está ausente. Além disso, uma interação direta da proteína proteica do estreptococo CPXA com sua proteína reguladora de resposta cognata CPXR como proteína da presa só é detectável na presença de formaldeído. Apoiando a especificidade da reticulação de formaldeído com coloração de prata.

Uma faixa específica para a amostra fervida é aparente. A seta marca uma faixa que foi analisada pelo MS. Análise e que confirmou a CPXR como o parceiro de interação da CPXA. Depois de assistir a este vídeo, ele deve ter uma boa compreensão de como combinar a purificação de afinidade de pró e reticulação em espectrometria de massa para identificar parceiros de interação de proteínas de membrana.