Método de preparação de slides para preservar arquitetura de cromatina tridimensional de células germinativas testiculares
10 de janeiro de 2014
O material aqui descreve um método desenvolvido para preservar a estrutura de cromatina tridimensional das células germinativas testiculares. Este foi chamado de método de slides tridimensional (3D). Este método melhora a sensibilidade para detecção de estruturas subnucleares e é aplicável para imunofluorescência, DNA e fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH).
Este método de preparação de lâminas tridimensionais preserva o arranjo de cromatina 3D das células, conforme demonstrado com células germinativas testiculares de camundongos. Primeiro, faça permanente nos túbulos ferosos para remover os materiais citoplasmáticos e melhorar a acessibilidade dos reagentes de coloração, como anticorpos e sondas de peixe. Depois de fixar os materiais nucleares, dissocie mecanicamente as células germinativas com uma pinça e citosine as amostras em lâminas.
Em seguida, adquira dados com várias seções Z para cobrir um núcleo em 3D quando aplicados estrategicamente resultados de preparações de lâminas 3D. O uso de peixes de RNA COT um pode mostrar RNAs nucleares nascentes para detectar as regiões transcricionalmente ativas no núcleo. Desenvolvi esse método quando estava no laboratório de genes do Hospital Geral de Massachusetts.
Naquela época, otimizei o método de preparação de lâminas para a visão fluorescente de RNA de algodão para hibridização, também chamada de peixe para detectar nacent. RNA. As sondas de algodão podem hibridizar sequências repetitivas em íntrons e tls e visualizar o local da transcrição ativa. Os peixes de algodão RA requerem preservação da distribuição de RNA nuclear.
O ponto-chave deste método de preparação correto é que as etapas de ização precisam prosseguir A etapa de fixação. Para remover o fundo plasmático de Cy, desvende os túbulos OUS de um testículo rompido em PBS no gelo, transfira vários pedaços de túbulos de cinco a 10 milímetros de comprimento para 500 microlitros de tampão CSK com 0,5% de tritton X 100 e incube por seis minutos no gelo. Agora transfira todos os túbulos para a solução 4%P-F-A-P-B-S em um poço de uma placa de quatro poços incube por 10 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, incube todos os túbulos em PBS por cinco minutos em temperatura ambiente. Configure as câmaras de spin e spin durante os períodos de incubação na parte de trás de uma lâmina de vidro, transfira todos os túbulos para 30 microlitros de PBS. Em seguida, use as pontas de duas pinças para rasgar os túbulos em pedaços.
Corte os túbulos na direção horizontal, prendendo-os entre as pontas de duas pinças e puxando a pinça horizontalmente. Depois de adicionar 30 microlitros de PBS, misture a suspensão pipetando, transfira-a para um tubo de microcentrífuga e adicione PBS a um volume total de 1,3 mililitros. Agora aplique 100 microlitros da suspensão em cada uma das câmaras de centrifugação do cito. Cito.
Centrifugar as amostras a 2000 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente. Seque as lâminas em uma bancada de laboratório por alguns minutos em temperatura ambiente usando um frasco de coplan contendo PBS. Lave as lâminas por cinco minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, transfira as lâminas para etanol a 70% por pelo menos dois minutos. Em uma reação de 20 microlitros, adicione 100 nanogramas capturados, sonda 1D NA, complexo de ribonucleotídeo vanadil de 20 milimolares e tampão de hibridização. Usando uma máquina de PCR, incubar por 10 minutos a 80 graus Celsius, seguido de prea.
Passo ajoelhado a 42 graus Celsius até a hora de usar. Agora desidrate sucessivamente as lâminas em etanol a 80% por dois minutos, seguido de etanol a 100% por dois minutos. Seque as lâminas completamente na bancada do laboratório à temperatura ambiente.
Agora coloque a lâmina em uma câmara de caixa de ponta a 42 graus Celsius. Em seguida, centrifugue brevemente as sondas de pré-necessidade e pipete-as diretamente nas lâminas desidratadas. Coloque suavemente uma lamínula sobre a lâmina para a etapa de hibridização de pelo menos seis horas a 42 graus Celsius.
Pré-aqueça as soluções de lavagem em frascos de coplan a 42 graus Celsius por 30 minutos em banho-maria usando uma lâmina de barbear, remova a lamínula da borda da lâmina sem arranhar as amostras mergulhe progressivamente as lâminas na solução de lavagem por cinco minutos cada. Começando com o primeiro frasco de coplan contendo dois XSSC e 50% de forma no meio, seguido pelo segundo frasco de coplan contendo dois XSSC e 50% de forma no meio. E então os dois últimos frascos contendo dois XSSC.
Em seguida, adicione 20 microlitros de mídia de montagem DPI às amostras e coloque uma lamínula. Pressione suavemente a lamínula e seque a mídia de montagem extra com um lenço de limpeza. Neste experimento, um peixe de RNA capturado foi realizado para detectar simultaneamente a transcrição nascente e a imunocoloração de proteínas que se localizam na imuno-histoquímica do corpo XY.
Nesta SRPA, o espermatócito detectou a proteína heterocromatina CCB X um e também uma forma fosforilada da variante de histona H dois A X no corpo XY. O peixe resultante captou um sinal acumulado nas regiões cromáticas e em spreads superficiais tratados com solução hipotônica. A estrutura tridimensional da cromatina é interrompida e todos os eixos cromossômicos mióticos podem ser capturados em um único plano Z.
A preparação da lâmina 3D, no entanto, preserva a estrutura intacta da cromatina Seguindo este procedimento. Este método de preparação correto é aplicável para peixes de DNA e RNA de imunofluorescência e a combinação desses métodos de detecção.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um novo método tridimensional (3D) de preparação de lâminas que preserva a estrutura da cromatina de células germinativas testiculares. O método aumenta a sensibilidade para a detecção de estruturas subnucleares e é adequado para diversas técnicas de fluorescência.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Genética
Antecedentes
- Compreender a estrutura da cromatina é fundamental para estudar a expressão gênica.
- Métodos tradicionais podem não preservar adequadamente os arranjos tridimensionais da cromatina.
- As células germinativas testiculares servem como modelo para estudar a dinâmica da cromatina.
- A imunofluorescência e a FISH são técnicas essenciais para visualizar a cromatina.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método que mantenha a estrutura tridimensional da cromatina em células germinativas.
- Aprimorar a detecção de estruturas nucleares utilizando técnicas avançadas de imagem.
- Facilitar o estudo de regiões transcricionalmente ativas dentro do núcleo.
Métodos Utilizados
- Permeabilização dos túbulos seminíferos para aumentar a acessibilidade da coloração.
- Dissociação mecânica de células germinativas para preparação de lâminas.
- Aplicação de múltiplas seções Z para imagem 3D de núcleos.
- Uso de COT one RNA FISH para visualizar RNAs recém-sintetizados.
Resultados Principais
- O método do lâmina 3D preserva efetivamente a arquitetura da cromatina.
- Obteve-se sensibilidade aprimorada para a detecção de estruturas subnucleares.
- Visualização bem-sucedida de regiões transcricionalmente ativas no núcleo.
- O método é aplicável a várias técnicas de fluorescência.
Conclusões
- O método de preparação de lâminas 3D é um avanço significativo na pesquisa de cromatina.
- Essa técnica pode aprimorar nossa compreensão da regulação gênica.
- Aplicações futuras podem estender-se a outros tipos celulares e áreas de pesquisa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A preservação da arquitetura nativa da cromatina permite uma avaliação precisa da atividade transcricional e da organização nuclear em modelos de células germinativas. Este método auxilia na validação de alvos ao manter as relações espaciais entre DNA, RNA e complexos proteicos durante a diferenciação. Ele fornece uma plataforma reprodutível para a redução de riscos mecanicistas em fluxos de trabalho de descoberta precoce.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Interroga hipóteses terapêuticas preservando a arquitetura cromatínica tridimensional para avaliação precisa do engajamento do alvo.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional do alvo por meio da detecção da co-localização de RNA nascente e proteínas em núcleos intactos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao revelar dinâmicas da cromatina associadas à regulação transcricional em sistemas relevantes para doenças.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem por imunofluorescência e FISH de compostos que modulam a cromatina.
- Saída Quantitativa: Gera dados padronizados em pilhas Z de múltiplas seções, permitindo comparação confiável de padrões de coloração nuclear.
- Escalabilidade: Permite reutilização da plataforma em múltiplos alvos, mantendo a sensibilidade à estrutura subnuclear para aplicações posteriores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Mantém a continuidade da cromatina desde modelos de diferenciação de células germinativas até a validação pré-clínica de alvos epigenéticos.
- Alinhamento de Biomarcadores: Facilita o desenvolvimento translacional de biomarcadores ao preservar as interações espaciais entre RNA e DNA indicativas de estados transcricionais.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a redução de riscos mecanicistas por meio da visualização direta das alterações na arquitetura nuclear em resposta a perturbações.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho da biologia do descobrimento ao preservar a estrutura da cromatina para testes de hipóteses e esclarecimento de vias em modelos de células germinativas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao manter arranjos de cromatina nativos para interpretação precisa de dados de imagem.
- Triagem: Garante prontidão para ensaios por meio de preparação reprodutível de lâminas, compatível com detecção de imunofluorescência multiplexada e FISH.
- Análises: Permite comparação quantitativa de estruturas nucleares por meio de imagens de seções Z e medições de co-localização de sinais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao preservar estados de cromatina relevantes para a validação de mecanismos epigenéticos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma baseada em citocentrifugação reutilizável para preservação da arquitetura da cromatina em múltiplos estágios de células germinativas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista em estudos de organização nuclear.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de etapas definidas de permeabilização, fixação e citocentrifugação.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não ao permitir a visualização direta da atividade transcricional em contextos de cromatina intacta.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco por meio da validação funcional baseada em cromatina de alvos em modelos de diferenciação de células germinativas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em biologia da cromatina e microscopia de fluorescência para execução e interpretação adequadas.
- Depende de equipamento de centrífuga de citocina e sistemas de tampão otimizados para preparação consistente de lâminas.
- Necessita padronização entre equipes quanto ao tempo de permeabilização e fixação para preservar a distribuição de RNA nuclear.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a outros tipos celulares com fragilidade nuclear distinta.
- Limitado pela necessidade de dissociação mecânica cuidadosa para evitar a ruptura da cromatina durante o processamento de túbulos.
