Name: Imagem confocal de Solteiro mitocondriais superóxido Pisca em coração intacto ou In Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Aprenda a monitorar eventos mitocondriais únicos, como flashes de superóxido e flutuações do potencial de membrana, em músculo esquelético e coração perfundido de camundongo usando microscopia confocal in vivo.

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Os autores gostariam de agradecer as Dras. Heping Cheng, Huiliang Zhang e Stephen Kolwicz por seus comentários e apoio técnico no desenvolvimento deste método. Este estudo foi suportado por concessões do NIH e da Scientist Desenvolvimento Grant da American Heart Association para WW.

1. Experiência Preparação <ol><li> Preparar a solução isotónica salina equilibrada (50 ml) contendo: 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2 e 10 mM de HEPES (pH 7,2) para a visualização in vivo do músculo esquelético. </li><li> Prepare 1 litro de tampão de Krebs-Henseleit (KHB) contendo: NaCl 118 mM, KCl 5,3 mM, MgSO4 1,2 mM, EDTA 0,5 mM e 25 mM de NaHCO3. </li><li> Bolha KHB com gás contendo 95% de O2 / 5% de CO 2 durante 10-15 minutos antes da adição de 2 mM de CaCl2. Adicionar substratos metabólicos (por exemplo, 10 mM de glucose e 0,5 mM de piruvato). </li><li> Prepare os instrumentos cirúrgicos com a esterilização a braçadeira, tesouras e fórceps em etanol 70% e, em seguida, enxaguar em esterilizado DDH 2 O. </li><li> Ligue o sistema de perfusão do coração, ajustar a temperatura do banho de água e circulador, defina a velocidade da bomba peristáltica a 6 ml / min. </li><li> Bolha KHB com 95% de O2/ 5% de CO 2 de gás, e controlar a taxa de fluxo e temperatura (37 ° C, por uma sonda de temperatura de fibra óptica) do efluente. O sistema precisa de cerca de 20 min para o gás ea temperatura de equilíbrio. </li></ol> 2. Imagem confocal dos músculos esqueléticos Em Vivo <ol><li> Anestesiar rato com pentobarbital (80 mg / kg, ip). O animal vai chegar a anestesia cirúrgica (sem resposta aos pés pitada) dentro de 10-15 min e permanecer neste estado por 1-1,5 h, suficiente para o vivo de imagens em dos músculos esqueléticos. </li><li> Retire os pêlos em um dos membros posteriores e esterilizar a pele com etanol a 70%. </li><li> Realizar uma incisão na pele ao longo do lado exterior do membro de expor os músculos gastrocnemius. </li><li> Pegue o epimísio delicadamente com uma pinça afiada e fazer uma incisão através dela com uma tesoura. Além disso dissecar para remover o epimísio e expor as fibras musculares por baixo. </li><li> Para in vivo carregamento de TMRM no esqueléticomuscular, incluem TMRM (500 nM) em solução de sal equilibrada isotónica imergir músculo durante 30 minutos e, em seguida lavar com uma solução isenta de indicador. </li><li> Colocar o rato sobre o seu lado no microscópio confocal (Zeiss LSM 510) fase e restringir o membro posterior em uma posição em que o músculo esquelético é exposta virada contra a lamela que forma o fundo da câmara. A lamela é entre o tecido muscular e o objectivo invertido (óleo de 40X). </li><li> Pressione a perna para baixo com cuidado para fazer contato apertado entre o tecido ea lamela. Mergulhe os músculos expostos em solução salina balanceada isotônica. </li><li> Grave duas dimensões (2D, xy) imagens confocal, a uma taxa de amostragem de um segundo por quadro. A intensidade de cada pixel é digitalizado em profundidade de 8 bits. Normalmente, uma varredura de série contém 100 quadros. </li><li> Coletar imagens seqüenciais por primeiro emocionante a 405 nm e coleta de&gt; 505 nm a 488 nm, em seguida, durante a coleta de&gt; 505 nm de comprimento de onda para a dupla excitation imagens de mt-cpYFP. Use excitação seqüencial a 405, 488 e 543 nm, e recolher emissão em 505-545, 505-545 e&gt; 560 nm, respectivamente, para o triplo do comprimento de onda de excitação de imagem de mt-cpYFP e TMRM. </li></ol> 3. Imagem confocal de perfusão Rato Coração <ol><li> Imediatamente após o vivo de imagens em dos músculos esqueléticos, injetar o mouse com 200 unidades de heparina (ip). Dez minutos depois, a eutanásia o mouse por toracotomia e rapidamente remover o coração com os pulmões eo timo ligadas a ele. </li><li> Remover rapidamente o pulmão em tampão gelado. Identificar os lóbulos do timo e suavemente descascar para trás para expor a aorta ascendente. </li><li> Remover o timo e isolar da aorta com cuidado de remover todo o tecido circundante. </li><li> Faça um corte na extremidade superior da aorta ascendente antes do primeiro ramo do arco aórtico. </li><li> Segurar a parede da aorta com cuidado com duas pinças de micro sutura para expor o lúmen e colocar cuidadosamente a aorta para o cannula (PE50 tubo). A aorta é mantida no lugar com uma pinça micro navio enquanto as suturas são rapidamente amarrado ao redor da aorta. </li><li> Retire o grampo, verifique cuidadosamente a cânula com uma pinça para garantir que a ponta da cânula está acima da raiz da aorta. Laços adicionais são adicionados como necessário para manter o coração no lugar. </li><li> Ligar a bomba peristáltica e perfundir o coração a 1 ml / min. O coração vai continuar batendo em perfusão. </li><li> Ajuste a posição do sistema de perfusão e colocar o coração no palco microscópio. A fase tem um adaptador que permite o aquecimento da câmara que contém o coração. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de perfusão KHB na câmara para submergir parcialmente o coração. Monitorizar a temperatura da câmara a 37 ° C. Retirar efluente da câmara usando uma bomba peristáltica. </li><li> Aumentar a velocidade de bomba peristáltica gradualmente para fornecer fluxo suficiente (aproximadamente 2 ml / min) para o coração. </li><li> Após 10 minutos de estabilização, perfundir o heart com 10 uM e blebbistatin 100-500 nM TMRM. Batimento cardíaco vai abrandar depois de 10 min. </li><li> Aplicar uma leve pressão sobre o coração para assegurar um contacto apertado do coração com a lamela na parte inferior da câmara, e para suprimir ainda mais batimentos cardíacos. </li><li> Siga o mesmo procedimento para a imagem confocal de miocárdio íntegro, como descrito no passo 2.8 acima. Ajustar cuidadosamente o plano focal para revelar a imagem mais nítida possível. </li></ol> 4. Processamento de Imagem e Análise de Dados <ol><li> Use as ferramentas fornecidas pelo módulo &quot;Análise fisiológica&quot; do software confocal para analisar único mitocondriais flashes e membrana possíveis mudanças. Este módulo é freqüentemente incluída na imagem adquirir software do sistema confocal e permite a determinação de certas áreas da imagem, bem como a saída de intensidade de fluorescência com rótulos de tempo. </li><li> Abra o banco de dados e, em seguida, o arquivo de imagem 2D de série a ser analisado. </li><li> Clique no botão &quot;Regiãode interesse (ROI) significa &quot;para mudar para a&quot; média de ROIs &quot;mode. Clique no botão&quot; região de interesse (ROI) significa &quot;para mudar para o&quot; modo média de ROI &quot;. </li><li> Desative a exibição de outros canais, exceto o canal de cpYFP 488 nm para a seleção dos flashes. </li><li> Aumentar a imagem e manualmente mover barra deslizante para reproduzir as imagens em 2D série. </li><li> Identificar único superóxido mitocondrial flashes por localizar o local onde sinais fluorescentes aumenta transitoriamente. Use a ferramenta ROI apropriado para marcar os flashes. O traço mostrando dependente do tempo a mudança de fluorescência de cada ROI vai aparecer ao lado da imagem. </li><li> Depois de selecionar todos os flashes, ligue a exibição de outros canais. Selecione um ROI na imagem exterior da célula para o sinal de subtração de fundo. Saída da fluorescência média de cada ROI juntamente com as etiquetas de tempo. </li><li> Registre o número de flashes em cada um dos arquivos de imagem de varredura de série juntamente com o tempo ea área de varreduraa célula. Use o Excel para calcular a frequência de flash como número de flashes por 100 seg / 1000 um 2 Área do celular. </li><li> Use um programa desenvolvido sob medida escrito em Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems) para calcular os parâmetros de cada Flash (amplitude, tempo de pico e tempo de decaimento). Software IDL está disponível comercialmente eo programa desenvolvido sob medida para a análise de parâmetros de flash pode ser obtida a partir do autor, mediante solicitação. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Imagiologia eventos mitocondriais individuais em animal vivo ou órgãos perfundidos tem vantagem significativa em relação aos métodos tradicionais de avaliação da função mitocondrial 17,19,21,22,24,25. A técnica aqui descrita pode realizar em tempo real a determinação in situ da função mitocondrial em condições fisiológicas reais na resolução subcelular. Isto é particularmente útil, quando combinada com outras medidas, para estudar sistematicamente o papel da mitocôndria na função normal de u...

As mitocôndrias têm um papel central na bioenergética celular, sinalização de radicais livres, homeostase redox, regulação iônica e determinação do destino da célula 1,2. As mitocôndrias disfunção muitas vezes acompanha e sustenta a patogênese de doenças 3-6. Especialmente nos sistemas musculares, tais como o coração e músculos esqueléticos, respiração mitocondrial fornece a maior parte do ATP para apoiar a regulação atempada de cálcio intracelular e robusto 7,8 desenvolvimento de força. Estes músculos possuem um grande número de mitocôndrias, que muitas vezes ocupam até 20-40% do volume total de células e são &quot;fixos&quot; entre miofilamentos 2. Apesar de numerosos estudos, a nossa compreensão da regulação da função mitocondrial, especificamente in vivo e em condições fisiologicamente relevantes, é limitado. Uma das razões é que a maioria dos métodos desenvolvidos para avaliar a função mitocondrial confiar em VITRo ou ex vivo abordagens, tais como monitoramento do consumo de oxigênio de mitocôndrias isoladas suplementadas com substratos artificiais, ea determinação indireta da função mitocondrial através da morfologia (microscopia de elétrons, por exemplo), a atividade da enzima (por exemplo, atividade aconitase), ou os níveis de ATP intracelular 9-11 . Recentemente, pequenos indicadores fluorescentes molécula com enriquecimento relativo mitocondrial têm sido aplicados para fornecer um vislumbre dos sinais mitocondriais, incluindo o potencial de membrana, cálcio e espécies reativas de oxigênio (ROS), em células intactas 11-13. Além disso, vários de proteína fluorescente verde (GFP) e indicadores redox baseado ROS foram desenvolvidos para obter uma avaliação mais específica do redox intracelular compartimentada ou ROS sinaliza 14-16. Entre isto, foi desenvolvido um indicador geneticamente codificado superóxido, a proteína fluorescente amarela permutada circular, e targeted-lo para dentro da mitocôndria (mt-cpYFP) 17. mt-cpYFP pode ser excitado a 405 ou 488 nm, com dois picos de emissão de 515 nm. A emissão a 488 nm de excitação é especificamente responsivo a superóxido como mostrado pela anterior in vitro e in vivo calibrações 17,18. A emissão a 405 nm de excitação é utilizado como controle interno (consulte a Figura 1 da Ref. 17 para obter informações detalhadas sobre os espectros de emissão e excitação de mt-cpYFP sob várias condições). Com time-lapse confocal de imagem, este indicador detecta estourando eventos produção de superóxido dismutase, nomeado flashes, em mitocôndrias isolados de células intactas. Flash Superoxide serve como uma função composta de respiração mitocondrial, a despolarização da membrana mitocondrial transitória acompanhamento e produção de ROS 17-20. Recentemente, gerou os pan-tecido mt-cpYFP camundongos transgênicos usando o vector pUC-CAGGS-mt-cpYFP 17,19 em C57/BL6 fundo e verificar as expressões fortesção deste indicador no coração, músculos esqueléticos e outros tecidos (Figura 2). Os camundongos transgênicos estarão disponíveis para os investigadores acadêmicos interessados ​​mediante solicitação e aprovação MTA pela Universidade de Washington. Neste estudo, descrevemos em imagem in situ de superóxido flashes em Langendorff coração perfundido, bem como in vivo de imagens de eventos de flash em músculos esqueléticos de camundongos transgênicos mt-cpYFP anestesiados 17,19. Esta tecnologia permite o monitoramento em tempo real de eventos de produção ROS único mitocondrial em uma condição fisiologicamente relevante ou in vivo 21,22. Também é possível usar o sistema para controlar outros parâmetros individuais mitocondriais, tais como o potencial de membrana e de cálcio com indicadores fluorescentes adequadas. Avaliação Além disso, simultânea ou paralela da função mitocondrial com eventos intracelulares (por exemplo, transientes de cálcio) ou de função cardíaca (por exemplo,. Fração de ejeção) pode ser alcançado. Perturbações patológicas, tais como a isquemia e reperfusão, pode ser aplicada ao coração perfundido para avaliar o impacto do stress sobre a função mitocondrial único no miocárdio intacta.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>B592500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Acros Organics</td><td>AC34961-5000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-1</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25</td><td></td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T-668</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td colspan="4">Microscópio de varredura de linha confocal (LSM 510 Meta, Zeiss), versão de software 4.2 SP1 incluindo o módulo "Análise Fisiológica".</td></tr></tbody></table>

imagem confocal de solteiro mitocondriais superóxido pisca em coração intacto ou in vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitocôndria é uma organela intracelular crítico responsável pela produção de energia e de sinalização intracelular em sistemas eucariotas. Disfunção mitocondrial, muitas vezes acompanha e contribui para a doença humana. Maioria das abordagens que têm sido desenvolvidas para avaliar a função mitocondrial e disfunção são baseados na produção in vitro ou ex vivo, as medições. Os resultados desses experimentos têm capacidade para determinar a função mitocondrial in vivo limitado. Aqui, descrevemos uma nova abordagem que utiliza microscopia confocal para a imagem de tecidos intactos em aminals ao vivo, o que permite a avaliação da função mitocondrial único de uma forma em tempo real in vivo. Em primeiro lugar, gerar camundongos transgênicos expressando o indicador de superóxido mitocondrial alvo, a proteína fluorescente amarela permuta circular (mt-cpYFP). Mt-cpYFP anestesiados mouse é fixo em um adaptador de estágio feito por encomenda e as imagens de lapso de tempo são tomadas from os músculos esqueléticos expostas do membro posterior. O mouse é posteriormente sacrificado eo coração está configurado para Langendorff perfusão com soluções fisiológicas a 37 ° C. O coração perfundido está posicionado em uma câmara especial no palco microscópio confocal e uma leve pressão é aplicada para imobilizar o coração e suprimir batimento cardíaco artefato movimento induzido. Superóxido flashes são detectados pelo tempo real de imagens 2D confocal com uma frequência de um quadro por segundo. A solução de perfusão podem ser modificadas para conter diferentes substratos de respiração ou outros indicadores fluorescentes. A perfusão pode também ser ajustado para produzir modelos de doenças tais como a isquemia e reperfusão. Esta técnica é uma abordagem única para a determinação da função de simples mitocôndria em tecidos intactos e in vivo.

De acordo com este protocolo, imagem in vivo de eventos mitocondriais único pode ser feito em músculos esqueléticos de ratos anestesiados, seguido por em imagem situ no coração perfusão (Figura 1). A configuração ideal das condições de imagem garante imagens nítidas dos tecidos musculares intactas e com resolução mitocôndria única (Figura 2). TMRM é muitas vezes usado para verificar a localização de mt-cpYFP e deve apresentar um padrão de sobreposição completa...

Microscopia confocal é aplicada para imagens individuais em eventos mitocondriais coração perfundido ou músculos esqueléticos em animal vivo. Monitoramento em tempo real de processos mitocondriais único, como superóxido flashes e membrana possíveis flutuações permite a avaliação da função mitocondrial em um contexto fisiologicamente relevante e durante perturbações patológicas.

Imagem confocal de Solteiro mitocondriais superóxido Pisca em coração intacto ou In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

O objetivo geral deste procedimento é monitorar eventos mitocondriais únicos, como flashes de superóxido e flutuações de potencial de membrana in situ ou in vivo, para obter avaliação em tempo real da função mitocondrial em um contexto fisiologicamente relevante. Isso é feito expondo primeiro o músculo esquelético no membro posterior do camundongo. Em seguida, imagens confocais de lapso de tempo dos músculos esqueléticos são obtidas in vivo.Em seguida, o coração do camundongo é perfundido e fotografado usando microscopia confocal. Por fim, as imagens são processadas e os dados são analisados. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram flashes de superóxido mitocondrial únicos e flutuações de potencial de membrana nos músculos esqueléticos, in vivo ou no coração perfundido por meio de lapso de tempo e imagens confocais bidimensionais.A principal vantagem desta técnica sobre os músculos existentes, como a avaliação da função mitocondrial no isolamento de mitocôndrias, é que esta técnica permite a avaliação em tempo real da função mitocondrial única em uma condição fisiologicamente relevante. A demonstração desse método é crítica, pois uma faca, animal ou tecido de fa

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método eficiente para obter insights sobre visualizando o parácrinos derivados de indução de ROS endotelial sinalização de Ca2 + é descrito. Esse método leva vantagem de medir parácrina ROS derivados provocou mobilização de Ca2 + em células endoteliais vasculares em um modelo de co-cultura.

Visualização dos Vascular Ca 2 + Sinalização Disparado por parácrina ROS Derivado

Fusão mitocondrial foi medida seguindo o equilíbrio da GFP matriz segmentada photoconverted através da rede mitocondrial ao longo do tempo. Até agora, apenas uma célula possa ser sujeita a uma análise de longo horas cinética de cada vez. Nós apresentamos um método que mede simultaneamente várias células, acelerando assim o processo de coleta de dados.

Uma resolução mais rápida, alta, MTPA-GFP baseada em ensaio de fusão mitocondrial aquisição de dados cinéticos de várias células em paralelo usando microscopia confocal

O objectivo é para monitorar o estado redox mitocondrial de corações isolados dentro do contexto de pré-carga fisiológica e pressões pós-carga. Um modelo de coração biventricular trabalhando coelho é apresentado. Alta resolução espaço-temporal de imagens de fluorescência de NADH é usado para monitorar o estado redox mitocondrial do tecido epicárdico.

NADH Fluorescência de Imagem biventricular isolado de coelho

Fonte: Kennedy, L. H., et. al. Visualização e imagem ao vivo de organelas de oligodendrócitos em fatias cerebrais organotípicas usando vírus adeno-associado e microscopia confocal. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a imagem de mitocôndrias de oligodendrócitos em fatias de cérebro de camundongos organotípicos. A fatia é colocada dentro de uma câmara de banho com circulação contínua de fluido e temperatura controlada. Depois de configurar vários parâmetros do microscópio confocal, imagens...

Imagem confocal do movimento mitocondrial dentro de oligodendrócitos em culturas organotípicas de fatias cerebrais

A análise da relação estrutura-função mitocondrial é necessária para uma compreensão completa dos mecanismos regulatórios da funcionalidade mitocondrial. Métodos específicos para estudar a estrutura e função mitocondrial em ovários vivos e fixos de Drosophila são descritos e demonstrados neste artigo.

Estudar mitocondrial estrutura e função em Drosophila ovários

Nós apresentamos um protocolo para estudar a distribuição das mitocôndria e do retículo endoplasmático em pilhas inteiras após a modificação genética usando a luz correlativa e a microscopia de elétron do volume que incluem a peroxidase 2 do ascorbato e a mancha do peroxidase do rábano, seccionamento serial de células com e sem o gene alvo na mesma seção, e imagens seriadas via microscopia eletrônica.

Mitocôndria e Reticulum endoplasmático por microscopia eletrônica de luz e volume correlativo

Esta técnica descreve um fluxo de trabalho eficaz para visualizar e medir quantitativamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido dentro de células HeLa usando imagens ao vivo baseadas em fluorescência.

Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa

O peróxido de hidrogênio (H2 O2) é uma fonte de dano oxidativo e uma molécula sinalizadora. Este protocolo descreve como medir mitocondrial H 2 O2usando HyPer7 mitocondrial (mtHyPer7), um biossensor ratiométrico codificado geneticamente, em leveduras vivas. Ele detalha como otimizar as condições de imagem e realizar análises quantitativas celulares e subcelulares usando software disponível gratuitamente.

Imagem de mtHyPer7, um biossensor ratiométrico para peróxido mitocondrial, em células vivas de levedura

Este protocolo descreve um mecanismo para usar microscopia de luz e eletrônica correlativa para visualizar a interação de mitocôndrias e lisossomos marcados com mEosEM e APEX2, respectivamente.

Microscopia Eletrônica e de Luz Correlativa de Duas Cores para a Visualização de Interações entre Mitocôndrias e Lisossomos

Este artigo descreve o uso de microscopia confocal e ImageJ para avaliar a dinâmica de fissão/fusão mitocondrial via fluorescência de fotocomutação Dendra2.

Avaliação da Dinâmica de Fissão/Fusão Mitocondrial em Células Tubulares Proximais Renais

Aprenda a monitorar eventos mitocondriais únicos, como flashes de superóxido e flutuações do potencial de membrana, em músculo esquelético e coração perfundido de camundongo usando microscopia confocal in vivo.

Imagem confocal de Solteiro mitocondriais superóxido Pisca em coração intacto ou In Vivo

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