Imagem confocal de Solteiro mitocondriais superóxido Pisca em coração intacto ou In Vivo

O objetivo geral deste procedimento é monitorar eventos mitocondriais únicos, como flashes de superóxido e flutuações de potencial de membrana in situ ou in vivo, para obter avaliação em tempo real da função mitocondrial em um contexto fisiologicamente relevante. Isso é feito expondo primeiro o músculo esquelético no membro posterior do camundongo. Em seguida, imagens confocais de lapso de tempo dos músculos esqueléticos são obtidas in vivo.

Em seguida, o coração do camundongo é perfundido e fotografado usando microscopia confocal. Por fim, as imagens são processadas e os dados são analisados. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram flashes de superóxido mitocondrial únicos e flutuações de potencial de membrana nos músculos esqueléticos, in vivo ou no coração perfundido por meio de lapso de tempo e imagens confocais bidimensionais.

A principal vantagem desta técnica sobre os músculos existentes, como a avaliação da função mitocondrial no isolamento de mitocôndrias, é que esta técnica permite a avaliação em tempo real da função mitocondrial única em uma condição fisiologicamente relevante. A demonstração desse método é crítica, pois uma faca, animal ou tecido de faca A imagem confocal é difícil de aprender porque é um procedimento mais íngreme e complicado. Depois de preparar a solução salina isotônica balanceada ou IBSS, Krebs HENSEL Light Buffer ou KHB e instrumentos cirúrgicos de acordo com o protocolo de texto, anestesiar um camundongo com uma injeção intraperitoneal de Pentobarbital e realizar uma pinça do dedo do pé para confirmar que o animal está sedado.

Usando uma navalha, remova os pelos de um dos membros posteriores antes de desinfetar o local com etanol a 70%. Em seguida, faça uma incisão na pele ao longo do lado externo do membro para expor os músculos da anemia gástrica. Em seguida, usando uma pinça afiada, pegue suavemente o epimísio e use uma tesoura para fazer uma incisão através dele.

Disseque ainda mais para remover o epimísio e expor as fibras musculares abaixo dele. Adicione 500 tetraetil nanomolar, éster metílico de domina de bastonete ou TMRM ao IBSS e mergulhe o músculo na solução por 30 minutos. Depois de carregar o TMRM no músculo, lave o músculo com IBSS livre de TMRM usando uma objetiva de óleo 40 x.

Coloque o mouse de lado no estágio do microscópio confocal e prenda o membro traseiro para que o músculo esquelético exposto fique em uma câmara feita sob medida contra a lamínula. Em seguida, pressione suavemente a perna para fazer um contato firme entre o tecido e a lamínula e mergulhe os músculos expostos no IBSS usando uma profundidade de pixel de oito bits e uma taxa de amostragem de um segundo por quadro, registre uma varredura serial bidimensional do músculo. Colete imagens sequenciais excitando primeiro a 405 nanômetros e coletando a mais de 505 nanômetros.

Em seguida, emocionante em 488 nanômetros enquanto coleta em mais de 505 nanômetros. Para excitação de comprimento de onda duplo de MT. CCP YFP, use excitação sequencial em 405, 488 e 543 nanômetros e colete emissão em 505 a 5, 45,505 a 5, 45 e maior que 560 nanômetros, respectivamente. Para imagens de excitação de comprimento de onda triplo de M-T-C-P-Y-F-P e TMRM para obter imagens do coração do camundongo, injete no animal 200 unidades de heparina.

Depois de esperar 10 minutos e sacrificar o camundongo por toracotomia, remova rapidamente o coração, os pulmões e o timo ligados a ele. Transfira rapidamente o tecido implantado para IBSS gelado. Em seguida, identifique os lóbulos do timo e descasque-os com cuidado.

Para expor a aorta ascendente, remova o pulmão e o timo e isole a aorta removendo cuidadosamente qualquer tecido circundante. Em seguida, faça um corte na extremidade superior da aorta ascendente antes do primeiro ramo do arco aórtico. Em seguida, com duas micro pinças de sutura, segure suavemente a parede da aorta para expor o lúmen e coloque-a cuidadosamente em uma cânula.

Use uma pinça de microvasos para manter a aorta no lugar e amarre rapidamente as suturas ao redor dela. Remova a pinça e use uma pinça para verificar cuidadosamente se a ponta da cânula está acima da raiz da aorta. Prenda laços adicionais, se necessário, para manter o coração no lugar.

Ligue a bomba peristáltica e perfunda o coração. A um mililitro por minuto, o coração voltará a bater após a perfusão. Após 10 minutos de estabilização, perfunda o coração com 10 estatinas micromolares de BLEs e 100 a 500 TMRM nanomolares.

O batimento cardíaco diminuirá após 10 minutos. Em seguida, ajuste a posição do sistema de perfusão e coloque o coração no estágio do microscópio equipado com um adaptador para aquecer a câmara a 37 graus Celsius. Adicione um mililitro de solução de perfusão de KHB na câmara para submergir parcialmente o coração.

Use uma bomba peristáltica para remover o efluente da câmara. Aumentando gradualmente a velocidade da bomba para fornecer fluxo suficiente ao coração para garantir um contato firme do coração com a lamínula e para suprimir ainda mais os batimentos cardíacos, aplique uma leve pressão no coração. Visualize o órgão conforme descrito para o músculo anteriormente neste vídeo, ajustando o plano focal para revelar a imagem mais nítida possível.

Usando o módulo de análise fisiológica do software de microscópio confocal. Comece abrindo o banco de dados gerado automaticamente e, em seguida, o arquivo de imagem 2D a ser analisado. Clique na região de interesse ou na média do ROI.

Para alternar para o modo de média de ROIs. Desligue a exibição de canais, exceto CP YFP a 488 nanômetros para selecionar os flashes. Aumente o zoom na imagem e mova manualmente a barra deslizante para reproduzir as imagens 2D seriais.

Em seguida, identifique flashes de superóxido mitocondrial únicos, localizando o local onde o sinal fluorescente aumenta transitoriamente. Use a ferramenta ROI apropriada para marcar os flashes, o traço mostrando a mudança de fluorescência dependente do tempo de cada ROI aparecerá ao lado da imagem. Depois de selecionar todos os flashes, ligue a exibição de outros canais.

Selecione um ROI na imagem fora da célula para subtração do sinal de fundo. Em seguida, produza a fluorescência média de cada ROI junto com os rótulos de tempo. Registe o número de flashes em cada um dos ficheiros de imagem de digitalização em série, juntamente com o tempo de digitalização e a área da célula.

Use o Excel para calcular a frequência do flash como número de flashes por 100 segundos e por área de célula de 1000 mícrons quadrados. Para calcular o tempo de amplitude até o pico e o tempo de decaimento para cada flash. Use um programa desenvolvido sob medida para análise de parâmetros flash que faz parte de um programa desenvolvido sob medida escrito em linguagem de dados interativa.

O uso deste protocolo de imagem in vivo de eventos mitocondriais únicos pode ser realizado em músculos esqueléticos de camundongos anestesiados, seguido de imagem insi no coração perfundido. Como mostrado aqui. O TMRM, que é um indicador de potencial de membrana mitocondrial, é frequentemente usado para verificar a localização do M-T-C-P-Y-F-P e deve mostrar um padrão de sobreposição completo com o sinal M-T-C-P-Y-F-P.

Seus espectros são distinguíveis dos do CP YFP e, usando o método de excitação sequencial, os sinais de emissão de TMRM e M-T-C-P-Y-F-P não interferirão uns com os outros. Essas imagens demonstram que um único flash de superóxido mitocondrial acompanhado de despolarização da membrana pode ser identificado nas imagens de varredura 2D serial, que mostraram um aumento transitório de fluorescência sobre os sinais de fundo nos tecidos musculares esqueléticos e no miocárdio. Além da alta resolução, também é necessária uma intensidade de fluorescência adequada.

Isso pode ser alcançado modulando a intensidade do laser e o ganho nos canais coletores. Em geral, o sinal de fluorescência basal da célula é definido em um terço a um quarto da intensidade máxima do canal. Uma vez que o nível de expressão de M-T-C-P-Y-F-P e a carga de TMRM podem variar entre os animais, o ajuste fino das condições de imagem deve ser feito para cada experimento, tanto as perturbações fisiológicas quanto patológicas, como substratos metabólicos.

A estimulação elétrica, conforme indicado aqui, e a reperfusão isquêmica têm sido usadas para mostrar que a atividade do flash do superóxido responde a mudanças no estado metabólico celular. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a anestesia adequada da boca e a condição correta do coração perfundido. Após esse procedimento, outros métodos, como isquemia e fusão, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como disfunção mitocondrial durante leucemia miocárdica e lesão de reperfusão.