Name: Método de preparação de slides para preservar arquitetura de cromatina tridimensional de células germinativas testiculares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprenda um método de preparação de slides 3D que preserva a arquitetura da cromatina em células germinativas testiculares de camundongos. Esta técnica melhora a detecção de estruturas subnucleares para estudos de biologia celular.

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Agradeço a Jeannie T. Lee pela supervisão deste projeto quando eu estava no laboratório Lee e Tyler Broering por editar o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Basil O'Connor Starter Scholar Award da Fundação March of Dimes e do NIH Grant GM098605.

Preparação de slides .3D 1
<ol><li>Prepare os seguintes reagentes:<ol>
<li>Tampão CSK: 100 mM NaCl, 300 mM de sacarose, 10 mM PIPES, 3 mM MgCl2. Ajuste o pH para 6,8 com 1 M NaOH. Armazene o buffer CSK a 4 °C.</li>
		<li>Tampão CSK com 0,5% Triton X-100: Adicione 200 μl de Triton X-100 a 40 ml de tampão CSK. Misture a solução usando agitador magnético até que Triton X-100 esteja completamente dissolvido. Armazene o buffer CSK com 0,5% Triton X-100 a 4 °C.</li>
		<li>4% Paraformaldeído (PFA)-PBS, pH 7.4: Dissolver 4 g de PFA em aproximadamente 70-80 ml de água. Para agilizar o processo de dissolução, adicione aproximadamente 20 μl de 4 N NaOH e mantenha a solução em um banho de água a 60 °C até que o PFA tenha completamente dissolvido e a solução seja transparente. Esse processo leva aproximadamente 1 hora. Depois que o PFA tiver completamente dissolvido, adicione 10 ml de PBS de 10x. Ajuste o volume final para 100 ml com água e esfrie a solução para temperatura ambiente (25 °C). Use uma solução recém-preparada para cada novo experimento. Nota: Obtenha permissão institucional para todo o trabalho animal e adere às diretrizes de cuidado animal relevantes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eutanize ratos machos. Usando fórceps e tesouras, extirpe o teste do rato. Coloque o teste em PBS (ou RPMI 1640). Após a remoção do testis, realize rapidamente as seguintes etapas 1.3-1.4, a fim de evitar a degradação do RNA.</li>
	<li>Rompa o testímetro em uma pequena placa de Petri e remova a tunica albuginea. Desvendar os túbulos seminiferos em PBS no gelo usando fórceps.</li>
	<li>Usando fórceps, transfira vários túbulos (vários pedaços de túbulos aproximadamente 5-10 mm de comprimento) em um poço de um prato de 4 poços contendo 500 ml de tampão CSK + 0,5% Triton X-100 no gelo, e incubar por 6 min. A superexposição ao buffer CSK pode resultar na interrupção das células.</li>
	<li>Usando fórceps, transfira todos os túbulos para um poço de um prato de 4 poços contendo 4% de solução PFA-PBS. Esta etapa pode ser pré-formada sem um estereótipo, mas opcionalmente pode ser usada. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Ao mesmo tempo, comece a preparar 12 câmaras de citospin durante os períodos de incubação.</li>
	<li>Usando fórceps, transfira todos os túbulos para um poço de um prato de 4 poços contendo PBS. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Na parte traseira de um escorregador de vidro, transfira todos os túbulos para 30 μl de PBS (a parte superior do slide deve ser evitada devido à carga cationic). Usando as pontas de dois fórceps, rasgue os túbulos em pedaços. Pique os túbulos em uma direção horizontal, cortando túbulos entre as pontas de dois fórceps e puxando as fórceps horizontalmente. Continue com esta etapa por aproximadamente 10-20 segundos.</li>
	<li>Misture a suspensão por pipeta usando uma pipeta P20.</li>
	<li>Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga, diluída com PBS para aproximadamente 1,3 ml. Aplique 100 μl de suspensão a cada uma das 12 câmaras de citospin (1,2 ml total). Nesta etapa, a concentração das células não precisa ser determinada.</li>
	<li>Citospin as amostras a 2.000 rpm por 10 minutos em temperatura ambiente. Depois de citospinning, lâminas secas no banco do laboratório por alguns minutos em temperatura ambiente. Depois que slides tiverem sido permitidos secar completamente por alguns minutos, vá para o próximo passo.</li>
	<li>Usando um frasco coplin contendo PBS, lave os slides por 5 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfira slides para um frasco de Coplin contendo 70% de etanol e espere pelo menos 2 minutos antes do início do RNA FISH. Os slides estão estáveis por algumas semanas em 70% de etanol a 4 °C. Para armazenamento a longo prazo, desidratar slides usando tratamento serial com 80% e 100% de etanol em frascos de Coplin por 2 min cada e secar completamente os slides. Armazene a -80 °C em uma caixa de slides.</li>
</ol>2. Preparação da sonda de DNA Cot-1 por preparação aleatória
<ol><li>Prepare os seguintes reagentes:<ol>
<li>Tampão de hibridização: Misture os componentes de processo para preparar 900 ml de estoque tampão de hibridização; esta solução será usada para estocar sondas. Este estoque tampão de hibridização permite a adição de 10% de volume de solução inibidora de RNase (Complexo Vanadyl Ribonucleoside) antes da hibridização.<table><tbody>
<tr>
<td>componente</td>
					<td>Quantidade (μl)</td>
					<td>Concentração final</td>
				</tr>
<tr>
<td>Formamida</td>
					<td>500</td>
					<td>50% (v/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>50% Dextran</td>
					<td>200</td>
					<td>10% (w/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>20x SSC</td>
					<td>100</td>
					<td>2x</td>
				</tr>
<tr>
<td>1% BSA</td>
					<td>100</td>
					<td>0.1%</td>
				</tr>
</tbody></table>Antes da hibridização, adicione 1/10 vol de 200 mM Complexo de Vanadyl Ribonucleoside ou água ao estoque de tampão de hibridização para corresponder à concentração final. A -20 °C, esta mistura é estável por mais de um ano.</li>
		<li>20x SSC: Dissolva 88,2 g de citrato de sódio e 175,3 g de NaCl em aproximadamente 800 ml de água. Ajuste o pH para 7.0 usando algumas gotas de 1 M HCl. Adicione água para ajustar o volume final a 1 L. Esterilizar por autoclaving. Após a preparação, 20x SSC pode ser armazenado à temperatura ambiente.</li>
		<li>50% (w/v) Dextran: Mexa água e adicione lentamente 50 g de sulfato de dextran. Continue mexendo durante a noite em temperatura ambiente. Adicione água para ajustar o volume final a 100 ml. Armazene à temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione os seguintes componentes listados abaixo a um tubo PCR. Usando uma máquina PCR, misture e incuba a solução por 5 min a 95 °C.<table><tbody>
<tr>
<td>componente</td>
				<td align="center">Quantidade por reação (μl)</td>
				<td align="center">final</td>
			</tr>
<tr>
<td>DNA cot-1: 1 mg/ml</td>
				<td align="center">1</td>
				<td align="center">1 μg</td>
			</tr>
<tr>
<td>Primer aleatório de 9mer (do kit)</td>
				<td align="center">10</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>Água</td>
				<td align="center">27</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Centrífuga brevemente e coloque no gelo.</li>
	<li>Adicione os seguintes componentes. Misture e incubar por 30 min a 37 °C usando uma máquina PCR. (Para detalhes do kit utilizado consulte a tabela de reagentes e equipamentos).<table><tbody>
<tr>
<td>componente</td>
				<td align="center">Quantidade por reação (μl)</td>
				<td align="center">Concentração final</td>
			</tr>
<tr>
<td>Mistura preparada a partir da etapa 2.2</td>
				<td align="center">38</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>Tampão nucleotídeo 5x (do kit)</td>
				<td align="center">9.2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>Cy3-dUTP (1 mM)</td>
				<td align="center">0.8</td>
				<td align="center">16 μM</td>
			</tr>
<tr>
<td>Klenow (do kit)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Adicione 2 μl de buffer de parada (do kit) para interromper a reação.</li>
	<li>Purifique a reação parada usando colunas de microspin.</li>
	<li>Adicione 50 μg (5 μl) de DNA de espermatozoides de arenque (50 vezes o excesso de DNA de modelo Cot-1) à fração purificada.</li>
	<li>Meça o volume total usando uma pipeta. Adicione 0,7x de volume de 100% etanol e 0,1x de acetato de sódio de 3 M (pH 5.2), misture bem e centrífuga por 15 minutos em velocidade máxima (17.000 x g) usando um microcentrifuge a 4 °C.</li>
	<li>Retire o líquido e adicione 200 μl de 70% de etanol, misture bem e centrífuga por 5 min em velocidade máxima a 4 °C.</li>
	<li>Remova o excesso de líquido. Seque o precipitado por 10-30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Dissolva a pelota em 20 μl de estoque tampão de hibridização. Porque a pelota é muitas vezes difícil de dissolver, pipeta repetidamente. Como opção alternativa, um misturador de vórtice também pode ser usado para dissolver eficientemente a pelota. As sondas podem ser mantidas a -20 °C até usar.</li>
</ol>3. PEIXE DE RNA COT-1
<ol><li>Adicione os componentes listados abaixo a um tubo PCR. Usando uma máquina PCR, incubar por 10 min a 80 °C, seguido de uma etapa de pré-estanagem de aproximadamente 10-30 min a 42 °C. Mantenha a 42 °C até a hibridização. O Complexo Vanadyl ribonucleosídeo é opcional; pode ser substituído por água.<table><tbody>
<tr>
<td>componente</td>
				<td align="center">Quantidade por reação (μl)</td>
				<td align="center">final</td>
			</tr>
<tr>
<td>Sonda de DNA Cot-1 (50 ng/μl)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">100 ng</td>
			</tr>
<tr>
<td>Complexo Vanadyl Ribonucleosídeo (200 mM)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">20 mM</td>
			</tr>
<tr>
<td>Tampão de hibridização</td>
				<td align="center">adicionado a 20</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Desidratar slides em um frasco de Coplin contendo 80% de etanol por 2 min, seguido por um frasco de Coplin contendo 100% de etanol por 2 min. Lâminas secas completamente no banco do laboratório à temperatura ambiente.</li>
	<li>Pré-aqueça uma câmara de caixa de ponta (cheia com 2-3 cm de água) em uma incubadora de 42 °C com antecedência. Coloque o slide na câmara da caixa de ponta. Centrifufique brevemente as sondas pré-apresentadas e a pipeta diretamente nos slides desidratados. Evite fazer bolhas. Cubra suavemente o slide com um deslizamento de cobertura.</li>
	<li>Hibridize por 6 horas a noite (14-15 horas) a 42 °C.</li>
	<li>Prepare soluções de lavagem em frascos Coplin (dois frascos com 2x SSC e 50% de formamide, e dois frascos com 2x SSC). Pré-aqueça a 42 °C por 30 min em banho-maria.</li>
	<li>Use uma lâmina de barbear para remover o deslizamento da tampa da borda do slide. Evite coçar amostras. Lave lâminas em um frasco de Coplin contendo 2x SSC e 50% de formamida por 5 min a 45 °C. Repita este passo uma vez.</li>
	<li>Lave lâminas em um frasco de Coplin contendo 2x SSC por 5 min a 45 °C. Repita este passo uma vez.</li>
	<li>Adicione 20 μl de mídia de montagem de DAPI aos slides e cubra com um deslizamento de tampa. Pressione suavemente o vidro de cobertura para remover a mídia de montagem extra. Borrar mídia extra de montagem com tecido de limpeza. Os slides estão prontos para avaliação de microscopia.</li>
</ol>

<ol><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li>
<li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+nascent+RNA%2C+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li>
<li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li>
<li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li>
<li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li>
<li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li>
<li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+imprinted+X+inactivation%3A+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li>
<li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li>
<li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li>
</ol>

O autor não tem nada a revelar.

Na preparação do slide 3D, a etapa de permeabilização precede a etapa de fixação. Essas etapas são realizadas diretamente em túbulos seminiferos, preservando assim a estrutura de cromatina tridimensional. Uma opção alternativa para preservar a estrutura de cromatina para RNA/DNA FISH é realizar a etapa de permeabilização e a etapa de fixação simultaneamente. Esta técnica alternativa tem sido realizada em células germinativas marsupiais e embriões de pré-implantação de camundongos7,8. No entanto, se a etapa de ...

Em testículos, as células germinativas se diferenciam da espermatogonia diploide através da meiose em espermatozoides maduros e haploides. Durante esse processo, a estrutura de cromatina nuclear das células germinativas é continuamente e dinamicamente remodelada. As propagações superficiais são comumente usadas para o exame citológico de células espermatogênicas individuais. Um método predominante de propagação superficial emprega tratamento hipotônico pelo qual as células espermatogênicas individuais são espalhadas e achatadas1. Estas condições são ideais para análise detalhada de cromossomos meioticos. Características cromossômicas como status sináptico e focos de recombinação são facilmente observadas usando este método. No entanto, o tratamento hipotônico interrompe a arquitetura de cromatina subnuclear, portanto essa técnica não é adequada para análise estrutural de núcleos. Consequentemente, um método melhorado foi projetado para preservar a estrutura de cromatina tridimensional das células germinativas testiculares. Este método foi denominado como o método de slides tridimensional (3D)(Figura 1). O método de slides 3D permitiu a detecção da localização nascente do RNA em núcleos porque foi inicialmente otimizado para examinar a expressão genética e os estados de cromatina durante a diferenciação de células germinativas testiculares pela fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH)2,3. Este método 3D também é aplicável à combinação de imunofluorescência, DNA e RNA FISH. Além disso, este método tem auxiliado na descoberta da cromatina sexual pós-amioótica (PMSC), um compartimento silencioso dos cromossomos sexuais encontrados nos espermatozoides pós-meioticos2.
O método de slides 3D foi originalmente otimizado através da combinação de duas etapas essenciais de preparação de slides comumente utilizadas para coloração nuclear: a etapa de fixação projetada para fixar materiais nucleares e a etapa de permeabilização destinada a remover materiais citoplasmáticos a fim de melhorar a acessibilidade de reagentes de coloração, como anticorpos e sondas FISH. Como descrito anteriormente em outrapublicação 3,foi determinado que a etapa de permeabilização deve preceder a etapa de fixação, a fim de obter resultados ideais com baixo fundo citoplasmático. Neste método de slides 3D, a etapa de permeabilização e a etapa de fixação subsequente são realizadas diretamente em túbulos seminiferos e são seguidas pela dissociação mecânica de células germinativas com fórceps antes de citospinning em slides. Um método alternativo para RNA FISH de células espermatogênicas foi desenvolvido em outro laboratório4. Neste método, consistente com o método 3D, a etapa de permeabilização deve preceder a etapa de fixação para obter resultados ideais de RNA FISH.
O protocolo a seguir descreve o método de slides 3D e fornece um exemplo de uma possível aplicação, Cot-1 RNA FISH para a detecção de RNAs de nascente nuclear. O DNA do Cot-1 consiste em elementos repetitivos no genoma. Aqui, uma sonda de DNA Cot-1 é hibridizada para um intron e UTR das transcrições nascentes, detectando assim as regiões transcricionáriamente ativas no núcleo5,6. Slides 3D são versáteis e podem ser aplicados a uma combinação de técnicas de imunofluorescência, DNA e RNA FISH, a fim de obter um exame detalhado das relações espaciais entre a arquitetura da cromatina.

<table><tbody><tr><td>DNA Cot-1&nbsp;</td>Kit de Rotulagem de Fluorescência Fluor Stratagene Prime-It <td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr> Solução de <tr><td>DNA de Esperma de Arenque</td><td>Agilent</td> 300380 <td></td> Invitrogen 15634-017 <td></td></tr><tr><td>Etanol. 200 provas (absolutas)</td> <td>Pharmco-aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Formamida deionizada <td></td></tr><tr><td></td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio tribásico di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Lifeblood Medical</td><td>77110-100</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sódio de sulfato de dextrano de Leuconostoc spp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>A10491-01</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>TUBOS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Meio de montagem com DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1200</td><td></td></tr><tr><td>Complexo ribonucleosídeo-vanadil</td><td>New England Biolabs</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin G-50 Colunas</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 3</td><td>Shandon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost /Plus Lâminas de Microscópio</td><td>Prato de 4 poços Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Tampa</td> de vidro <td>Fisher</td><td>12-566-301</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Incubadora de ar <td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ciência revolucionária</td><td>RS-IF-203</td><td></td></tr></tbody></table>

método de preparação de slides para preservar arquitetura de cromatina tridimensional de células germinativas testiculares

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Durante a diferenciação das células germinativas testiculares, a estrutura da cromatina nuclear muda dinamicamente. Descreve um método projetado para preservar o arranjo tridimensional de cromatina de células germinativas testiculares encontradas em camundongos; este método foi denominado como o método de slides tridimensional (3D). Neste método, os túbulos testiculares são tratados diretamente com uma etapa de permeabilização que remove o material citoplasmático, seguido por uma etapa de fixação que fixa materiais nucleares. Os túbulos são então dissociados, a suspensão celular é citospun, e as células aderem aos slides. Este método melhora a sensibilidade para a detecção de estruturas subnucleares e é aplicável para imunofluorescência, DNA e fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH) e a combinação desses métodos de detecção. Como exemplo de uma possível aplicação do método de slides 3D, um PEIXINHO RNA Cot-1 é mostrado para detectar RNAs nascentes. O método de slides 3D facilitará o exame detalhado das relações espaciais entre estrutura de cromatina, DNA e RNA durante a diferenciação de células germinativas testiculares.

Um resultado representativo de um slide 3D é mostrado na Figura 2. Neste experimento, o Cot-1 RNA FISH foi realizado para detectar transcrição nascente juntamente com a imunostaining usando anticorpos anti CBX1 e γH2AX. Para combinar RNA FISH e imunostaining, a imunostaining foi realizada primeiro, seguida por RNA FISH como descrito em3. CBX1 é uma proteína heterocromatina que localiza a heterocromatina pericentromérica e cromossomos sexuais silenciosos na meiose chamada corpo XY (ou corpo sex...

O material aqui descreve um método desenvolvido para preservar a estrutura de cromatina tridimensional das células germinativas testiculares. Este foi chamado de método de slides tridimensional (3D). Este método melhora a sensibilidade para detecção de estruturas subnucleares e é aplicável para imunofluorescência, DNA e fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH).

Método de preparação de slides para preservar arquitetura de cromatina tridimensional de células germinativas testiculares

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Este método de preparação de lâminas tridimensionais preserva o arranjo de cromatina 3D das células, conforme demonstrado com células germinativas testiculares de camundongos. Primeiro, faça permanente nos túbulos ferosos para remover os materiais citoplasmáticos e melhorar a acessibilidade dos reagentes de coloração, como anticorpos e sondas de peixe. Depois de fixar os materiais nucleares, dissocie mecanicamente as células germinativas com uma pinça e citosine as amostras em lâminas.Em seguida, adquira dados com várias seções Z para cobrir um núcleo em 3D quando aplicados estrategicamente resultados de preparações de lâminas 3D. O uso de peixes de RNA COT um pode mostrar RNAs nucleares nascentes para detectar as regiões transcricionalmente ativas no núcleo. Desenvolvi esse método quando estava no laboratório de genes do Hospital Geral de Massachusetts.Naquela época, otimizei o método de preparação de lâminas para a visão fluorescente de RNA de algodão para hibridização, também chamada de peixe para detectar nacent. RNA. As sondas de algodão podem hibridizar sequências repetitivas em íntrons e tls e visualizar o local da transcrição ativa. Os peixes de algodão RA requerem preserva

slide-preparation-method-to-preserve-three-dimensional-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo de vídeo ilustra a técnica de squash usado em laboratório para preparar...

Preparação de Abóboras Drosophila cromossomos politênicos para Rotulagem de anticorpos

Os cromossomas podem ser isolados a partir de células vivas, tais como linfócitos ou fibroblastos de pele, e a partir de organismos, incluindo seres humanos ou ratinhos. Estas preparações cromossômicas pode ser ainda utilizado para a rotina de bandamento G e procedimentos de citogenética molecular, como a hibridização fluorescente in situ (FISH), hibridização genômica comparativa (CGH), e cariotipagem espectral (SKY).

Cromossomo Preparação a partir de células cultivadas

Os métodos para isolar e preparar amostras de testículos de Drosophila (ao vivo e fixo) para geração de imagens por contraste de fase e microscopia de fluorescência são descritos aqui.

Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Nós fornecemos aqui um protocolo eficiente e confiável para a imunocoloração, hibridação in situ fluorescente, a coloração do DNA seguido de quantitativo, imagem de alta resolução em Arabidopsis thaliana óvulos inteiros de montagem. Este método foi utilizado com sucesso para analisar as modificações da cromatina e arquitectura nuclear.

Um método eficiente para Quantitativa, Análise de células Único de cromatina Modificação e Arquitetura Nuclear em Todo-mount óvulos em<em&gt; Arabidopsis</em

Meiose é o processo de desenvolvimento pelo qual gâmetas são formadas através de uma única rodada de replicação de DNA e duas rodadas sucessivas de segregação do cromossomo. Mamíferos meiose pode ser examinado, utilizando uma técnica para preparar os cromossomas se espalha. Aqui, vamos demonstrar um método de preparação de superfície-propagação núcleos de espermatócitos de rato.

Preparação de cromossomas se espalha a partir do Mouse espermatócitos

Oogénese nos mamíferos é conhecido por ser propenso a erro, especialmente devido à missegregation do cromossomo. Este manuscrito descreve métodos de preparação de cromatina espalhado para prófase rato, metáfase I e II-encenado oócitos. Estas técnicas fundamentais permitem o estudo de proteínas da cromatina-limite e a morfologia do cromossomo durante a ovogênese mamífera.

Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

É apresentado aqui um protocolo para enriquecer spermatocytes do paquíteno, espermátides redondos, e espermátides alongando dos testículos adultos do rato usando um inclinação bovino descontínuo da densidade da albumina do soro com equipamento de laboratório padrão.

Enriquecimento de espermatócitos de Pachytene e Spermatids de testes de camundongo usando equipamento de laboratório padrão

Os spreads de superfície nuclear são uma ferramenta indispensável para estudar eventos cromossomos durante a meiose. Aqui demonstramos um método para preparar e visualizar cromossomos meioóticos durante a profase I de espermatotatocitos de zebrafish.

Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish

O objetivo deste protocolo é analisar a divisão celular em tecido intacto por microscopia celular viva e fixa usando espermatocitos meióticos drosophila. O protocolo demonstra como isolar testículos inteiros e intactos das larvas de Drosophila e pupas primitivas, e como processá-los e montá-los para microscopia.

Preparação de Drosophila Larval e Pupal Testes para Análise de Divisão Celular em Tecido Vivo e Intacto

Apresentamos aqui um protocolo aprimorado para a preparação e imunossagem completa de testículos Drosophila, adequados para microscopia confocal e também permitindo rotulagem reprodutível e confiável. Ilustramos este protocolo por representação 3D e quantificação de experimentos de colocalização nos grandes espermatos S4-S5.

Imunostaining de Testes Drosophila de Monte Inteiro para Análise Confocal 3D de Grandes Espermatocitos

Erros meióticos nas sinapses e recombinação são comuns aos oócitos de mamíferos. A análise rigorosa das proteínas envolvidas nesses processos é essencial para entender como e por que a oogênese geralmente dá errado. As técnicas apresentadas aqui permitem o monitoramento abrangente da recombinação e sinapses para avaliar a qualidade do oócito em camundongos.

Preparação de Spreads Cromossômicos Meióticos de Oócitos de Camundongos para Avaliação de Sinapse e Recombinação

Aprenda um método de preparação de slides 3D que preserva a arquitetura da cromatina em células germinativas testiculares de camundongos. Esta técnica melhora a detecção de estruturas subnucleares para estudos de biologia celular.

Método de preparação de slides para preservar arquitetura de cromatina tridimensional de células germinativas testiculares

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