Name: Produção e Purificação de Adenovírus não replicativa Canino Tipo 2 vectores derivados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-03T13:50:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Aprenda a produzir e purificar vetores derivados do adenovírus canino tipo 2 (CAV2) para terapia gênica e vacinação. Este método permite obter suspensões virais de alto título para aplicações in vitro e in vivo.

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Este trabalho foi apoiado financeiramente por doações do INSERM, do CNRS, da Fondation pour la Recherche Médicale e da Agence Nationale pour la Recherche (ANR-10-Blanc-1322) para D.G-D; o Sétimo Programa-Quadro da Comissão Europeia para B.K.; M.S. foi apoiado por uma bolsa de pós-doutoramento da FRM (programa "Equipe FRM 2009"); C.B. foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da UE, sob o acordo de bolsa número 245266 (Orbivac).

1. Construção de um plasmídeo do genoma CAV2 não replicativo
Nota: todos os plasmídeos descritos neste protocolo foram descritos anteriormente7 e estão disponíveis mediante solicitação.
<ol>
	<li>Clonar o GOI no plasmídeo pShuttle, utilizando enzimas de restrição adequadas, para gerar o pShuttle-GOI (figura 1A).</li>
	<li>Digerir 2 μg de pShuttle-GOI por AscI/PacI. A digestão libera o fragmento Shuttle-GOI (~ 2,9 kbp + sequência GOI ORF) da estrutura do plasmídeo (2,8 kbp).</li>
	<li>Purifique o fragmento Shuttle-GOI após eletroforese em gel de agarose, usando o NucleoSpin Gel e o kit PCR Clean-up.</li>
	<li>Paralelamente, digerir 1 μg de plasmídeo genômico pCAV2 por SwaI. O plasmídeo pCAV2 contém um sítio SwaI único localizado na região E1 ( Figura 1B ). Inativar esta enzima de restrição a 65 °C durante 20 min.</li>
	<li>Transformar bactérias competentes de E. coli BJ5183 com 500 ng de fragmento Shuttle-GOI purificado e 100 ng de plasmídeo pCAV2 linearizado para recombinação homóloga (Figure 1B). Espalhe em placas LB-Amp. Incubar as placas a 37 °C durante pelo menos 20 horas.</li>
	<li>Realize a análise de PCR diretamente em colônias bacterianas usando a mistura principal EmeraldAmp com primers direto (5'-CACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA-3') e reverso (5'-GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGC-3'), sob as seguintes condições de ciclagem: 10 min a 95 °C (para um ciclo), 95 °C por 1 min; 58 °C por 1 min; 72 °C por 1 min/kbp (por 39 ciclos), e finalmente 5 min a 72 °C. Um produto de 1 kbp + GOI ORF sequence é amplificado a partir de clones positivos para pCAV-GOI, enquanto nenhum produto de PCR pode ser detectado com clones negativos.</li>
	<li>Inocular pelo menos duas colónias positivas durante a noite, cada uma em 5 ml de meio LB-amp a 37 °C num agitador (220 rpm).</li>
	<li>Extraia DNAs de plasmídeo usando o kit de plasmídeo Nucleospin. Transforme bactérias E. coli DH5α competentes com uma alíquota de cada preparação de DNA. Espalhe a suspensão bacteriana em placas LB-Amp e incube durante a noite a 37 °C.</li>
	<li>Inocular duas colónias de cada clone positivo durante a noite num agitador (220 rpm) de 3 ml de LB-amp a 37 °C. Extraia o DNA do plasmídeo usando o kit de plasmídeo Nucleospin.</li>
	<li>Digerir o ADN resultante e o plasmídeo parental pCAV2 (como controlo) com NdeI. O padrão de restrição do pCAV2 parental é de 14,8 kbp, 9 kbp, 7,9 kbp e 1,6 kbp. A de expressão GOI é inserida no fragmento de 7,9 kbp e contém pelo menos um sítio NdeI, ou seja, um sítio na e os sítios potenciais presentes no GOI.</li>
	<li>Selecione construções positivas e prossiga para a etapa 2 com pelo menos 2 clones independentes.</li>
</ol>
2. Transfecção de plasmídeo do genoma CAV2 recombinante em células DK-E1
Nota: Os vetores não replicativos derivados de CAV2 são organismos geneticamente modificados classificados como Nível de Biossegurança 2 (BSL-2), enquanto seu uso em modelos animais é classificado como BSL-1. Use medidas adequadas de contenção e manuseio de resíduos, incluindo equipamentos de proteção individual, e trabalhe sob as coifas de fluxo laminar BSL-2.
<ol>
	<li>Um dia antes da transfecção, semeie as células DK-E1 em uma placa de 6 poços. Cultive células a 37 ° C e 5% de CO2, em meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com alta glicose, contendo 7% de soro fetal de bezerro inativado por calor (FCS), 1 mM de piruvato de sódio e 100 U / ml de penicilina / 100 μg / ml de estreptomicina. As células devem ser 70-80% confluentes para transfecção.</li>
	<li>Digerir 2 μg de plasmídeo pCAV-GOI com AscI, para libertar a sequência não viral do plasmídeo. Verifique o padrão de restrição resultante por eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A digestão deve produzir um fragmento de ~ 31 kbp contendo o genoma recombinante e um fragmento de 2 kbp correspondente à estrutura do plasmídeo.</li>
	<li>Misture o DNA digerido com 200 μl de Jet Prime Buffer por vórtice por 10 segundos. Adicione 4 μl de Jet Prime e misture por vórtice por 10 segundos. Gire brevemente para remover as gotículas e incube por 10 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione a mistura de transfecção gota a gota nas células. Agite suavemente as placas para distribuir uniformemente a mistura e incube a 37 °C.</li>
</ol>
3. Propagação de CAV2 Recombinante
<ol>
	<li>Uma semana após a transfecção, coletar células e meio de cultura em um tubo de polipropileno de 15 ml. Romper as células por três ciclos de congelamento e descongelamento (-80 °C/37 °C) e limpar o lisado por centrifugação por 10 min a 1.800 x g.</li>
	<li>Colete o sobrenadante e armazene a -20 °C para posterior propagação do vírus.</li>
	<li>Infecte uma monocamada confluente de 80-90% de células DK-E1 cultivadas em um poço de placa de 6 poços com 0,5 ml do sobrenadante contendo vírus. Incubar a 37 °C durante 1 hora, sob agitação ligeira. Remover o inóculo e substituí-lo por 1,5 ml de DMEM completo contendo 5% de FCS inativado pelo calor.</li>
	<li>Incubar as células a 37 °C durante 3-4 dias. As células devem ser monitoradas diariamente quanto ao aparecimento de um efeito citopático (CPE, Figuras 2A-B). Se nenhum CPE claro for visível, colha as células após 4 dias de cultura e repita as etapas 3.1-3.4.</li>
	<li>Quando um CPE claro afeta a maioria das células, geralmente após 2-4 rodadas de amplificação viral, colete células com meio de cultura e congele e descongele 3x conforme descrito acima. Infectar 80-90% de células DK-E1 confluentes cultivadas em três placas de cultura de tecidos de 10 cm de diâmetro, usando cada vez 0,5 ml de sobrenadante contendo vírus.</li>
	<li>Após 3-4 dias (quando o CPE estiver completo), colha as células desses pratos de 10 cm, interrompa-os novamente por três ciclos de congelamento e descongelamento, limpe o lisado por centrifugação por 10 min a 1.800 x g, colete o sobrenadante e armazene a -20 ° C para amplificação de CAV2 em larga escala.</li>
</ol>
4. Purificação CAV2 em larga escala
<ol>
	<li>Infectar 80-90% de monocamadas confluentes de células DK-E1 cultivadas em quarenta placas de cultura de tecidos de 10 cm de diâmetro. Para cada placa, use 0,1 ml de sobrenadante contendo vírus diluído em 1 ml de DMEM completo sem FCS. Incubar as células a 37 °C durante 3 a 4 horas sob leve agitação. Adicione 5 ml de DMEM completo suplementado com 5% de FCS.</li>
	<li>Incubar por 3 dias. Colha as células infectadas das quarenta placas de 10 cm em tubos de polipropileno de 50 ml. Células de pellets a 1.200 x g por 10 min a 4 ° C e ressuspendê-las em 15 ml de meio DMEM.</li>
	<li>Romper as células através de três ciclos de congelamento e descongelamento (-80 °C/37 °C). Remova os detritos celulares centrifugando a 1.800 x g por 10 min e armazene o sobrenadante a -20 ° C antes da purificação das partículas virais.</li>
	<li>Preparar um gradiente descontínuo de CsCl num tubo Ultra-Clear de 14 ml. Primeiro, despeje 2 ml de solução de CsCl (1,40 g/ml em solução salina tamponada com fosfato) no fundo do tubo. Em seguida, adicione lentamente 2 ml de solução de CsCl (1,25 g/ml em solução salina tamponada com fosfato) por cima da primeira solução.</li>
	<li>Carregue cuidadosamente o sobrenadante viral no topo do gradiente de CsCl. Encha o tubo com óleo mineral até 2-3 mm do topo. Centrifugue por 1,5 horas a 130.000 x g e 18 °C em um rotor SW40 oscilante.</li>
	<li>Após a centrifugação, duas faixas brancas são claramente visíveis na interface entre as 2 camadas de solução de CsCl ( Figura 2C ). Usando uma agulha de 21 G e uma seringa, colete por punção lateral a banda inferior contendo partículas CAV2 maduras. Tente ao máximo evitar coletar a banda superior, que corresponde a partículas virais vazias.</li>
	<li>Preparar um gradiente contínuo de CsCl num tubo transparente de 14 ml, misturando as partículas virais recolhidas com uma solução de CsCl (1,34 g/ml em solução salina tamponada com fosfato). Encha o tubo com óleo mineral até 2-3 mm do topo. Centrifugue por 18 horas a 130.000 x g e 18 °C em um rotor SW40 oscilante.</li>
	<li>Após centrifugação, colete a banda branca contendo CAV2 por punção lateral com uma seringa, conforme descrito acima. Novamente, tente evitar coletar a banda superior restante. Isso deve ser mais fácil neste gradiente contínuo, que separa melhor as duas bandas. O volume total da suspensão recolhida não deve exceder 2 ml.</li>
	<li>Equilibre uma coluna Sephadex G-25 PD-10 com 30 ml de PBS.</li>
	<li>Carregue a suspensão viral e descarte o fluxo.</li>
	<li>Eluir com fracções de 500 μl de PBS. Colete as frações 5-7, que geralmente contêm as partículas CAV2 dessalinizadas. As frações contendo vírus podem ser facilmente identificadas porque são opalescentes. Adicionar 150 μl de glicerol a 1,5 ml de suspensão de CAV2 e conservar em alíquotas a -80 °C.</li>
</ol>
5. Titulação de CAV2 por diluição do ponto final
<ol>
	<li>Descongele uma alíquota do vírus purificado no gelo e realize diluições seriadas de 10 vezes (variando de 10-2-10-12) em DMEM sem soro.</li>
	<li>Adicionar 50 μl de cada diluição viral em 5 alvéolos de uma placa de 96 poços. Adicione 1,5 x 104 células DK-E1 em cada poço. Incubar a placa a 37 °C e 5% de CO2 durante 5 dias.</li>
	<li>No dia 5 pós-infecção, monitore a aparência do CPE por observação microscópica (Figuras 2A-B). Os títulos infecciosos são determinados como doses infecciosas medianas de cultura de tecidos (TCID50), usando o método estatístico de Reed e Muench13.</li>
</ol>

<ol><li>Kaufmann, J. K., Nettelbeck, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+chimeras+for+gene+therapy%2C+vaccination%2C+and+oncolysis%3A+adenoviruses+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Virus chimeras for gene therapy, vaccination, and oncolysis: adenoviruses and beyond.</a> Trends Mol. Med. 18, 365-376 (2012).</li>
<li>Curr, Topics Microbiol. Immunol. 343, 195-224 (2010).</li>
<li>Zak, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merck+Ad5%2FHIV+induces+broad+innate+immune+activation+that+predicts+CD8%28%2B%29+T-cell+responses+but+is+attenuated+by+preexisting+Ad5+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Merck Ad5/HIV induces broad innate immune activation that predicts CD8(+) T-cell responses but is attenuated by preexisting Ad5 immunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3503-3512 (2012).</li>
<li>Paillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+non-human+adenoviruses+versus+human+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Advantages of non-human adenoviruses versus human adenoviruses.</a> Hum. Gene Ther. 8, 2007-2009 (1997).</li>
<li>Ackermann, A., Guelzow, T., Staeheli, P., Schneider, U., Heimrich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+dissemination+in+the+mouse+nervous+system%2C+using+a+green+fluorescent+protein-expressing+Borna+disease+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral dissemination in the mouse nervous system, using a green fluorescent protein-expressing Borna disease virus vector.</a> J. Virol. 84, 5438-5442 (2010).</li>
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<li>Bouet-Cararo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+adenoviruses+elicit+both+humoral+and+cell-mediated+immune+responses+against+rabies+following+immunisation+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunisation of sheep.</a> Vaccine. 29, 1304-1310 (2011).</li>
<li>Soudais, C., Skander, N., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+transduction+of+neurons+throughout+the+rat+CNS+using+novel+helper-dependent+CAV-2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo transduction of neurons throughout the rat CNS using novel helper-dependent CAV-2 vectors.</a> FASEB J. 18, 391-393 (2004).</li>
<li>Deinhardt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5+and+Rab7+control+endocytic+sorting+along+the+axonal+retrograde+transport+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway.</a> Neuron. 52, 293-305 (2006).</li>
<li>Soudais, C., Laplace-Builhe, C., Kissa, K., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+transduction+of+neurons+by+canine+adenovirus+vectors+and+their+efficient+retrograde+transport+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Preferential transduction of neurons by canine adenovirus vectors and their efficient retrograde transport in vivo.</a> FASEB J. 15, 2283-2285 (2001).</li>
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<li>Chartier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+recombinant+adenovirus+vectors+by+homologous+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli.</a> J. Virol. 70, 4805-4810 (1996).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hyg%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Segura, M. M., Puig, M., Monfar, M., Chillon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatography+purification+of+canine+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Ther.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatography purification of canine adenoviral vectors.</a> Human Gene Ther. Methods. 23, 182-197 (2012).</li>
<li>Segura, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+assay+for+quantification+of+canine+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virological%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR assay for quantification of canine adenoviral vectors.</a> Journal of virological. 163, 129-136 (2010).</li>
<li>Fernandes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocess+development+for+canine+adenovirus+type+2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioprocess development for canine adenovirus type 2 vectors.</a> Gene Ther. , (2012).</li>
<li>Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K., Kienitz, M. C., Pott, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+delivery+of+short+hairpin+RNA+%28shRNA%29+mediates+efficient+gene+silencing+in+terminally+differentiated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes.</a> Methods Mol. Biol. 515, 107-123 (2009).</li>
<li>Huang, B., Kochanek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+silencing+of+huntingtin+expression+by+shRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated silencing of huntingtin expression by shRNA.</a> Hum. Gene Ther. 16, 618-626 (2005).</li>
<li>Tordo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+adenovirus+based+rabies+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Canine adenovirus based rabies vaccines.</a> Dev. Biol. 131, 467-476 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O método simples aqui descrito, adaptado da bem documentada tecnologia Ad5, permite a produção eficiente de vetores CAV2 não replicativos com uma capacidade de clonagem típica de ~ 4,2 kbp. Em relação às considerações de tempo, um genoma CAV2 recombinante geralmente é gerado em duas semanas, enquanto levará mais 5 semanas para amplificar, purificar e titular suspensões virais.
Embora a produção do primeiro lote de vetores derivados de CAV2 possa parecer demorada, deve-se lembrar que a produção...

Nas últimas décadas, os vetores derivados de adenovírus (Ads) provaram sua eficácia para terapia gênica e vacinação, bem como na viroterapia oncolítica 1. Os anúncios são vírus icosaédricos não envelopados da família Adenoviridae, que foram isolados de mamíferos, aves, répteis, anfíbios e peixes. Desde sua descoberta em 1953, os ADs têm sido intensamente estudados como modelos para estudar as interações vírus/célula e, mais recentemente, como sistemas de entrega de genes baseados em vetores 2. De fato, os vetores baseados em anúncios oferecem muitas vantagens, como sua ampla gama de hospedeiros e biologia bem caracterizada, juntamente com a facilidade com que podem ser geneticamente manipulados e amplificados para produção em larga escala.
Para superar as dificuldades clínicas relacionadas à imunidade pré-existente em populações humanas em relação a vetores derivados de anúncios humanos 3, nós e outros começamos a derivar vetores de anúncios não humanos 4. Além disso, os vetores adenovirais não humanos parecem estar mais adaptados para vacinação em massa em medicina veterinária do que o adenovírus tipo 5 (Ad5) classicamente utilizado, uma vez que devem estar mais em conformidade com os requisitos de segurança e proteção durante a avaliação dos riscos pelas autoridades reguladoras nacionais. No final da década de 1990, descrevemos o primeiro CAV2 recombinante como uma alternativa não humana aos vetores derivados de Ad5 5. Desde então, vários estudos confirmaram o potencial dos vetores CAV2 para transferência de genes terapêuticos ou antigênicos (para revisões 6,7). Como outros Ads, os vetores derivados de CAV2 são estáveis e podem ser produzidos com altos títulos, o que facilita seu uso in vivo. Também são seguros, pois não são integrativos, embora permitam a expressão transgênica de longa duração in vivo (>1 ano) 8. Notavelmente, e melhor do que os sorotipos humanos de Ads, os vetores CAV2 têm se mostrado altamente neurotrópicos, com um transporte retrógrado muito eficiente nos axônios 9,10. Essa propriedade intrínseca trouxe a ideia de usar vetores CAV2 recombinantes para transduzir neurônios de áreas cerebrais específicas que são dificilmente acessíveis aos vetores lentivirais, até então comumente usados para transferência de genes para o sistema nervoso central 11.
Aqui, descrevemos um protocolo simples e clássico para construir, produzir e purificar vetores CAV2 não replicativos derivados da cepa Manhattan. Os genomas CAV2 recombinantes são construídos clonando o gene de interesse desejado (GOI) em um a jusante do promotor inicial do citomegalovírus (CMV), que fornece uma expressão onipresente. Os vetores CAV2 têm uma capacidade de clonagem de ~4,2 kbp, o que permite expressar cDNA grande. Em uma segunda etapa, esse de expressão é inserido por recombinação homóloga no lugar da região E1 do genoma do CAV2, levando a um vírus não replicativo (dlE1), conforme descrito inicialmente por Chartier et al. 12 Finalmente, as partículas virais são produzidas após a transfecção do plasmídeo genômico em uma linha de células renais caninas que expressam CAV2-E1 (DK-E1) e são amplificadas em série antes da concentração e purificação dos estoques virais. O método aqui descrito utiliza uma ultracentrifugação em duas etapas em gradientes de cloreto de césio (CsCl), que permite o enriquecimento de partículas infecciosas com um título final elevado (geralmente superior a10 10 partículas infecciosas por ml). A suspensão viral é então dessalinizada por cromatografia através de colunas descartáveis de Sephadex G-25 para que seja pura o suficiente para ser usada diretamente in vivo.

<table><tbody><tr><td>Enzimas de restrição</td><td>New England Biolabs</td><td>Vários</td><td></td></tr><tr><td>Jet Prime kit de transfecção</td><td>Polyplus</td><td>114-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10567014</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BJ5183 bactérias</td><td>Agilent</td><td>200154</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 coluna de dessalinização</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr>Kit de plasmídeo <tr><td>Nucleospin EmeraldAmp polimerase</td><td>Takara</td><td>RR320A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Macherey-Nagel</td><td>740558.250</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel e PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 14 ml, Ultra Clear</td><td>Beckman</td><td>344060</td><td></td></tr></tbody></table>

produção e purificação de adenovírus não replicativa canino tipo 2 vectores derivados

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Os vetores derivados de adenovírus (Ad) têm sido amplamente utilizados para transferência de genes de curto ou longo prazo, tanto para terapia gênica quanto para aplicações de vacinas. Devido à frequente imunidade pré-existente contra o adenovírus humano tipo 5 classicamente usado, o adenovírus canino tipo 2 (CAV2) foi proposto como um vetor alternativo para a transferência de genes humanos. A biologia bem caracterizada do CAV2, juntamente com sua facilidade de manipulação genética, oferece grandes vantagens, notadamente para a transferência de genes para o sistema nervoso central, ou para induzir uma ampla gama de respostas imunes protetoras, desde a imunidade humoral até a celular. Atualmente, o CAV2 representa um dos adenovírus não humanos mais atraentes para uso como vetor vacinal. Este protocolo descreve um método simples para construir, produzir e titular vetores CAV2 recombinantes. Após a clonagem do de expressão do gene de interesse em um plasmídeo de transporte, o plasmídeo genômico recombinante é obtido por recombinação homóloga na cepa bacteriana E. coli BJ5183. O plasmídeo genômico resultante é então transfectado em células renais caninas que expressam os genes CAV2-E1 complementares (DK-E1). Uma amplificação viral permite a produção de um grande estoque viral, que é purificado por ultracentrifugação através de gradientes de cloreto de césio e dessalinizado por diálise. A suspensão viral resultante rotineiramente tem um título de mais de 10a 10 partículas infecciosas por ml e pode ser administrada diretamente in vivo.

A produção de vetores recombinantes de CAV2 depende de técnicas básicas, mas importantes, de biologia molecular. Antes da produção dos vetores virais, é de fato necessário construir um genoma recombinante de CAV2 contendo um cassete de expressão para o transgene. Essa construção envolve duas etapas: primeiro, o gene de interesse (GOI) é clonado em um plasmídeo intermediário como um cassete de expressão (ou seja, com promotor e sinal de poliadenilação). Esse elemento funcional é flanqueado por duas sequências gen...

Nos últimos 15 anos, os vetores derivados do adenovírus canino tipo 2 (CAV2) provaram sua eficiência na transdução de células in vitro e in vivo e são amplamente utilizados para vacinação e terapia gênica. Aqui, descrevemos um procedimento para construir, produzir e purificar vetores CAV2, dando origem a suspensões virais de alto título.

Produção e Purificação de Adenovírus não replicativa Canino Tipo 2 vectores derivados

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

O objetivo geral deste procedimento é construir, produzir e purificar vetores derivados de adenovírus caninos tipo dois. Isso é feito primeiro clonando o gene de interesse em um plasmídeo de transporte. O segundo passo é obter um plasmídeo genômico recombinante por recombinação homóloga.Em seguida, o bezerro defeituoso recombinante, dois vírus produzidos e amplificados em uma linhagem celular trans complementar. A etapa final é purificar e concentrar o vírus recombinante resultante para diversas aplicações in vivo e in vitro. Em última análise, a microscopia confocal de imunofluorescência é usada para mostrar exemplos de transdução viral no cérebro de roedores.A principal vantagem dessas técnicas sobre os métodos existentes, como vetores derivados da neurose humana e neurose, é que não há imunidade preexistente contra o bezerro dois em populações humanas. Portanto, esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos da vacinação ou terapia genética, como avaliar o papel das proteínas expressas em áreas específicas do cérebro. Portanto, demonstrando este procedimento estarão May KY e Corin Bergeron.Dois pesquisadores de pós-doutorado de nossos laboratórios Prepare-se para este procedimento um dia antes da transfecção, semeando células DKE um em uma placa de seis poços cultivando células a 37 graus Celsius e 5% de CO2 em DMEM com glicose alta contendo 7% de calor, bezerro fetal inativado, sódio sérico, piruvato, penicilina e estreptomicina. No dia seguinte, as células devem ser 70 a 80% confluentes para transfecção digerir dois microgramas de pcal GOI o plasmídeo genômico cav dois recombinante com ASC um para liberar a sequência não viral do plasmídeo, verificar o padrão de restrição resultante em 0,8% A digestão por eletroforese em gel Agro deve produzir um fragmento de par de aproximadamente 31 quilobases contendo o genoma recombinante e um fragmento de dois pares de quilobases correspondente à estrutura do plasmídeo. Misture o DNA digerido com 200 microlitros de tampão jet prime e vórtice por 10 segundos.Adicione quatro microlitros de jet prime e misture por vórtice por 10 segundos. Gire brevemente para remover as gotículas e incube por 10 minutos. À temperatura ambiente, adicione a mistura de transfecção gota a gota nas células DKE one.Agite suavemente a placa para distribuir uniformemente a mistura e incube a 37 graus Celsius. Uma semana após a transfecção, coletar células e meio de cultura em tubo de polipropileno de 15 mililitros. Interrompa as células por três ciclos de pensamento congelados.Limpe o lisado por centrifugação por 10 minutos a 1.800 vezes G. Colete o sobrenadante e armazene a menos 20 para propagação subsequente do vírus para propagar o vírus infectar uma monocamada confluente de 80 a 90% de células DKE uma cultivadas em um poço de uma placa de seis poços com 0,5 mililitros do vírus contendo sobrenadante. Incubar a 37 graus Celsius durante uma hora sob agitação ligeira Após uma hora. Remova o inóculo e substitua-o por 1,5 mililitros de DMEM completo contendo células incubadas FCS inativadas por 5% a 37 graus Celsius por três a quatro dias.As células devem ser monitoradas diariamente quanto ao aparecimento de um efeito citopático ou CPE. Se nenhum CPE claro estiver visível. Colha as células após quatro dias de cultivo e repita a amplificação viral quando um CPE claro afetar a maioria das células.Normalmente, após duas a quatro rodadas de amplificação viral, colete células com meio de cultura e congele e descongele três vezes, conforme demonstrado anteriormente. Infecta 80 a 90% confluente. DKE one células cultivadas em três placas de cultura de tecidos de 10 centímetros de diâmetro usando 1,5 mililitros de vírus contendo sobrenadante por placa após três a quatro dias, quando o CPE estiver completo.Colha as células desses pratos de 10 centímetros de diâmetro, interrompa-os por três ciclos de estilo livre e limpe o lisado por centrifugação por 10 minutos a 1.800 vezes. G coletar sobrenadante e armazenar a menos 20 para amplificação de Cav dois em grande escala para iniciar o procedimento de aumento de escala infectar 80 a 90% de monocamadas confluentes de células DKE um cultivadas em 40 placas de cultura de tecidos de 10 centímetros de diâmetro para cada placa usar 0,1 mililitros de vírus contendo sobrenadante diluído em um mililitro de DMEM completo sem FCS incubar células a 37 graus Celsius por três a quatro horas sob agitação leve. Após três a quatro horas, adicione cinco mililitros de DMEM completo suplementado com 5%FCS e incube por três dias.Após três dias, colha as células infectadas dos 40 pratos de 10 centímetros em tubos de polipropileno de 50 mililitros, células pellet a 1.200 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Resus suspendê-los em 15 mililitros de meio DMEM perturbar as células por três ciclos de congelamento e descongelamento. Remover os restos celulares centrifugando a 1.800 vezes G durante 10 minutos.Armazenar o sobrenadante a menos 20 antes da purificação das partículas virais para purificação das partículas virais. Preparar um gradiente descontínuo de cloreto de césio num tubo UltraClear de 14 mililitros. Primeiro, despeje dois mililitros da solução de cloreto de césio de alta densidade no fundo do tubo.Em seguida, adicione lentamente dois mililitros da solução de cloreto de césio de baixa densidade em cima da primeira solução. Carregue cuidadosamente o sobrenadante viral no topo do gradiente de cloreto de césio. Encha o tubo com óleo mineral até dois a três milímetros da centrífuga superior em um rotor SW 40 oscilante por uma hora e 30 minutos a 130.000 vezes g e 18 graus Celsius após a centrifugação.Duas faixas brancas são claramente visíveis na interface entre as duas camadas de solução de cloreto de césio. Usando uma agulha de calibre 21 e uma seringa, colete por punção lateral a faixa inferior contendo duas partículas maduras. Tente ao máximo evitar coletar a banda superior que corresponde a partículas virais vazias.Preparar um gradiente contínuo de cloreto de césio num tubo transparente de 14 mililitros, misturando as partículas virais colectivas com uma solução de cloreto de césio. Encha o tubo com óleo mineral até dois a três milímetros da centrífuga superior em um rotor SW 40 oscilante por 18 horas a 130.000 vezes G e 18 graus. Após centrifugação, recolha o bezerro branco dois contendo a punção lateral com uma seringa, conforme demonstrado anteriormente.Novamente, tente evitar coletar a banda superior restante. Isso deve ser mais fácil neste gradiente contínuo que separa melhor as duas bandas. O volume total da suspensão recolhida não deve exceder dois mililitros.Em seguida, equilibre uma coluna cidex G 25 PD 10 com 30 mililitros de PBS. Carregue a suspensão viral na coluna e descarte o fluxo através da elução com frações de 500 microlitros de PBS coletando frações cinco a sete, que geralmente contêm as duas partículas dessalinizadas. O vírus contendo frações pode ser facilmente identificado porque há cheiro abençoado.Finalmente, adicione 150 microlitros de glicerol aos 1,5 mililitros de suspensão CAV dois e armazene em Eloqua a 80 graus Celsius negativos para titular cav dois por diluição final, descongele uma alíquota de vírus purificado no gelo e execute uma diluição serial de dez vezes variando de 10 a menos dois a 10 a menos 12 no DMEM livre sérico. Adicione 50 microlitros de cada diluição viral em cinco poços de uma placa de 96 poços, adicione 1,5 vezes 10 ao quarto DKE, uma célula a cada poço, incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por cinco dias no quinto dia. Aparência do CPE do monitor pós-infecção por observação microscópica.Os títulos infecciosos são determinados como doses infecciosas medianas de cultura de tecidos usando o método estatístico read e men antes da produção de vetores virais. Um genoma CAV dois recombinante com um de expressão para o transgene é construído usando técnicas padrão de biologia molecular. Primeiro, o gene de interesse é clonado em um plasmídeo de transporte como um de expressão com um promotor inicial de citomegalovírus e um sinal de poliadenilação flanqueado por duas sequências genômicas derivadas de CAV que representam as sequências-alvo de recombinação a montante e a jusante.Em uma segunda etapa, o de expressão é inserido do plasmídeo do ônibus espacial no genoma CAV dois por recombinação homóloga. A inserção do de expressão GOI levará à deleção do EA e parte do gene E one B no genoma recombinante. Uma vez obtido o plasmídeo genômico recombinante, as partículas virais são produzidas usando CAV dois E um complementando as células DKE um.Um claro efeito citopático devido à grande quantidade de partículas virais produzidas nas células infectadas pode ser facilmente visualizado por microscopia de campo claro ou por expressão transgênica. Este exemplo é de um GFP expressando CAV dois vetores. Após várias rodadas de amplificação viral usando células DKE um frescas, as partículas virais são purificadas por ultracentrifugação em gradientes de cloreto de césio.As partículas virais concentradas aparecem como duas bandas opalescentes dentro do gradiente de césio. A banda inferior corresponde ao cav dois recombinante maduro que deve ser coletado. Enquanto a banda superior contém partículas não infecciosas vazias que devem ser evitadas.O vetor recombinante resultante do bezerro dois pode ser usado para transduzir quase todos os tipos de células em uma ampla variedade de espécies, in vitro ou in vivo. Aqui é mostrado um exemplo de aplicação em que o GFP expressando CAV dois foi injetado por táxi estéreo em diferentes áreas do sistema nervoso central do camundongo. Uma vez que este protocolo produz alto título e injeção de estoques virais puros e puros de apenas um microlitro de PBS diluído GFP expressando CAV dois vetores no giro dentado ou DG leva a 40 a 50% de transdução neuronal.Além disso, devido à capacidade de C dois de ser transportado retrógrado em axônios, injeção de dois microlitros de PBS diluído GFP expressando CAV dois vetor no estriado permite a transdução de quase 80% dos neurônios nigro stri AAL nos subs, nigra pars compacta Após seus desenvolvimentos. Essas técnicas abrem caminho para pesquisadores nas áreas de vacinologia ou neurociências explorarem novos antígenos e funções gênicas no cérebro em diversos modelos animais. Portanto, não se esqueça de que trabalhar com dois vetores derivados do CAF pode ser extremamente perigoso e cauteloso, como medidas adequadas de contenção e manuseio de resíduos, incluindo equipamentos de proteção individual e trabalho em capelas de fluxo laminar em dois laboratórios BSL devem sempre ser tomados durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Recombinante adeno-associated virus (rAAVs) vetores estão se tornando cada vez mais valioso...

Produção e titulação de adeno-associados recombinantes Vetores Virais

Descrevemos aqui um protocolo baseado apenas em infecção de células, o que melhora a eficiência da produção de parvovírus recombinante por mais de 100 vezes em comparação com outros protocolos em uso. Este protocolo assenta na utilização de um adenovírus romance 5-base auxiliar contendo o parvovírus unidade de transcrição VP (Ad-VP).

Produção Parvovirus eficiente recombinante com a ajuda de Adenovirus sistemas derivados

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Um protocolo para geração de vetores adenovirais de alta capacidade sem todas as sequências codificadoras virais é apresentado. A clonagem de transgenes contidos no genoma do vetor é baseada em endonucleases homing. A amplificação do vírus em células produtoras cultivadas como células aderentes e em suspensão depende de um vírus auxiliar que fornece genes virais em trans.

Clonagem e produção em larga escala de alta capacidade vetores adenovirais com base no tipo adenovírus humano 5

Aqui, descrevemos uma estratégia eficiente e reprodutível para produzir, título e lotes de qualidade-controle de vetores de vírus adeno-associado. Permite ao usuário obter uma preparação de vetor com alta-título (≥ 1 x 1013 vector genomas/mL) e um elevado grau de pureza, pronto para uso em vitro ou na vivo .

Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado

Aqui, apresentamos um protocolo para a produção de adenovírus usando o sistema pAdEasy. A tecnologia inclui a recombinação dos plasmídeos pAdEasy-1, a embalagem e amplificação do adenovírus, a purificação das partículas adenovirais do meio de cultura e lise celular, a titulação viral e o teste funcional do adenovírus.

Um método eficiente para a produção de adenovírus

Aqui fornecemos um procedimento detalhado para a produção em larga escala de vetores AAV de grau de pesquisa usando células hek 293 aderentes cultivadas em pilhas de células e purificação de cromatografia de afinidade. Este protocolo produz consistentemente &gt;1 x 1013 genomas vetoriais/mL, fornecendo quantidades vetoriais apropriadas para grandes estudos em animais.

Produção de vetores de vírus associados a Adeno em pilhas de células para estudos pré-clínicos em grandes modelos animais

Neste protocolo, o vetor AAV2 é produzido por células de insetos Spodoptera frugiperda (Sf9) com baculovírus (BV)-AAV2-green fluorescente protein (GFP) ou gene terapêutico e células Sf9 infectadas por BV-AAV2-rep-cap na cultura de suspensão. As partículas de AAV são liberadas das células usando detergente, clarificadas, purificadas pela cromatografia da coluna de afinidade, e concentradas pela filtragem de fluxo tangencial.

Desenvolvimento de processos para a produção e purificação do vírus associado ao Adeno (AAV)2 Vetor usando o sistema de cultura de células de baculovírus-inseto

Aqui fornecemos um procedimento detalhado para produção, purificação e quantificação do vírus recombinante da doença de Newcastle. Este protocolo rende consistentemente &gt; 6 × 109 unidades formadoras de placas/mL, fornecendo quantidades de vírus apropriadas para estudos in vivo em animais. Ensaios adicionais de controle de qualidade para garantir a segurança in vivo são descritos.

Produção de Vírus da Doença de Newcastle Recombinante de Alta Titer a partir de fluido allantóico

Aqui, um protocolo de produção de AAV baseado em células HEK293 de suspensão é apresentado, resultando em tempo e mão de obra reduzidos necessários para a produção de vetores usando componentes que estão disponíveis para fins de pesquisa de fornecedores comerciais.

Produção de lotes vetoriais associados a adeno de alto rendimento usando células de suspensão HEK293

Aprenda a produzir e purificar vetores derivados do adenovírus canino tipo 2 (CAV2) para terapia gênica e vacinação. Este método permite obter suspensões virais de alto título para aplicações in vitro e in vivo.

Produção e Purificação de Adenovírus não replicativa Canino Tipo 2 vectores derivados

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