In vitro Ensaio de cocultura para avaliar migração trans epitelial de neutrófilo induzida por patógenos

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar o número de neutrófilos que cruzaram uma monocamada de células epiteliais em resposta à infecção. Isso é obtido codificando transwells de colágeno antes de cultivar cuidadosamente monocamadas de células epiteliais usando a manobra de filtro transwell invertido. Como segunda etapa, o patógeno bacteriano é cultivado para infectar a superfície apical da monocamada epitelial cultivada nos filtros transwell, o que faz com que as células epiteliais produzam atrativos endógenos de quimio de neutrófilos.

Em seguida, neutrófilos isolados de sangue total são adicionados ao lado basolateral de monocamadas epiteliais infectadas cultivadas em filtros transwell para testar a migração de neutrófilos do lado basolateral para o apical. São obtidos resultados que mostram um aumento significativo no número de neutrófilos migratórios transepiteliais observados em resposta a monocamadas epiteliais infectadas com base na quantificação da mielo peroxidase de neutrófilos migrados. A demonstração visual desse método é crítica, pois a manobra do filtro transwell invertido para crescer e infectar barreiras epiteliais não é convencional e, portanto, pode ser menos acessível para grupos de pesquisa desconhecidos estabelecerem em seu laboratório.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia de doenças inflamatórias das vias aéreas envolvendo infecções como pneumonia ou fibrose cística, porque novos tratamentos podem ser desenvolvidos e testados para diminuir a quantidade de migração transepitelial de neutrófilos, o que pode mitigar os efeitos deletérios da violação de barreiras mucosas neutrofílicas excessivamente zelosas. Junto com Mark, que é um colega clínico em meu laboratório, demonstrando o procedimento estarão o técnico sênior Wahi Preza e o pós-doutorando Michael Pesos. Para começar remova a área de crescimento de 0.33 centímetro quadrado, Transwells com um tamanho de poro de três micrômetros da embalagem e coloque a placa de 24 poços contendo 12 transwells de cabeça para baixo dentro do capô.

Levante a placa inferior e reserve. Transwells agora estará de cabeça para baixo. Descansando em cima da tampa da chama da placa de 24 poços, um hemostático para esterilidade e deixe esfriar.

Usando os transwells de transferência de hemostáticos estéreis para uma placa de Petri de 150 por 25 milímetros, mantendo-os na posição invertida, pipetar 70 microlitros de uma solução preparada de colágeno de 30 microgramas por mililitro em etanol na membrana do filtro de cada superfície do transwell invertido A tensão deve manter esse volume de solução no lugar, pois não há paredes ao redor da membrana do filtro ao acessar a superfície da parte inferior. Tenha cuidado para que a solução de colágeno não escorra pela lateral do transwell e evite movê-los durante o procedimento de revestimento. Deixe a tampa da placa de Petri aberta por no mínimo quatro horas para permitir que o etanol evapore Para manter a esterilidade durante este processo.

Mantenha o exaustor e a luz ultravioleta acesos após embalar as células epiteliais conforme descrito no protocolo de texto. Adicione 70 microlitros da solução de células suspensas Resus de um tubo de 15 mililitros a cada transwell revestido de colágeno invertido. Misture a suspensão celular invertendo suavemente o tubo periodicamente para evitar que as células se assentem no fundo do tubo de 15 mililitros enquanto semeiam os transwells.

Uma vez que todos os transwells invertidos tenham sido semeados com células epiteliais, recoloque a tampa da placa de Petri e coloque cuidadosamente as células na incubadora de cultura de tecidos no dia seguinte. Adicione um mililitro de meio em cada poço da placa estéril original de 24 poços e use um hemostático esterilizado para virar cada poço trans invertido em cada poço contendo um mililitro de meio. Adicione 0,2 mililitros de meio na câmara superior de cada poço trans e retorne à incubadora de cultura de tecidos.

Remova da incubadora a placa de 24 poços que suporta as camadas epiteliais que foram cultivadas na parte inferior das membranas do filtro Transwell por pelo menos oito dias. Segure a borda de cada poço trans com um hemostático e retire-o da placa de 24 poços. Inverta o transwell sobre um balde de resíduos para descartar o meio de cultura da câmara interna do Transwell.

Mergulhe cada transwell em um copo de lavagem contendo a solução salina balanceada de Hank com cálcio e magnésio ou Hank's Plus para encher a câmara interna do Transwell. Em seguida, descarte o fluido da câmara interna em um balde de resíduos. Repita esta etapa por um segundo.

Lave no Hank's plus após duas lavagens. Coloque os Transwells em uma nova placa de 24 poços contendo um mililitro de Hank's Plus. Em cada poço, observe a câmara superior de cada poço para avaliar a integridade da camada de células epiteliais.

O Hank's Plus não deve vazar e encher a câmara superior do Transwell quando colocado no poço de uma placa de 24 poços contendo um mililitro de Hank's Plus. Depois de observar cuidadosamente cada transpoço, adicione 0,2 mililitros de Hanks Plus na câmara superior. Coloque a placa na incubadora por 30 a 60 minutos para equilibrar as camadas de células epiteliais para realizar o ensaio de migração transepitelial de neutrófilos.

Segure cada transwell com um hemostático da placa de 24 poços de Wash Transwells equilibrados em Hank's Plus e descarte o fluido no poço superior em um balde de resíduos. Coloque cada transwell de cabeça para baixo em uma placa de Petri de 150 por 25 milímetros para seis dos transwells invertidos. Adicione 25 microlitros de Hanks plus a três dos transpoços invertidos.

Infecte as células com 25 microlitros de Pseudomonas, arosa ou Pao diluídos em Hanks plus preparados conforme descrito no protocolo de texto para os três transwells invertidos finais infectam as células com 25 microlitros de e Coli, K 12 ou mc 1000 diluídos em Hanks Plus também preparados conforme descrito no protocolo de texto após incubação a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma câmara umidificada por 60 minutos. Lave os transwells segurando com um hemostático e virando-os de volta em uma placa de lavagem de 24 poços que contém um mililitro de Hank's plus. Nas câmaras inferiores.

Adicione 0,2 mililitros de Hank's plus às câmaras superiores. Segure o Transwell com um hemostático e remova-o da primeira placa de lavagem. Descarte o fluido da câmara superior em um balde de resíduos.

Antes de colocar os Transwells em uma segunda placa de lavagem de 24 poços contendo um mililitro de Hanks plus, adicione 0,2 mililitros de Hanks plus à câmara superior. Repita esta etapa mais uma vez para um total de três lavagens. Após a terceira lavagem, descarte o fluido das câmaras superiores dos poços trans em um balde de resíduos usando um hemostático coloque três dos poços trans não infectados em três poços da placa de migração de 24 poços contendo um mililitro de Hanks Plus, que representa a pipeta de controle negativo 10 microlitros de uma solução de 10 micromolares de FMLP em cada um dos três poços da placa de migração de 24 poços contendo um mililitro de Hanks além disso, coloque três dos poços trans não infectados em três poços da placa de migração de 24 poços contendo 100 FMLP nanomolares, o que representa um controle positivo para a capacidade de migração de neutrófilos isolados.

Em seguida, coloque os três poços trans infectados com PAO um e os três poços trans infectados com mc 1000 em três poços correspondentes da placa de migração de 24 poços contendo um mililitro de Hanks mais adicione 0,1 mililitro de Hanks mais à câmara superior de cada poço trans em cima do 0,1 mililitro Hanks mais em cada trans. Bem, adicione cuidadosamente 20 microlitros da suspensão de neutrófilos preparada conforme descrito no protocolo de texto. Incubar durante duas horas para permitir a migração transepitelial dos neutrófilos.

Após duas horas de migração, levante os poços segurando com um hemostático e bata suavemente contra as paredes internas da placa de migração de 24 poços. Antes de descartar os poços trans, avalie a migração de neutrófilos grosseiramente nos poços visualizando os poços da placa de migração de 24 poços sob um microscópio invertido usando a objetiva de 10 x. Em seguida, adicione 50 microlitros de 10% Triton X 100 a cada poço usado na placa de migração de 24 poços, cada padrão e o blank.

Gire os padrões de placa de migração de 24 poços e deixe em branco em baixa velocidade por 20 minutos. A quatro graus Celsius. Adicione 50 microlitros de tampão citrato.

Dois cada poço usado na placa de migração de 24 poços para cada padrão e para o espaço em branco completamente. Misture bem o conteúdo de cada amostra, pipetando a solução para cima e para baixo pelo menos cinco vezes. Em seguida, transfira 100 microlitros de cada poço de amostra em duplicata para uma transferência de placa de 96 poços, 100 microlitros de cada padrão e o branco para a placa de 96 poços.

Após a mistura, adicione 50 microlitros de peróxido de hidrogênio a 30% à solução A BTS e ao vórtice. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de substrato A BTS a cada amostra. Na placa de 96 poços, deixe a placa se desenvolver por cinco a 10 minutos no escuro.

Observe o desenvolvimento da cor verde nos poços da placa contendo neutrófilos de lise antes de ler em um comprimento de onda de 405 nanômetros. Usando um leitor de microplacas para avaliar a migração transepitelial de neutrófilos Os neutrófilos que migraram totalmente através da camada epitelial para a câmara apical podem ser visualizados no poço inferior da placa de migração de 24 poços, conforme visualizado aqui usando um microscópio de luz invertida. Muito poucos neutrófilos foram observados migrando através de uma camada epitelial não infectada sem gradiente quimiotático imposto e representam níveis de fundo no ensaio.

Em contraste, uma abundância de neutrófilos transmi foi aparente quando um gradiente FMLP foi fornecido. A infecção do epitélio com e coli mc 1000 não patogênica resultou em poucos neutrófilos transmigrados visíveis, enquanto muitos neutrófilos transmigrados foram observáveis quando as camadas epiteliais foram infectadas com o arógeno de pseudomonas patogênico pulmonar. Os neutrófilos que migraram no experimento são quantificados medindo sua atividade da mielo peroxidase.

O número de neutrófilos se correlaciona positivamente com a quantidade de atividade da peroxidase medida após a lise de neutrófilos, com valores exibindo uma relação linear na faixa de números de neutrófilos selecionados para a curva padrão. Um número significativo de neutrófilos migra através das camadas epiteliais em resposta ao gradiente FMLP fornecido por A, ou em resposta a uma camada epitelial infectada com PAO um. O número de neutrófilos que migram na ausência de estímulos ou após infecção epitelial apical com e coli não patogênica mc 1000 está abaixo do limite de detecção para o ensaio.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco horas para revestimento de colágeno e semeadura das células epiteliais nos filtros transwell, seguida por pelo menos uma semana para permitir que as células epiteliais cresçam. Assim que as monocamadas epiteliais estiverem prontas. O ensaio de migração pode ser realizado em cinco horas, incluindo o isolamento de neutrófilos e a preparação de bactérias se for realizado adequadamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preparar os filtros transwell em condições estéreis para evitar contaminação. Esse procedimento pode ser adaptado para responder a perguntas adicionais relacionadas a esse processo inflamatório. A análise das células migradas, do epitélio, do supino ou mesmo do patógeno pode ser realizada.