Name: Implantação de vidro Medular do Windows em camundongos adultos com Experimental Auto-imune Encephalomyelitis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda a implantar janelas de vidro na medula espinhal de camundongos adultos para estudar encefalomielite autoimune experimental. Este método permite imagem crônica in vivo usando microscopia de dois fótons.

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Agradecemos a C. Ricard, M-C. Amoureux, A. Jaouen e S. Meijia-Gervacio por discussões úteis; M. Hocine e C. Meunier, e a equipe das instalações de imagem animal e PicSIL do IBDML para suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa institucional do Centre National de la Recherche Scientifique e por doações da Association de Recherche sur la Sclérose en Plaque (ARSEP) (para G.R. e K.K.F), Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC), Fédération de Recherche sur le Cerveau (FRC) Institut de Recherche sur la Moelle Epinière (IRME) (para FD). K.K.F. foi apoiado por uma bolsa ARSEP. A imagem foi realizada no serviço de imagem PIcSIL do IBDML.

1. Preparação da Janela e da Estrutura de Suporte
<ol>
	<li>Preparação da janela - prepare várias janelas de vários tamanhos (largura = 1,8-2,2 mm; comprimento = 4,5-5,2 mm) para implantação.
	<ol>
		<li>Fazendo a broca modificada para cortar a lamínula - usando uma quantidade generosa de cimento dental, prenda uma broca a um eixo (no nosso caso, grampos Bulldog antigos). Certifique-se de que a rebarba esteja ~45° em relação ao eixo para facilitar o manuseio. 
		Nota: os escribas de diamante também funcionam bem para cortar vidro de cobertura.</li>
		<li>Fazendo slide-A - usando uma lâmina de microscópio padrão, cole um pequeno pedaço de papel de régua (~ 2 cm) na parte inferior da lâmina para que você possa ver a régua através do vidro. Em seguida, coloque um pedaço de fita adesiva ao longo da borda da marca de 0 mm da régua para atuar como um acessório para a lamínula na próxima etapa.</li>
		<li>Usando a broca modificada, a lâmina A e uma lâmina de microscópio não modificada (lâmina B), posicione um pedaço de vidro de cobertura (espessura nº 1.5) na marca de 0 mm na lâmina A. Use o slide-B para segurar a lamínula no lugar e como um gabarito para a linha de corte pretendida. Corte a lamínula em um retângulo longo de aproximadamente 5 x 22 mm. Gire o vidro cortado 90° e corte o retângulo em um retângulo menor de ~2 x 5 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Modificações de grampos - dois grampos modificados serão implantados para apoiar e fixar a câmara da janela às vértebras (consulte a seção 2.7-8).
	<ol>
		<li>Usando um grampo pequeno padrão (coroa = 8 mm; perna = 4 mm), dobre o meio da coroa ~90° para que as pontas das pernas fiquem quase se tocando.</li>
		<li>Dobre as pontas das pernas para fora ~45° na metade do caminho, de modo que a metade distal das pernas fique paralela.</li>
		<li>Dobre a metade distal das pernas ~ 30 ° para cima em relação ao plano do grampo. Coloque os grampos modificados no etanol antes da cirurgia para esterilização. 
		Nota: Os grampos também podem ser esterilizados com óxido de etileno ou autoclavados.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Modificações do clipe de papel - prepare um clipe de papel modificado para ser implantado como parte da câmara (consulte as seções 2.9-10) e para atuar como um clipe de retenção para cirurgia e imagem.
	<ol>
		<li>Usando um clipe de papel padrão de 25 mm, remova a pequena dobra deixando uma forma de U alongada.</li>
		<li>Usando um alicate ou chave de agulha, reduza o diâmetro da dobra para ~ 2 mm, mantendo as pontas paralelas.</li>
		<li>Dobre as pontas para fora ~90° a cerca de 8-10 mm da dobra. Faça os ajustes necessários para que fique plano.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Implantação de janela
Nota: Todos os procedimentos cirúrgicos e de cuidados com os animais foram conduzidos de acordo com a Diretiva do Conselho da Comunidade Europeia e foram aprovados pelo Comitê Nacional de Estudos Animais da França (autorização nº 13.300).
<ol>
	<li>Anestesiar o camundongo (Ket/Xyl; dose de indução: 120 mg/kg, 12 mg/kg; dose suplementar, 40 mg/kg, 4 mg/kg), aplicar pomada para os olhos nos olhos.</li>
	<li>Raspe as costas com aproximadamente ~ 2 cm de largura por ~ 5 cm de comprimento, centralizado na corcunda torácica, e limpe a pele exposta com sabão de iodo seguido de solução de iodo. Limpe as luvas pulverizando com etanol a 90%. </li>
	<li>Usando uma tesoura de tecido, corte a pele dorsal longitudinalmente sobre as vértebras T11 a L1 (~ 2 cm). Usando um bisturi, faça incisões longitudinais bilaterais entre os processos espinhoso e transverso de T11 a L1. Nota: Se luvas ou instrumentos tocarem o pelo ou a pele do animal, limpe novamente as luvas ou instrumentos usando um esterilizador a frio, como etanol a 90% ou Germ-X.</li>
	<li>Suspenda o mouse no garfo espinhal estereotáxico - Comece prendendo o garfo espinhal superior direito na posição. Segure T11 usando uma pinça Adson e posicione o processo transverso T11 sobre o garfo espinhal fixo. Enquanto segura a vértebra no lugar, prenda o garfo espinhal contralateral sob o processo transverso contralateral.</li>
	<li>Usando o mesmo procedimento da etapa 2.4, posicione L1 dentro do garfo espinhal.</li>
	<li>Usando um bisturi (nº 23), raspe suavemente os músculos entre os processos espinhosos e transversos de T11 a L1 para que as lâminas fiquem claramente visíveis. Para uma melhor visualização dos pedículos de T11, corte o tendão projetando-se rostralmente a partir da ponta do processo transverso.</li>
	<li>Enxágue os grampos modificados com PBS e insira as pontas dos grampos laterais aos pedículos vertebrais de T11 e L1 ajustando a distância entre as pontas para que toquem levemente os pedículos. 
	Nota: Use apenas PBS contendo dexametasona (0,1%), penicilina (1.000 U / ml) e estreptomicina (1 mg / ml), para reduzir a inflamação pós-cirúrgica e melhorar a clareza da janela.</li>
	<li>Cole os grampos no lugar com uma pequena gota de cianoacrilato em cada ponto de inserção e remova o mouse dos garfos espinhais.</li>
	<li>Aplique uma fina camada de cianoacrilato nas bordas cortadas da pele e nos músculos expostos ao redor das vértebras limpas, tomando cuidado para não colar as vértebras. Dobre as pontas do clipe de papel modificado de modo que elas entrem sob as seções salientes dos grampos implantados e fiquem paralelas ao longo eixo da coluna vertebral isolada e saiam nesta posição.</li>
	<li>Começando na interface pele-músculo, aplique várias camadas de cimento dentário para cobrir toda a abertura, exceto as vértebras expostas, certificando-se de implantar o clipe de papel com segurança dentro do cimento dentário.</li>
	<li>Uma vez curado o cimento dentário (5-15 min), prenda o mouse ao 'suporte do clipe' pela parte exposta do clipe implantado. Usando uma pinça, remova o músculo e outros tecidos moles entre os processos espinhosos e as lâminas das vértebras expostas. 
	Nota: Qualquer dispositivo que possa agarrar com segurança a parte exposta do clipe de papel sem causar estresse ao clipe/câmara e possa ser manobrado para reorientar o mouse durante a cirurgia pode ser usado como um 'suporte de clipe'.</li>
	<li>Usando a broca de remoção óssea, afine as lâminas de T12 e T13 bilateralmente. Para remover o osso dorsal, segure o processo espinhoso com uma pinça romba e levante-o, tomando cuidado para não aplicar força descendente em direção à medula espinhal. Se o osso não sair facilmente, continue a afinar as lâminas até que o processo espinhoso possa ser facilmente removido.</li>
	<li>Usando a broca de remoção óssea, continue a moldar as bordas laterais das vértebras para formar uma estrutura de suporte para a janela. Remova suavemente todos os pequenos fragmentos ósseos que tocam a dura-máter usando uma pinça romba. Certifique-se de manter a umidade da dura-máter usando PBS.</li>
	<li>Escolha uma das janelas preparadas que seja um pouco mais larga do que a abertura da laminectomia e teste o quão bem ela repousa sobre o osso exposto. Idealmente, a janela ficará apoiada bilateralmente em ambas as vértebras, de modo que o meio da janela toque a dura-máter (Figura 1a). A janela não deve, no entanto, comprimir a medula espinhal, mesmo ao empurrar a janela em direção à medula espinhal. Se a janela estiver desequilibrada ou estiver acima da dura-máter, repita a etapa 2.13.</li>
	<li>Quando estiver satisfeito com a laminectomia, coloque um pequeno pedaço de papel de seda autoclavado embebido em PBS na medula espinhal para evitar o ressecamento da dura-máter e deixe o camundongo de lado.</li>
	<li>Limpando a janela - coloque a janela em uma solução de limpador de janelas por alguns segundos. Usando um pedaço de lenço de papel para lentes de microscópio, seque a janela. Com o microscópio cirúrgico, verifique se a janela está limpa e, caso contrário, repita o processo de limpeza. Coloque a janela em uma área limpa com fácil acesso para rápida recuperação e colocação da janela na etapa 2.19.</li>
	<li>Recupere o mouse e remova o papel de seda. Remova cuidadosamente quaisquer detritos da dura-máter usando uma pinça romba e deixe-a secar até ficar ligeiramente pegajosa.</li>
	<li>Encha rapidamente o tubo misturador de silicone (Kwik-sil) e extrude o silicone em uma lâmina limpa até que não haja bolhas saindo da ponta. Administre imediatamente um pequeno cordão de silicone ao longo da linha média da medula espinhal exposta.</li>
	<li>Recupere as janelas limpas usando uma pinça romba e coloque imediatamente sobre o silicone. Usando a pinça romba, aplique uma pequena quantidade de pressão na janela para espalhar o silicone nas bordas da janela e segure no lugar por ~1 min. 
	Nota: Antes da mistura, o silicone deve ser armazenado abaixo de 27 °C, caso contrário, o tempo de cura pode aumentar significativamente e não aderirá à janela ou dura-máter, levando a uma clareza óptica reduzida.</li>
	<li>Libere lentamente a pressão da janela. Se a janela não se mover, prossiga imediatamente para a etapa 2.21. Se, no entanto, a janela subir quando a pressão for liberada (ou seja, as vértebras se movem), prossiga para a etapa 2.21 enquanto mantém a pressão na janela para mantê-la no lugar.</li>
	<li>Aplique cianoacrilato rostral e caudal da janela. Se o cianoacrilato não cobrir as bordas rostral e caudal da janela, use um palito para guiar um pouco do cianoacrilato líquido sobre essas bordas. Em seguida, guie a cola ao longo das bordas laterais da janela (Figura 1a) para cobrir todos os músculos circundantes. Nota: O cianoacrilato deve cobrir a superfície das bordas externas da janela. Muito cianoacrilato pode comprometer a clareza óptica, não há cianoacrilato suficiente resultando em bolhas de ar entre o silicone e a janela.</li>
	<li>Para proteger o cianoacrilato e aumentar a integridade estrutural da câmara, aplique cimento dentário em todas as regiões cobertas com cianoacrilato (Figura 1a). Tal como acontece com o cianoacrilato, comece nas bordas rostral e caudal e use um pequeno bastão de madeira para guiar o cimento dental ao longo das bordas da janela.</li>
</ol>
3. Cuidados pós-operatórios, indução EAE e manutenção de janelas
<ol>
	<li>Injete dexametasona (0,2 mg / kg) e Rimadyl (5 mg / kg) s.q. sobre as regiões pélvicas. Transfira o mouse para uma gaiola quente (~ 26 ° C) com material de nidificação. Os camundongos devem estar totalmente móveis, explorando sua gaiola e se limpando após os efeitos do anestésico terem diminuído totalmente (geralmente 2-3 horas). Animais domésticos individualmente e certifique-se de que eles tenham fácil acesso a comida e água durante os primeiros 1-2 dias. Assim que o camundongo começar a se recuperar do anestésico, injete buprenorfina (0,05 mg / kg) s.q. Após a recuperação total da anestesia, o camundongo não deve mostrar sinais de dor. Nota: Uma vez totalmente recuperado da anestesia, quaisquer sinais de dor ou atividade motora anormal indicam que a janela não foi implantada corretamente.</li>
	<li>Injete dexametasona (0,2 mg / kg) e Rimadyl (5 mg / kg) a cada 2 dias nos primeiros 10 dias após a cirurgia (Figura 1a). Para injetar janelas em camundongos, sedar levemente o animal com isoflurano em uma câmara de indução (~ 1,75% de isoflurano no ar por 1-2 min). Remova o mouse da câmara e injete imediatamente as drogas. O mouse deve estar totalmente acordado em <1 min. 
	Nota: Não desnude camundongos com janelas implantadas, pois isso pode causar a separação da pele do implante. É possível injetar camundongos i.p. sem sedação, permitindo que eles agarrem a tampa da gaiola com as patas dianteiras e levantem suavemente os membros posteriores. No entanto, nesta posição, o mouse às vezes se afasta, causando estresse na janela implantada. Isso pode levar a sangramento entre a janela e a medula espinhal, comprometendo assim a clareza óptica.</li>
	<li>A EAE pode ser induzida 2-3 semanas após a interrupção do tratamento anti-inflamatório (~ 3-4 semanas após a cirurgia). Sede levemente o mouse conforme descrito na etapa 3.2. Remova o mouse da câmara de indução e mantenha a sedação com uma máscara de isoflurano colocada sobre o nariz.</li>
	<li>Injete o peptídeo MOG35-55 (75 μg no adjuvante de Freund contendo 800 μg de mycobacterium tuberculosis) em 3 locais diferentes de s.q. (bilateralmente sobre o fêmur e na base da cauda) e toxina da coqueluche (400 ng) i.p.14,15 
	Nota: Camundongos com EAE requerem cuidados suplementares em comparação com camundongos apenas com janelas. Pese os ratos EAE todos os dias e certifique-se de que eles tenham fácil acesso a comida e água o tempo todo. Suplemento com uma geleia de agarose a 3% contendo para manter a hidratação e o peso do animal. A glicose (1-3%) também pode ser adicionada à geléia para obter calorias adicionais.</li>
	<li>Dois dias após a indução do EAE, repita o protocolo de sedação descrito na etapa 3.2 e injete uma segunda dose de toxina convulsa (400 ng) i.p.</li>
	<li>Para obter imagens da medula espinhal, primeiro sedar o animal conforme descrito na etapa 3.2 e anestesiar levemente com cetamina/xilazina (100 mg/kg; 10 mg/kg) i.p. Isso fornecerá ~ 1 hora de imagem.</li>
	<li>Para sessões de imagem com duração de <2 horas, a anestesia leve pode ser mantida com injeções suplementares de cetamina/xilazina (50 mg/kg; 5 mg/kg) a cada 45-60 min. Alternativamente, para sessões de imagem mais longas, os camundongos podem ser continuamente sedados com isoflurano (0,75-1,25% de isoflurano em ar umidificado). 
	Nota: as janelas podem ser limpas sob um microscópio cirúrgico limpando suavemente os detritos com o canto de um lenço de papel ou um cotonete. Não use álcool para limpar a janela, pois pode degradar alguns tipos de cimento dental e pode resfriar a medula espinhal.</li>
	<li>Uma vez levemente anestesiado, o mouse é preso firmemente a um suporte de clipe pela parte exposta do clipe implantado (Figura 1b).</li>
	<li>A medula espinhal é alinhada perpendicularmente à lente objetiva ajustando o posicionamento do clipe dentro do suporte, ajustando a posição do suporte e ajustando a posição da platina. A superfície dorsal da medula espinhal é rapidamente visualizada e a vasculatura dorsal é usada para determinar a orientação da medula espinhal.</li>
</ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Descrevemos um método para implantar e manter janelas de vidro sobre a medula espinhal exposta de camundongos adultos para estudar a progressão dinâmica da EAE ao longo do tempo. Uma abordagem semelhante de implantação de janela de vidro tem sido usada para estudar modelos de lesão medular13 e também pode ser útil para estudar outras patologias da medula espinhal, como glioblastomas, meningite ou a fisiologia celular da medula espinhal normal. Para o nosso método, a estabilização vertebral foi alcançada constr...

A esclerose múltipla é uma doença autoimune do SNC que causa danos progressivos à mielina e ao axônio. O modelo de pesquisa padrão para doenças desmielinizantes autoimunes do SNC é EAE em roedores adultos. No entanto, os eventos celulares dinâmicos subjacentes à progressão da EAE permanecem amplamente inexplorados. Uma abordagem é usar microscopia intravital de dois fótons para visualizar populações celulares com marcadores fluorescentes por longos períodos de tempo na medula espinhal de camundongos adultos com EAE.
A microscopia intravital de dois fótons é uma maneira poderosa de estudar a fisiologia celular, as interações celulares e a progressão dinâmica da doença em animais vivos com resolução subcelular1. No entanto, um grande obstáculo para a abordagem é que ela requer acesso óptico à região de interesse. Por exemplo, as janelas de vidro craniano são uma metodologia bem estabelecida para imagens repetidas das mesmas microestruturas no cérebro durante várias semanas2,3. A adaptação dessa metodologia à imagem da medula espinhal não é, no entanto, simples e requer várias modificações técnicas para imobilizar o tecido espinhal dorsal dentro das vértebras articuladas.
Anteriormente, o acesso óptico à medula espinhal exigia a reexposição cirúrgica da medula espinhal no início de cada sessão de imagem e a sutura da pele fechada ao final de cada sessão4-12. Essas cirurgias repetidas são traumáticas para o animal, limitam o número e a duração das sessões de imagem e aumentam a probabilidade de artefatos relacionados à cirurgia, como inflamação e danos à medula espinhal por meio de perturbação mecânica. Para superar essas deficiências, desenvolvemos recentemente um protocolo para implantar janelas de vidro sobre a medula espinhal exposta de camundongos transgênicos fluorescentes adultos com lesões traumáticas da medula espinhal para experimentos de microscopia de dois fótons in vivo de longo prazo sem cirurgias repetidas13. Aqui apresentamos uma adaptação detalhada do protocolo de implantação no contexto de sua aplicação para estudar os eventos celulares dinâmicos subjacentes à progressão da EAE em camundongos adultos.

<table><tbody><tr><td>Broca de remoção</td> óssea <td>World Precision Instruments</td><td>IDEAL MICRO-DRILL</td><td>Também vendida pela Harvard Apparatus. Qualquer broca cirúrgica de alta qualidade será suficiente.</td></tr><tr><td>Broca (#1/4 ou 1/2 Fresa Redonda de Carboneto)</td> <td>World Precision Instruments</td><td>501860 (#1/4) 501860 (#1/2)</td> <td>Também vendido pela Harvard Apparatus</td></tr><tr><td>Staples</td><td>Lyreco</td><td>5.002.567</td><td>Coroa = 8 mm Perna = 4 mm</td></tr><tr><td>Clipe</td><td></td><td></td><td>de papel Qualquer clipe de papel padrão de 25 mm</td></tr><tr><td>Chaves de agulha</td> Tesoura de <td></td> tecido <td></td> Fine Science Tools 12003-15 <td></td></tr><tr><td></td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Adson</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11027-12</td><td>1 x 2 dentes</td></tr><tr><td>Pinças sem corte</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11293-00</td><td></td></tr><tr><td>Garfos espinhais</td><td>Aparelho de Harvard</td><td>724813</td><td></td></tr><tr><td>Cimento dental</td><td>GACD</td><td>12-565 e 12-568</td><td></td></tr><tr><td>Elastômero de silicone</td><td>Instrumentos</td> <td>de precisão mundialKWIK-SIL</td><td>Também disponível através do microscópio Coherent Scientific e Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate</td><td>Eleco-EFD</td><td>Cyanolit 201</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>7MP</td><td>Nosso microscópio está em uma configuração vertical e está equipado com 5 detectores NDD.</td></tr><tr><td>Lente objetiva</td><td>Zeiss</td><td>W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC M27 75mm</td><td>Distância de trabalho = 1.8 mm</td></tr></tbody></table>

implantação de vidro medular do windows em camundongos adultos com experimental auto-imune encephalomyelitis

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) em roedores adultos é o modelo experimental padrão para estudar doenças desmielinizantes autonômicas, como a esclerose múltipla. Aqui apresentamos um protocolo de implantação de janela de vidro reprodutível e de baixo custo que é adequado para microscopia intravital e estudando a dinâmica da citoarquitetura da medula espinhal com resolução subcelular em camundongos adultos vivos com EAE. Resumidamente, expomos cirurgicamente as vértebras T12-L2 e construímos uma câmara ao redor das vértebras expostas usando uma combinação de cianoacrilato e cimento dentário. Uma laminectomia é realizada de T13 a L1, e uma fina camada de elastômero de silicone transparente é aplicada na superfície dorsal da medula espinhal exposta. Uma lamínula de vidro modificada é implantada sobre a medula espinhal exposta, tomando cuidado para que o vidro não entre em contato direto com a medula espinhal. Para reduzir a infiltração de células inflamatórias entre a janela e a medula espinhal, o tratamento anti-inflamatório é administrado a cada 2 dias (conforme recomendado pelo comitê de ética) nos primeiros 10 dias após o implante. A EAE é induzida apenas 2-3 semanas após a interrupção do tratamento anti-inflamatório.
Usando essa abordagem, induzimos com sucesso EAE em 87% dos animais com janelas implantadas e, usando camundongos Thy1-CFP-23 (axônios azuis na medula espinhal dorsal), quantificamos a perda axonal ao longo da progressão do EAE. Em conjunto, este protocolo pode ser útil para estudar o recrutamento de várias populações de células, bem como sua dinâmica de interação, com resolução subcelular e por longos períodos de tempo. Essa modalidade de imagem intravital representa uma ferramenta valiosa para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para o tratamento de doenças desmielinizantes autoimunes, como a EAE.

O uso de janelas de vidro implantadas cronicamente em combinação com microscopia intravital de dois fótons e modelos de EAE pode ser uma ferramenta útil para compreender os mecanismos celulares subjacentes à patologia das doenças autoimunes desmielinizantes. Utilizando nosso método de implantação, observamos que a maioria das janelas estava transparente no momento da indução da EAE e permaneceu clara durante toda a progressão da doença (Figura 1c). Com esta abordagem, verificamos que as janelas permanece...

Descrevemos um método para implantar e manter janelas de vidro sobre a medula espinhal exposta de camundongos adultos para estudar a encefalomielite autoimune experimental. Essas janelas fornecem acesso óptico crônico à medula espinhal para monitorar a dinâmica celular no nível subcelular em animais vivos usando microscopia de dois fótons.

Implantação de vidro Medular do Windows em camundongos adultos com Experimental Auto-imune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

O objetivo geral deste procedimento é criar uma visão de janela da medula espinhal e camundongos adultos para estudar a encefalomielite autoimune experimental por microscopia intravital longitudinal de dois fótons. Isso é feito primeiro implantando uma braçadeira espinhal para apoiar as vértebras para cirurgia e imagem. Os próximos passos são expor a medula espinhal e preparar as bordas laterais das vértebras para apoiar a janela de vidro.Isso é seguido pela implantação da janela com uma fina camada de elastômero de silicone entre a janela e a dura-máter. A etapa final várias semanas após a implantação é induzir EAE nos camundongos implantados. Em última análise, os resultados podem mostrar as mudanças espaço-temporais nas distribuições celulares e interações celulares na medula espinhal de camundongos EAE usando microscopia de dois fótons.A demonstração visual desse método é crítica. O método pode ser difícil de aprender porque é sensível ao tempo e requer um alto grau de precisão. Comece anestesiando o camundongo adulto por cirurgia e aplicando pomada para os olhos.Seu dorso com aproximadamente dois centímetros de largura por cinco centímetros de comprimento, centrava-se na giba

implanting-glass-spinal-cord-windows-adult-mice-with-experimental

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O vídeo demonstra a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo injetando uma combinação de glicoproteínas de oligodendrócitos de mielina e Mycobacterium tuberculosis inativado. O modelo permite que os pesquisadores estudem os mecanismos da doença e testem intervenções terapêuticas.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Este vídeo demonstra a gravação da atividade neural do cérebro através de uma janela óptica em camundongos transgênicos. Os camundongos expressam uma proteína fluorescente que permite a detecção de atividades neurais. Uma pequena parte do crânio é cuidadosamente removida para instalar uma janela óptica, e o crânio é então coberto com cimento preto para bloquear a luz antes da imagem.

Instalação de janelas ópticas no cérebro de camundongos transgênicos para imagens de atividades neurais

Este vídeo demonstra o método de indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) injetando peptídeos derivados de mielina com um adjuvante para ativar células T autorreativas, que migram para o cérebro. A toxina da coqueluche é administrada para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que essas células T e outras células imunológicas entrem no cérebro. Essas células imunes causam desmielinização, levando ao comprometimento da transmissão nervosa e ao...

Geração de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Neste vídeo, um modelo de camundongo com esclerose múltipla é estabelecido usando encefalomielite autoimune experimental (EAE). O camundongo é injetado com uma emulsão contendo um peptídeo neuronal e um adjuvante, desencadeando uma resposta imune que ativa as células T autorreativas. Isso é seguido por uma injeção de toxina coqueluche (PTX) para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que as células T autorreativas se infiltrem no cérebro. Essa infiltração inicia uma...

Fonte: Pietruczyk, E. A., et al. Laminectomia e implantação de janela da medula espinhal no camundongo. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a implantação de uma janela da medula espinhal em um camundongo anestesiado para imagens in vivo. O protocolo estabiliza a medula espinhal exposta usando uma lamínula de borossilicato e uma placa traseira impressa em 3D. Este método permite a microscopia de dois fótons de alta resolução para estudar a dinâmica da barreira hematoencefálica e as...

Implantação de janela da medula espinhal em um camundongo para imagens in vivo

O transplante de células-tronco / progenitoras neurais (NPCs) detém grandes promessas em neurologia regenerativa. A administração sistêmica de NPCs se transformou em baixo invasivo e muito eficaz terapeuticamente protocolo eficaz, para entregar as células-tronco no cérebro e na medula espinhal de roedores e primatas não-humanos que sofreram prejuízos inflamatória crônica experimental do sistema nervoso central.

Injeção sistêmica de células-tronco neurais / progenitoras em ratos com EAE crónica

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para a implantação de uma câmara de imagem óptica crônica sobre a medula espinhal dorsal de um rato vivo. A câmara, procedimento cirúrgico, e imagiologia crônica são revisados ​​e demonstrada.

Um Processo de Implantação de uma Câmara Spinal para Longitudinal In Vivo Criação de Imagens do Cordão do rato Spinal

Este manuscrito descreve os métodos de indução e pontuação do modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE), juntamente com a avaliação da distribuição de células imunes e níveis de citocinas de mRNA em linfonodos, baço, sangue e medula espinhal usando citometria de fluxo e PCR quantitativo, respectivamente, em várias fases da doença.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Este protocolo descreve a implantação de uma janela de vidro na medula espinal de um rato para facilitar o visualização pela microscopia intravital.

Implante de janela de laminectomia e medula espinhal no mouse

Aqui, apresentamos os protocolos para investigar o comprometimento da unidade neurovascular durante encefalomielite auto-imune experimental in vivo. Abordamos especificamente como determinar a permeabilidade da barreira hemato - encefálica e gelatinase atividade envolvida na migração de leucócitos através da limitans da glia.

Visualizando o comprometimento das barreiras endoteliais e Glial da unidade Neurovascular durante encefalomielite auto-imune Experimental In Vivo

Até o momento, os protocolos para o isolamento simultâneo de todos os principais tipos celulares residentes no sistema nervoso central do mesmo camundongo são uma demanda não atendida. O protocolo mostra um procedimento aplicável em camundongos ingênuos e experimentais com encefalomielite autoimune para investigar redes celulares complexas durante a neuroinflamação e, simultaneamente, reduzir o número necessário de camundongos.

Isolamento Simultâneo dos Principais Tipos Celulares Residentes no Sistema Nervoso Central de Camundongos Adultos com Encefalomielite Autoimune

Aprenda a implantar janelas de vidro na medula espinhal de camundongos adultos para estudar encefalomielite autoimune experimental. Este método permite imagem crônica in vivo usando microscopia de dois fótons.

Implantação de vidro Medular do Windows em camundongos adultos com Experimental Auto-imune Encephalomyelitis

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