Name: In vitro Ensaio de cocultura para avaliar migração trans epitelial de neutrófilo induzida por patógenos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Aprenda a avaliar a migração trans epitelial de neutrófilos induzida por patógenos usando um ensaio de cocultura in vitro com células epiteliais humanas e bactérias. Este método permite quantificar a resposta imune em infecções de mucosas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo NIH (1 R01 AI095338-01A1).

<ol><li>Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+structural+features+that+influence+neutrophil+emigration+into+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung.</a> Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+defense+systems+protect+against+bacterial+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gastroenterol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats.</a> Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial-induced+hepoxilin+A3+secretion+as+a+pro-inflammatory+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator.</a> FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).</li>
<li>Mumy, K. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophils+in+the+event+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).</li>
<li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration%3A+implications+in+mediating+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li>
<li>Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paradox+of+the+neutrophil%27s+role+in+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">The paradox of the neutrophil's role in tissue injury.</a> J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).</li>
<li>Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+destruction+by+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue destruction by neutrophils.</a> N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).</li>
<li>Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga+toxin+translocation+across+intestinal+epithelial+cells+is+enhanced+by+neutrophil+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration.</a> Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).</li>
<li>Kohler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+regulates+intercellular+junction+proteins+and+facilitates+transepithelial+neutrophil+and+bacterial+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).</li>
<li>Gane, J., Stockley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transmigration+across+the+vascular+endothelium+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD.</a> Thorax. 67, 553-561 (2012).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol. Med. 17, 293-307 (2011).</li>
<li>Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophilic+inflammation+in+severe+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Arch.+Allergy+Immunol.%22%5BJournal%5D)">Neutrophilic inflammation in severe asthma.</a> Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).</li>
<li>Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transendothelial migration.</a> Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).</li>
<li>Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+to+investigate+neutrophil+adhesion+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).</li>
<li>Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+to+the+lungs+during+bacterial+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia.</a> Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+tissue+culture+results+into+animal+models%3A+the+case+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium.</a> Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).</li>
<li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li>
<li>Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+cell+transmigration+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+requires+the+eicosanoid+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+attachment+to+human+intestinal+epithelial+monolayers%3A+transcellular+signalling+to+subepithelial+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils.</a> J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).</li>
<li>McCormick, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+attachment+of+Salmonella+typhimurium+to+intestinal+epithelia+imprints+the+subepithelial+matrix+with+gradients+chemotactic+for+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils.</a> J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).</li>
<li>Mrsny, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hepoxilin+A3+in+inflammatory+events%3A+a+required+role+in+neutrophil+migration+across+intestinal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).</li>
<li>Tamang, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepoxilin+A%283%29+facilitates+neutrophilic+breach+of+lipoxygenase-expressing+airway+epithelial+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers.</a> J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).</li>
<li>McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+secretion+of+a+pathogen-elicited+epithelial+chemoattractant+activity+in+response+to+surface+colonization+of+intestinal+epithelia+by+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium.</a> J. Immunol. 160, 455-466 (1998).</li>
<li>Boll, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroaggregative+Escherichia+coli+promotes+transepithelial+migration+of+neutrophils+through+a+conserved+12-lipoxygenase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway.</a> Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).</li>
<li>Hurley, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-component+sensor+response+regulator+RoxS%2FRoxR+plays+a+role+in+Pseudomonas+aeruginosa+interactions+with+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells.</a> Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).</li>
<li>Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-mediated+PMN+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).</li>
<li>McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+the+Shigella+flexneri+virulence+plasmid+in+the+ability+to+induce+trafficking+of+neutrophils+across+polarized+monolayers+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium.</a> Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).</li>
<li>Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+a+noninvasive+enteric+pathogen%2C+enteropathogenic+Escherichia+coli%2C+to+cultured+human+intestinal+epithelial+monolayers+induces+transmigration+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils.</a> Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).</li>
<li>Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERM+protein%2C+ezrin%2C+regulates+neutrophil+transmigration+by+modulating+the+apical+localization+of+MRP2+in+response+to+the+SipA+effector+protein+during+Salmonella+typhimurium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection.</a> Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).</li>
<li>Pazos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+resistance-associated+transporter+2+regulates+mucosal+inflammation+by+facilitating+the+synthesis+of+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).</li>
<li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li>
<li>Bhowmick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Disease+during+Streptococcus+pneumoniae+Acute+Lung+Infection+Requires+12-Lipoxygenase-Dependent+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation.</a> J. Immunol. , (2013).</li>
<li>Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+eicosanoid-generating+capacity+of+cytoplasmic+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-infected+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).</li>
<li>Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+involved+in+hepoxilin+A3-mediated+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration.</a> Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).</li>
<li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+Topic+on+Pseudomonas+aeruginosa%2C+Biology%2C+Genetics%2C+and+Host-Pathogen+Interactions.%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.</a> Front. Microbiol. 3, 20 (2012).</li>
<li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+infections+associated+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lung infections associated with cystic fibrosis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).</li>
<li>Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa-mediated+damage+requires+distinct+receptors+at+the+apical+and+basolateral+surfaces+of+the+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium.</a> Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).</li>
<li>Kierbel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exploits+a+PIP3-dependent+pathway+to+transform+apical+into+basolateral+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).</li>
<li>Lee, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+Salmonella+protein+induces+a+proinflammatory+response+in+epithelial+cells%2C+which+promotes+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).</li>
<li>Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+flexneri+type+III+secretion+system+effectors+OspB+and+OspF+target+the+nucleus+to+downregulate+the+host+inflammatory+response+via+interactions+with+retinoblastoma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein.</a> Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).</li>
<li>Brazil, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+across+intestinal+epithelium%3A+evidence+for+a+role+of+CD44+in+regulating+detachment+of+migrating+cells+from+the+luminal+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface.</a> J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).</li>
<li>Lawrence, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiadhesive+role+of+apical+decay-accelerating+factor+%28CD55%29+in+human+neutrophil+transmigration+across+mucosal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia.</a> J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).</li>
<li>Hodges, K., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+communication+in+the+gut%2C+from+bacterial+delivery+to+host-cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response.</a> J. Physiol. 590, 433-440 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A migração de neutrófilos através das superfícies epiteliais mucosas é uma característica comum na patologia da doença após a infecção com patógenos bacterianos3. A metodologia descrita aqui oferece uma abordagem rápida e direta para isolar experimentalmente este evento discreto usando um sistema de ensaio de cocultura in vitro derivado de células humanas que modela uma característica do processo inflamatório desencadeado por infecções bacterianas. Este sistema foi originalmente desenvolvido usando cé...

As superfícies mucosas servem como barreiras físicas e imunológicas que proporcionam proteção contra ameaças externas generalizadas no meio ambiente1,2. Esta barreira epitelial protetora pode ser comprometida quando organismos patogênicos invadem2. No caso de um patógeno bacteriano, esse encontro muitas vezes instiga um processo inflamatório ativando o sistema imunológico inato e desencadeando uma rápida mobilização de granulócitos de primeiros socorros conhecidos como neutrófilos2-4. Agentes chemotactic facilitando o recrutamento de neutrófilos são produzidos em parte pelas células epiteliais mucosas que buscam livrar o hospedeiro do patógenoofensivo 2-4. Infiltração de neutrófilo excessivo ou não resolvida da superfície epitelial mucosa pode causar patologia significativa1,5. Isso é consequência de danos teciduais não específicos causados pelo arsenal antibacteriano de neutrófilo5-7. Nesses casos, a capacidade de liberação bacteriana de neutrófilos é ofuscada pela destruição do tecido hospedeiro durante um insulto infeccioso.  A interrupção da função de barreira epitelial protetora pode levar a uma maior exposição do tecido subjacente a microrganismos e/ou toxinas, exacerbando ainda mais a patologia da doença8,9. Essas consequências podem ser observadas em múltiplos sistemas de órgãos, incluindo o pulmão e o trato digestivo1,5. Além disso, condições inflamatórias não infecciosas, como crises graves de asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS) e doença inflamatória intestinal (DII) são marcadas pela ruptura patológica da barreira epitelial mucosa por uma resposta neutrófila excessiva4,5,10-12.
O complexo processo de recrutamento de neutrófilos após infecção mucosa envolve várias etapas compartimentadas1,5,13,14. Primeiro, os neutrófilos devem sair de circulação através de uma série de interações célula-celular que facilitam a migração trans-endotelial1,13. Os neutrófilos navegam em seguida no espaço intersticial existente contendo matriz extracelular1,14. Para alcançar o lúmen da mucosa infectada, os neutrófilos devem migrar através da barreira epitelial1,4,5. Este intrincado fenômeno multistep é frequentemente investigado em agregado usando modelos in vivo animais de infecção15. Tais modelos são úteis para estabelecer a necessidade de fatores específicos, como quimiocinas, moléculas de adesão ou caminhos de sinalização que participam do processo global, mas são em grande parte inadequados para a resolução de contribuições moleculares críticas para cada etapa compartimentalizada distinta16. Sistemas in vitro coculturados modelando migração trans-endotelial, trans matricial ou trans-epitelial de neutrófilos têm sido particularmente úteis a este respeito1,14,16,17.
Um robusto sistema de ensaio de cocultura foi desenvolvido com o objetivo de decifrar mecanismos responsáveis pela migração trans-epitelial de neutrófilos em resposta à infecção patogênica18-22. Este modelo envolve infectar a superfície apical de camadas de células epiteliais humanas polarizadas com um patógeno bacteriano seguido pela aplicação de neutrófilos humanos recém-isolados na superfície basolateral18-22. Os neutrófilos migram através da barreira epitelial em resposta a produtos quimiolíticos derivados da epitelial secretados após infecção patogênica18,21-23. Este sistema modelo tem sido empregado usando culturas epiteliais intestinais e pulmonares expostas a patógenos bacterianos específicos do tecido apropriado e revelou novos mecanismos moleculares provavelmente importantes para o processo de recrutamento de neutrófilos durante a infecção mucosa3,8,19,24-28. A força deste modelo de cocultura in vitro é que uma abordagem reducionista permite ao pesquisador manipular experimentalmente o patógeno, a barreira epitelial e/ou o neutrófilo em um sistema bem controlado, altamente reprodutível e bastante barato. Os insights obtidos a partir dessa abordagem podem ser efetivamente aproveitados para realizar análises focadas de eventos compartimentados durante o recrutamento de neutrófilos usando modelos de infecção in vivo 22,29,30.
Este artigo demonstra os múltiplos passos necessários para o estabelecimento bem-sucedido deste modelo reprodutível para explorar a migração trans-epitelial induzida pelo patógeno. As barreiras epiteliais pulmonares infectadas com o patógeno Pseudomonas aeruginosa são destaque neste artigo; no entanto, outras epitélios teciduais e patógenos podem ser substituídos por pequenas modificações. A semeadura e a colheita de camadas de células epiteliais pulmonares polarizadas em filtros transwell permeáveis revestidos de colágeno invertidos são detalhados aqui, assim como o crescimento da P. aeruginosa patogênica e o isolamento de neutrófilos de sangue inteiro. Como esses componentes são combinados para observar a migração trans-epitelial induzida pelo patógeno é apresentada juntamente com controles positivos e negativos apropriados para estabelecer um ensaio reprodutível. A versatilidade dessa abordagem para examinar vários aspectos da migração trans-epitelial induzida pelo patógeno é discutida com referência a estudos específicos na literatura.

<table><tbody><tr><td>Células NCl-H292</td><td>ATCC</td><td>CRL-1848</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 meio</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa PAO1</td><td>ATCC#</td><td>47085</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MC1000</td><td>ATCC</td><td>#39531</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) líquido</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td>sem cálcio e magnésio</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal inativado por calor</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>10% adicionado ao meio de cultura</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100x: 10.000 unidades de penicilina e 10.000 &micro; g de estreptomicina por ml.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td>alíquotas de 50 ml são armazenadas congeladas a -20 °C. A alíquota em uso pode ser armazenada em 4 &ordm; C curto prazo.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hank - HBSS(-)</td><td>Invitrogen</td><td>14175-079</td><td>Estéril, sem cálcio e magnésio</td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061.</td><td>Estoque = 0.4%</td></tr><tr><td>Colágeno, Cauda de Rato</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>Também pode ser isolado em laboratório diretamente das caudas de ratos usando protocolos padrão</td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909-500G</td><td>Componente de tampão citrato 1 M e solução de citrato ácido dextrose (ACD)</td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td>Componente de tampão citrato</td></tr> 1 <tr><td>M Dextrose anidra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8066-250G</td><td>Componente da solução de citrato ácido dextrose (ACD) Cloreto de</td></tr><tr><td>amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213330-500G</td><td>Componente do tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC)</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td>Componente do tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED-100G</td><td>Componente do tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC)</td></tr><tr><td>HBSS(+) pó</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387-10L</td><td>Componente chave de HBSS+</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>Componente de HBSS+</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td>Siga as instruções do fornecedor para revestir ponteiras de pipeta de vidro</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-Azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) sal de diamônio (ABTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9941-50TAB</td><td>Componente-chave da solução de substrato ABTS</td></tr><tr><td>Solução de peróxido de hidrogênio a 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>Componente da solução de substrato ABTS</td></tr><tr><td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP ou fMLF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-3506</td><td>Uma solução estoque de 10 mM em DMSO deve ser preparada e alíquotas armazenadas a -20 &ordm;C.</td></tr><tr><td>Gelatina Tipo B</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-12026</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas isolação agar&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0927-17-1</td><td>Siga o fabricante' s instruções para fazer placas PIA</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-749</td><td>Opcional, pode melhorar a pureza dos neutrófilos</td></tr><tr><td>Placa de migração de 24 poços</td><td>Corning Incorporated</td><td>#3524</td><td></td></tr><tr><td>Placa de lavagem de 24 poços</td><td>Falcon</td><td>35-1147</td><td>Pode ser reutilizada se embebida em etanol a 70% e lavada completamente antes de reutilizar</td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12565501</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Permeável Suportes&nbsp;</td><td>Corning Incorporated</td><td>#3415</td><td>Policarbonato; Diâmetro: 6,5 mm; Área de crescimento: 0,33 cm2; Estilo do prato: placa de 24 poços; Tamanho do poro: 3.0 &micro; m</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Falcon</td><td>35-1013</td><td>Cada placa de Petri comporta 24 Transwells invertidos de 0,33 cm2.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>500 ml 0,2 &mu; m filtro / frasco</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25A</td><td>Para esterilizar a solução de citrato ácido dextrose (ACD)</td></tr><tr><td>5-3/4 em vidro Pipeta Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>Cubra as pontas com Sigmacote antes de usar</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-14</td><td>Microscópio Invertoskop Invertido Curvo, Serrilhado</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>#342222</td><td></td></tr><tr><td>Versa-Max Dispositivos moleculares de leitor de microplacas</td><td></td><td>#432789</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro ensaio de cocultura para avaliar migração trans epitelial de neutrófilo induzida por patógenos

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

As superfícies mucosas servem como barreiras protetoras contra organismos patogênicos. As respostas imunes inatas são ativadas ao detectar patógenos que levam à infiltração de tecidos com células inflamatórias migratórias, principalmente neutrófilos. Esse processo tem o potencial de ser destrutivo para os tecidos se excessivo ou mantido em um estado não resolvido.  Modelos in vitro coculturizados podem ser utilizados para estudar os mecanismos moleculares únicos envolvidos na migração trans-epitelial induzida pelo patógeno. Este tipo de modelo fornece versatilidade no design experimental com oportunidade de manipulação controlada do patógeno, barreira epitelial ou neutrófilo. A infecção patogênica da superfície apical de monocamadas epiteliais polarizadas cultivadas em filtros transwell permeáveis instiga a migração basolateral fisiologicamente relevante para a migração trans-epitelial apical de neutrófilos aplicados à superfície basolateral. O modelo in vitro descrito aqui demonstra os múltiplos passos necessários para demonstrar a migração de neutrófilos através de uma monocamada epitelial pulmonar polarizada que foi infectada com P. aeruginosa patogênica (PAO1). A semeadura e a colheita de transwells permeáveis com células epiteliais pulmonares derivadas humanas é descrita, juntamente com o isolamento de neutrófilos de sangue humano inteiro e cultivo de PAO1 e não-patogênico K12 E. coli (MC1000).  O processo de emigração e a análise quantitativa de neutrófilos migrados com sucesso que foram mobilizados em resposta à infecção patogênica são mostrados com dados representativos, incluindo controles positivos e negativos. Este sistema de modelo in vitro pode ser manipulado e aplicado a outras superfícies mucosas. Respostas inflamatórias que envolvem infiltração excessiva de neutrófilos podem ser destrutivas para os tecidos hospedeiros e podem ocorrer na ausência de infecções patogênicas. Uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares que promovem a migração trans-epitelial de neutrófilos através da manipulação experimental do sistema de ensaio de cocultura in vitro descrito aqui tem um potencial significativo para identificar novos alvos terapêuticos para uma gama de doenças infecciosas mucosas, bem como inflamatórias.

Vários estudos demonstraram que as camadas epiteliais infectadas por patógenos facilitam a migração trans-epitelial de neutrófilos3,8,19,24-28,31,32. Isso ocorre por meio de uma indução específica de patógeno de um gradiente químico quimiofilo quimiofilo derivado de células epiteliais3,23. Por exemplo, p. aeruginosa patogênica interagindo com a superfície apical das células epiteliais pulmonares faz com que um número substancial de neutrófilos migrem através da camada epitelial18,22,25...

A migração trans-epitelial de neutrófilos em resposta à infecção bacteriana mucosa contribui para lesão epitelial e doença clínica. Foi desenvolvido um modelo in vitro que combina patógenos, neutrófilos humanos e camadas de células epiteliais humanas polarizadas cultivadas em filtros transwell para facilitar investigações para desvendar os mecanismos moleculares que orquestram esse fenômeno.

In vitro Ensaio de cocultura para avaliar migração trans epitelial de neutrófilo induzida por patógenos

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar o número de neutrófilos que cruzaram uma monocamada de células epiteliais em resposta à infecção. Isso é obtido codificando transwells de colágeno antes de cultivar cuidadosamente monocamadas de células epiteliais usando a manobra de filtro transwell invertido. Como segunda etapa, o patógeno bacteriano é cultivado para infectar a superfície apical da monocamada epitelial cultivada nos filtros transwell, o que faz com que as células epiteliais produzam atrativos endógenos de quimio de neutrófilos.Em seguida, neutrófilos isolados de sangue total são adicionados ao lado basolateral de monocamadas epiteliais infectadas cultivadas em filtros transwell para testar a migração de neutrófilos do lado basolateral para o apical. São obtidos resultados que mostram um aumento significativo no número de neutrófilos migratórios transepiteliais observados em resposta a monocamadas epiteliais infectadas com base na quantificação da mielo peroxidase de neutrófilos migrados. A demonstração visual desse método é crítica, pois a manobra do filtro transwell invertido para crescer e infectar barreiras epiteliais não é convencional e, portanto, pode ser menos acessível para grupos de pesquisa desconhecidos estabelecerem em seu laboratório.As implicações dessa técnica se estendem à terapia de doenças inflamatórias das vias aéreas envolvendo infecções como pneumonia ou fibrose cística, porque novos tratamentos podem ser desenvolvidos e testados para diminuir a quantidade de migração transepitelial de neutrófilos, o que pode mitigar os efeitos deletérios da violação de barreiras mucosas neutrofílicas excessivamente zelosas. Junto com Mark, que é um colega clínico em meu laboratório, demonstrando o procedimento estarão o técnico sênior Wahi Preza e o pós-doutorando Michael Pesos. Para começar remova a área de crescimento de 0.33 centímetro quadrado, Transwells com um tamanho de poro de três micrômetros da embalagem e coloque a placa de 24 poços contendo 12 transwells de cabeça para baixo dentro do capô.Levante a placa inferior e reserve. Transwells agora estará de cabeça para baixo. Descansando em cima da tampa da chama da placa de 24 poços, um hemostático para esterilidade e deixe esfriar.Usando os transwells de transferência de hemostáticos estéreis para uma placa de Petri de 150 por 25 milímetros, mantendo-os na posição invertida, pipetar 70 microlitros de uma solução preparada de colágeno de 30 microgramas por mililitro em etanol na membrana do filtro de cada superfície do transwell invertido A tensão deve manter esse volume de solução no lugar, pois não há paredes ao redor da membrana do filtro ao acessar a superfície da parte inferior. Tenha cuidado para que a solução de colágeno não escorra pela lateral do transwell e evite movê-los durante o procedimento de revestimento. Deixe a tampa da placa de Petri aberta por no mínimo quatro horas para permitir que o etanol evapore Para manter a esterilidade durante este processo.Mantenha o exaustor e a luz ultravioleta acesos após embalar as células epiteliais conforme descrito no protocolo de texto. Adicione 70 microlitros da solução de células suspensas Resus de um tubo de 15 mililitros a cada transwell revestido de colágeno invertido. Misture a suspensão celular invertendo suavemente o tubo periodicamente para evitar que as células se assentem no fundo do tubo de 15 mililitros enquanto semeiam os transwells.Uma vez que todos os transwells invertidos tenham sido semeados com células epiteliais, recoloque a tampa da placa de Petri e coloque cuidadosamente as células na incubadora de cultura de tecidos no dia seguinte. Adicione um mililitro de meio em cada poço da placa estéril original de 24 poços e use um hemostático esterilizado para virar cada poço trans invertido em cada poço contendo um mililitro de meio. Adicione 0,2 mililitros de meio na câmara superior de cada poço trans e retorne à incubadora de cultura de tecidos.Remova da incubadora a placa de 24 poços que suporta as camadas epiteliais que foram cultivadas na parte inferior das membranas do filtro Transwell por pelo menos oito dias. Segure a borda de cada poço trans com um hemostático e retire-o da placa de 24 poços. Inverta o transwell sobre um balde de resíduos para descartar o meio de cultura da câmara interna do Transwell.Mergulhe cada transwell em um copo de lavagem contendo a solução salina balanceada de Hank com cálcio e magnésio ou Hank's Plus para encher a câmara interna do Transwell. Em seguida, descarte o fluido da câmara interna em um balde de resíduos. Repita esta etapa por um segundo.Lave no Hank's plus após duas lavagens. Coloque os Transwells em uma nova placa de 24 poços contendo um mililitro de Hank's Plus. Em cada poço, observe a câmara superior de cada poço para avaliar a integridade da camada de células epiteliais.O Hank's Plus não deve vazar e encher a câmara superior do Transwell quando colocado no poço de uma placa de 24 poços contendo um mililitro de Hank's Plus. Depois de observar cuidadosamente cada transpoço, adicione 0,2 mililitros de Hanks Plus na câmara superior. Coloque a placa na incubadora por 30 a 60 minutos para equilibrar as camadas de células epiteliais para realizar o ensaio de migração transepitelial de neutrófilos.Segure cada transwell com um hemostático da placa de 24 poços de Wash Transwells equilibrados em Hank's Plus e descarte o fluido no poço superior em um balde de resíduos. Coloque cada transwell de cabeça para baixo em uma placa de Petri de 150 por 25 milímetros para seis dos transwells invertidos. Adicione 25 microlitros de Hanks plus a três dos transpoços invertidos.Infecte as células com 25 microlitros de Pseudomonas, arosa ou Pao diluídos em Hanks plus preparados conforme descrito no protocolo de texto para os três transwells invertidos finais infectam as células com 25 microlitros de e Coli, K 12 ou mc 1000 diluídos em Hanks Plus também preparados conforme descrito no protocolo de texto após incubação a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma câmara umidificada por 60 minutos. Lave os transwells segurando com um hemostático e virando-os de volta em uma placa de lavagem de 24 poços que contém um mililitro de Hank's plus. Nas câmaras inferiores.Adicione 0,2 mililitros de Hank's plus às câmaras superiores. Segure o Transwell com um hemostático e remova-o da primeira placa de lavagem. Descarte o fluido da câmara superior em um balde de resíduos.Antes de colocar os Transwells em uma segunda placa de lavagem de 24 poços contendo um mililitro de Hanks plus, adicione 0,2 mililitros de Hanks plus à câmara superior. Repita esta etapa mais uma vez para um total de três lavagens. Após a terceira lavagem, descarte o fluido das câmaras superiores dos poços trans em um balde de resíduos usando um hemostático coloque três dos poços trans não infectados em três poços da placa de migração de 24 poços contendo um mililitro de Hanks Plus, que representa a pipeta de controle negativo 10 microlitros de uma solução de 10 micromolares de FMLP em cada um dos três poços da placa de migração de 24 poços contendo um mililitro de Hanks além disso, coloque três dos poços trans não infectados em três poços da placa de migração de 24 poços contendo 100 FMLP nanomolares, o que representa um controle positivo para a capacidade de migração de neutrófilos isolados.Em seguida, coloque os três poços trans infectados com PAO um e os três poços trans infectados com mc 1000 em três poços correspondentes da placa de migração de 24 poços contendo um mililitro de Hanks mais adicione 0,1 mililitro de Hanks mais à câmara superior de cada poço trans em cima do 0,1 mililitro Hanks mais em cada trans. Bem, adicione cuidadosamente 20 microlitros da suspensão de neutrófilos preparada conforme descrito no protocolo de texto. Incubar durante duas horas para permitir a migração transepitelial dos neutrófilos.Após duas horas de migração, levante os poços segurando com um hemostático e bata suavemente contra as paredes internas da placa de migração de 24 poços. Antes de descartar os poços trans, avalie a migração de neutrófilos grosseiramente nos poços visualizando os poços da placa de migração de 24 poços sob um microscópio invertido usando a objetiva de 10 x. Em seguida, adicione 50 microlitros de 10% Triton X 100 a cada poço usado na placa de migração de 24 poços, cada padrão e o blank.Gire os padrões de placa de migração de 24 poços e deixe em branco em baixa velocidade por 20 minutos. A quatro graus Celsius. Adicione 50 microlitros de tampão citrato.Dois cada poço usado na placa de migração de 24 poços para cada padrão e para o espaço em branco completamente. Misture bem o conteúdo de cada amostra, pipetando a solução para cima e para baixo pelo menos cinco vezes. Em seguida, transfira 100 microlitros de cada poço de amostra em duplicata para uma transferência de placa de 96 poços, 100 microlitros de cada padrão e o branco para a placa de 96 poços.Após a mistura, adicione 50 microlitros de peróxido de hidrogênio a 30% à solução A BTS e ao vórtice. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de substrato A BTS a cada amostra. Na placa de 96 poços, deixe a placa se desenvolver por cinco a 10 minutos no escuro.Observe o desenvolvimento da cor verde nos poços da placa contendo neutrófilos de lise antes de ler em um comprimento de onda de 405 nanômetros. Usando um leitor de microplacas para avaliar a migração transepitelial de neutrófilos Os neutrófilos que migraram totalmente através da camada epitelial para a câmara apical podem ser visualizados no poço inferior da placa de migração de 24 poços, conforme visualizado aqui usando um microscópio de luz invertida. Muito poucos neutrófilos foram observados migrando através de uma camada epitelial não infectada sem gradiente quimiotático imposto e representam níveis de fundo no ensaio.Em contraste, uma abundância de neutrófilos transmi foi aparente quando um gradiente FMLP foi fornecido. A infecção do epitélio com e coli mc 1000 não patogênica resultou em poucos neutrófilos transmigrados visíveis, enquanto muitos neutrófilos transmigrados foram observáveis quando as camadas epiteliais foram infectadas com o arógeno de pseudomonas patogênico pulmonar. Os neutrófilos que migraram no experimento são quantificados medindo sua atividade da mielo peroxidase.O número de neutrófilos se correlaciona positivamente com a quantidade de atividade da peroxidase medida após a lise de neutrófilos, com valores exibindo uma relação linear na faixa de números de neutrófilos selecionados para a curva padrão. Um número significativo de neutrófilos migra através das camadas epiteliais em resposta ao gradiente FMLP fornecido por A, ou em resposta a uma camada epitelial infectada com PAO um. O número de neutrófilos que migram na ausência de estímulos ou após infecção epitelial apical com e coli não patogênica mc 1000 está abaixo do limite de detecção para o ensaio.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco horas para revestimento de colágeno e semeadura das células epiteliais nos filtros transwell, seguida por pelo menos uma semana para permitir que as células epiteliais cresçam. Assim que as monocamadas epiteliais estiverem prontas. O ensaio de migração pode ser realizado em cinco horas, incluindo o isolamento de neutrófilos e a preparação de bactérias se for realizado adequadamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preparar os filtros transwell em condições estéreis para evitar contaminação. Esse procedimento pode ser adaptado para responder a perguntas adicionais relacionadas a esse processo inflamatório. A análise das células migradas, do epitélio, do supino ou mesmo do patógeno pode ser realizada.

in-vitro-coculture-assay-to-assess-pathogen-induced-neutrophil-trans

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este artigo primeiro descreve um procedimento para isolar células endoteliais humanas a partir de veias umbilicais e, em seguida, mostra como usar estas células para examinar transmigração de neutrófilos em condições de escoamento. Ao utilizar uma câmara de fluxo de baixo volume feita a partir de um polímero com as características ópticas do vidro, ao vivo de células imagem fluorescente de populações de células raras é também possível.

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

A aderência de neutrófilos ao endotélio activado em locais de infecção é um componente integral da resposta inflamatória do hospedeiro. Descritos neste relatório é um ensaio de ligação de neutrófilos, que permite...

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

Apresenta-se um ensaio de migração de células ex vivo que permite a quantificação precisa do potencial de migração de células de crista neural entérico na presença de vários factores de crescimento.

Um ensaio de migração celular quantitativo para murinos progenitores neurais entéricas

Realizando experimentos de cultura celular para investigar a adesão bacteriana e invasão em condições aeróbias é geralmente representativa...

Entérico invasão bacteriana de células epiteliais intestinais<em&gt; In Vitro</em&gt; É dramaticamente aumentada usando um Vertical Modelo câmara de difusão

Desenvolvemos um modelo in vitro que mimetiza um componente importante da resposta inflamatória aguda durante a infecção da bexiga por Escherichia coli uropatogênica.  O ensaio de migração transuroepitelial de neutrófilos permite a avaliação quantitativa da migração de neutrófilos humanos através do epitélio da bexiga, cultivada em suportes permeáveis, em resposta a infecções bacterianas ou substâncias quimioatraentes.

Avaliação quantitativa de neutrófilos humanos migração através de um Cultivadas bexiga Epitélio

Os leucócitos atravessam a monocamada endotelial utilizando o paracelular ou o percurso intracelular. Foi desenvolvido um ensaio simples para seguir a distribuição de juncional endógeno VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial de leucócitos sob fluxo fisiológico para discriminar entre as duas vias de transmigração.

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar o efeito dos peptídeos na migração das células epiteliais brônquicas. Este método permite a obtenção rápida e altamente reprodutível de dados quantitativos sobre a velocidade de fechamento de migração e ferida de célula.

Um romance em Vitro ferida cura ensaio para avaliar a migração celular

Função de barreira epitelial intestinal disregulada e respostas imunológicas são marcas de doença inflamatória intestinal que permanecem mal investigadas devido à falta de modelos fisiológicos. Aqui, descrevemos um modelo de alça intestinal de camundongos que emprega um segmento intestinal bem vascularizado e exteriorizado para estudar a permeabilidade mucosa e o recrutamento de leucócitos in vivo.

Avaliação Funcional da Permeabilidade Intestinal e Migração Transepitelial de Neutrófilo em Camundongos usando um Modelo de Laço Intestinal Padronizado

Escherichia coli causa sepse em neonatos que ingerem a bactéria na época do nascimento. O processo envolvido na capacidade da E. coli de viajar do trato entérico para a corrente sanguínea é pouco compreendido. Este modelo in vitro avalia a capacidade das cepas de E. coli de viajar através das células epiteliais intestinais.

Avaliação da Transcitose Intestinal de Isolados de Bacteremia de Escherichia coli Neonatal

Este protocolo fornece um método de isolamento primário de células T murinas e microscopia de lapso de tempo da migração de células T sob condições ambientais específicas com análise quantitativa.

Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias

O estudo apresenta um método para investigação in vitro de infecção bacteriana utilizando organoides intestinais derivados de células-tronco teciduais. O protocolo descreve como cultivar e diferenciar organoides em duas dimensões, infectá-los com Escherichia coli invasiva aderente e avaliar leituras-chave, incluindo ruptura da barreira epitelial, imagem de infecção e resposta de RNA epitelial.

Uma cultura organoide bidimensional em extrato de invasina ou membrana basal para estudar as interações hospedeiro-bactéria

Aprenda a avaliar a migração trans epitelial de neutrófilos induzida por patógenos usando um ensaio de cocultura in vitro com células epiteliais humanas e bactérias. Este método permite quantificar a resposta imune em infecções de mucosas.

In vitro Ensaio de cocultura para avaliar migração trans epitelial de neutrófilo induzida por patógenos

Explorar mais vídeos