Produção e Purificação de Adenovírus não replicativa Canino Tipo 2 vectores derivados

Nos últimos 15 anos, os vetores derivados do adenovírus canino tipo 2 (CAV2) provaram sua eficiência na transdução de células in vitro e in vivo e são amplamente utilizados para vacinação e terapia gênica. Aqui, descrevemos um procedimento para construir, produzir e purificar vetores CAV2, dando origem a suspensões virais de alto título.

O objetivo geral deste procedimento é construir, produzir e purificar vetores derivados de adenovírus caninos tipo dois. Isso é feito primeiro clonando o gene de interesse em um plasmídeo de transporte. O segundo passo é obter um plasmídeo genômico recombinante por recombinação homóloga.

Em seguida, o bezerro defeituoso recombinante, dois vírus produzidos e amplificados em uma linhagem celular trans complementar. A etapa final é purificar e concentrar o vírus recombinante resultante para diversas aplicações in vivo e in vitro. Em última análise, a microscopia confocal de imunofluorescência é usada para mostrar exemplos de transdução viral no cérebro de roedores.

A principal vantagem dessas técnicas sobre os métodos existentes, como vetores derivados da neurose humana e neurose, é que não há imunidade preexistente contra o bezerro dois em populações humanas. Portanto, esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos da vacinação ou terapia genética, como avaliar o papel das proteínas expressas em áreas específicas do cérebro. Portanto, demonstrando este procedimento estarão May KY e Corin Bergeron.

Dois pesquisadores de pós-doutorado de nossos laboratórios Prepare-se para este procedimento um dia antes da transfecção, semeando células DKE um em uma placa de seis poços cultivando células a 37 graus Celsius e 5% de CO2 em DMEM com glicose alta contendo 7% de calor, bezerro fetal inativado, sódio sérico, piruvato, penicilina e estreptomicina. No dia seguinte, as células devem ser 70 a 80% confluentes para transfecção digerir dois microgramas de pcal GOI o plasmídeo genômico cav dois recombinante com ASC um para liberar a sequência não viral do plasmídeo, verificar o padrão de restrição resultante em 0,8% A digestão por eletroforese em gel Agro deve produzir um fragmento de par de aproximadamente 31 quilobases contendo o genoma recombinante e um fragmento de dois pares de quilobases correspondente à estrutura do plasmídeo. Misture o DNA digerido com 200 microlitros de tampão jet prime e vórtice por 10 segundos.

Adicione quatro microlitros de jet prime e misture por vórtice por 10 segundos. Gire brevemente para remover as gotículas e incube por 10 minutos. À temperatura ambiente, adicione a mistura de transfecção gota a gota nas células DKE one.

Agite suavemente a placa para distribuir uniformemente a mistura e incube a 37 graus Celsius. Uma semana após a transfecção, coletar células e meio de cultura em tubo de polipropileno de 15 mililitros. Interrompa as células por três ciclos de pensamento congelados.

Limpe o lisado por centrifugação por 10 minutos a 1.800 vezes G. Colete o sobrenadante e armazene a menos 20 para propagação subsequente do vírus para propagar o vírus infectar uma monocamada confluente de 80 a 90% de células DKE uma cultivadas em um poço de uma placa de seis poços com 0,5 mililitros do vírus contendo sobrenadante. Incubar a 37 graus Celsius durante uma hora sob agitação ligeira Após uma hora. Remova o inóculo e substitua-o por 1,5 mililitros de DMEM completo contendo células incubadas FCS inativadas por 5% a 37 graus Celsius por três a quatro dias.

As células devem ser monitoradas diariamente quanto ao aparecimento de um efeito citopático ou CPE. Se nenhum CPE claro estiver visível. Colha as células após quatro dias de cultivo e repita a amplificação viral quando um CPE claro afetar a maioria das células.

Normalmente, após duas a quatro rodadas de amplificação viral, colete células com meio de cultura e congele e descongele três vezes, conforme demonstrado anteriormente. Infecta 80 a 90% confluente. DKE one células cultivadas em três placas de cultura de tecidos de 10 centímetros de diâmetro usando 1,5 mililitros de vírus contendo sobrenadante por placa após três a quatro dias, quando o CPE estiver completo.

Colha as células desses pratos de 10 centímetros de diâmetro, interrompa-os por três ciclos de estilo livre e limpe o lisado por centrifugação por 10 minutos a 1.800 vezes. G coletar sobrenadante e armazenar a menos 20 para amplificação de Cav dois em grande escala para iniciar o procedimento de aumento de escala infectar 80 a 90% de monocamadas confluentes de células DKE um cultivadas em 40 placas de cultura de tecidos de 10 centímetros de diâmetro para cada placa usar 0,1 mililitros de vírus contendo sobrenadante diluído em um mililitro de DMEM completo sem FCS incubar células a 37 graus Celsius por três a quatro horas sob agitação leve. Após três a quatro horas, adicione cinco mililitros de DMEM completo suplementado com 5%FCS e incube por três dias.

Após três dias, colha as células infectadas dos 40 pratos de 10 centímetros em tubos de polipropileno de 50 mililitros, células pellet a 1.200 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Resus suspendê-los em 15 mililitros de meio DMEM perturbar as células por três ciclos de congelamento e descongelamento. Remover os restos celulares centrifugando a 1.800 vezes G durante 10 minutos.

Armazenar o sobrenadante a menos 20 antes da purificação das partículas virais para purificação das partículas virais. Preparar um gradiente descontínuo de cloreto de césio num tubo UltraClear de 14 mililitros. Primeiro, despeje dois mililitros da solução de cloreto de césio de alta densidade no fundo do tubo.

Em seguida, adicione lentamente dois mililitros da solução de cloreto de césio de baixa densidade em cima da primeira solução. Carregue cuidadosamente o sobrenadante viral no topo do gradiente de cloreto de césio. Encha o tubo com óleo mineral até dois a três milímetros da centrífuga superior em um rotor SW 40 oscilante por uma hora e 30 minutos a 130.000 vezes g e 18 graus Celsius após a centrifugação.

Duas faixas brancas são claramente visíveis na interface entre as duas camadas de solução de cloreto de césio. Usando uma agulha de calibre 21 e uma seringa, colete por punção lateral a faixa inferior contendo duas partículas maduras. Tente ao máximo evitar coletar a banda superior que corresponde a partículas virais vazias.

Preparar um gradiente contínuo de cloreto de césio num tubo transparente de 14 mililitros, misturando as partículas virais colectivas com uma solução de cloreto de césio. Encha o tubo com óleo mineral até dois a três milímetros da centrífuga superior em um rotor SW 40 oscilante por 18 horas a 130.000 vezes G e 18 graus. Após centrifugação, recolha o bezerro branco dois contendo a punção lateral com uma seringa, conforme demonstrado anteriormente.

Novamente, tente evitar coletar a banda superior restante. Isso deve ser mais fácil neste gradiente contínuo que separa melhor as duas bandas. O volume total da suspensão recolhida não deve exceder dois mililitros.

Em seguida, equilibre uma coluna cidex G 25 PD 10 com 30 mililitros de PBS. Carregue a suspensão viral na coluna e descarte o fluxo através da elução com frações de 500 microlitros de PBS coletando frações cinco a sete, que geralmente contêm as duas partículas dessalinizadas. O vírus contendo frações pode ser facilmente identificado porque há cheiro abençoado.

Finalmente, adicione 150 microlitros de glicerol aos 1,5 mililitros de suspensão CAV dois e armazene em Eloqua a 80 graus Celsius negativos para titular cav dois por diluição final, descongele uma alíquota de vírus purificado no gelo e execute uma diluição serial de dez vezes variando de 10 a menos dois a 10 a menos 12 no DMEM livre sérico. Adicione 50 microlitros de cada diluição viral em cinco poços de uma placa de 96 poços, adicione 1,5 vezes 10 ao quarto DKE, uma célula a cada poço, incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por cinco dias no quinto dia. Aparência do CPE do monitor pós-infecção por observação microscópica.

Os títulos infecciosos são determinados como doses infecciosas medianas de cultura de tecidos usando o método estatístico read e men antes da produção de vetores virais. Um genoma CAV dois recombinante com um de expressão para o transgene é construído usando técnicas padrão de biologia molecular. Primeiro, o gene de interesse é clonado em um plasmídeo de transporte como um de expressão com um promotor inicial de citomegalovírus e um sinal de poliadenilação flanqueado por duas sequências genômicas derivadas de CAV que representam as sequências-alvo de recombinação a montante e a jusante.

Em uma segunda etapa, o de expressão é inserido do plasmídeo do ônibus espacial no genoma CAV dois por recombinação homóloga. A inserção do de expressão GOI levará à deleção do EA e parte do gene E one B no genoma recombinante. Uma vez obtido o plasmídeo genômico recombinante, as partículas virais são produzidas usando CAV dois E um complementando as células DKE um.

Um claro efeito citopático devido à grande quantidade de partículas virais produzidas nas células infectadas pode ser facilmente visualizado por microscopia de campo claro ou por expressão transgênica. Este exemplo é de um GFP expressando CAV dois vetores. Após várias rodadas de amplificação viral usando células DKE um frescas, as partículas virais são purificadas por ultracentrifugação em gradientes de cloreto de césio.

As partículas virais concentradas aparecem como duas bandas opalescentes dentro do gradiente de césio. A banda inferior corresponde ao cav dois recombinante maduro que deve ser coletado. Enquanto a banda superior contém partículas não infecciosas vazias que devem ser evitadas.

O vetor recombinante resultante do bezerro dois pode ser usado para transduzir quase todos os tipos de células em uma ampla variedade de espécies, in vitro ou in vivo. Aqui é mostrado um exemplo de aplicação em que o GFP expressando CAV dois foi injetado por táxi estéreo em diferentes áreas do sistema nervoso central do camundongo. Uma vez que este protocolo produz alto título e injeção de estoques virais puros e puros de apenas um microlitro de PBS diluído GFP expressando CAV dois vetores no giro dentado ou DG leva a 40 a 50% de transdução neuronal.

Além disso, devido à capacidade de C dois de ser transportado retrógrado em axônios, injeção de dois microlitros de PBS diluído GFP expressando CAV dois vetor no estriado permite a transdução de quase 80% dos neurônios nigro stri AAL nos subs, nigra pars compacta Após seus desenvolvimentos. Essas técnicas abrem caminho para pesquisadores nas áreas de vacinologia ou neurociências explorarem novos antígenos e funções gênicas no cérebro em diversos modelos animais. Portanto, não se esqueça de que trabalhar com dois vetores derivados do CAF pode ser extremamente perigoso e cauteloso, como medidas adequadas de contenção e manuseio de resíduos, incluindo equipamentos de proteção individual e trabalho em capelas de fluxo laminar em dois laboratórios BSL devem sempre ser tomados durante a realização deste procedimento.