Analisando Dynamics proteína utilizando hidrogênio câmbio Espectrometria de Massa

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar a flexibilidade de confirmação em proteínas e suas mudanças em resposta ao ambiente, ligação ao ligante ou interações proteínas-proteínas. Isso é conseguido pré-incubando a proteína de interesse sob diferentes condições que se suspeita influenciarem a confirmação da proteína, como a ligação do ligante. A mistura de reação é então diluída em óxido de deutério, incubada por diferentes intervalos de tempo e posteriormente analisada por espectrometria de massa por cromatografia líquida para determinar o grau de incorporação de deutero na estrutura do peptídeo.

Grupos amida, como as áreas protegidas diminuíram a incorporação de deuteros, comparando os espectros peptídicos do experimento na ausência e presença de um parceiro de ligação revela uma mudança do OID dos espectros devido à diferença de peso entre próton e deutério. Regiões que exibem proteção proeminente após a adição de um parceiro de ligação são locais de ligação potenciais. Dependendo da cobertura da sequência e da disponibilidade de peptídeos sobrepostos, os locais de ligação podem ser reduzidos a alguns aminoácidos.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de dobramento de proteínas e no campo da dinâmica de proteínas, como como as proteínas se dobram, como se desdobram, como reagem a impactos físicos e químicos, como aumento de temperatura ou metais pesados. Como a ligação comparada e as interações proteína-proteína podem influenciar a confirmação de uma proteína. Também é muito importante para o desenvolvimento de medicamentos proteicos para verificação do dobramento adequado e para o controle geral de qualidade.

Geralmente, indivíduos novos neste método podem encontrar várias dificuldades. Se a proteína, por exemplo, não for bem digerida pela pepsina, a cobertura da sequência será baixa. Se a proteína for muito propensa à agregação, ela pode se agregar durante a incubação ou após a adição do tampão de resfriamento e resultará em baixas intensidades de sinal no espectrômetro de massa.

Nesta demonstração, investigaremos a ligação da chaperona molecular de levedura, HP 90 à sua chaperona cos Sty one usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio STY one se liga a HP 90 e facilita a ligação do cliente pela inibição da atividade ABAs de HB noventa. Comece este procedimento com a preparação de tampões, amostras e contas, conforme detalhado no protocolo de texto. Para preparar as colunas para a troca de hidrogênio amida, desparafuse um lado da coluna de proteção e remova o filtro firmemente.

Aparafuse o funil de embalagem na extremidade aberta da coluna. Use um adaptador de 16 polegadas para conectar uma seringa vazia de cinco mililitros à saída inferior da coluna. Certifique-se de fixá-lo à prova de gás na coluna de proteção.

Aplique algumas gotas de material de cordão de pasta no topo do funil. Puxe o êmbolo da seringa para aspirar a pasta através do funil para a coluna de proteção. Aplique mais material de cordão de lama no funil e continue o procedimento até que a coluna de proteção esteja completamente preenchida com material de cordão.

Em seguida, remova o funil antes de colocar o filtro e o anel do filtro na extremidade aberta firmemente. Enrosque a tampa da coluna na coluna de proteção e remova a seringa do outro lado. Feche ambas as extremidades das colunas de proteção com plugues.

Para evitar a secagem do material da coluna, configurar o sistema de espectrometria de massa de troca de hidrogênio. Primeiro conecte a coluna de armadilha ao sistema de cromatografia líquida de alta resolução ou HPLC. Equilibre a coluna definindo a vazão da bomba A para 0,4 mililitros por minuto com 0,1% de ácido fórmico como solvente.

Depois de calibrar o espectrômetro de massa, conecte a saída do HPLC à fonte do espectrômetro de massa. Para determinar os peptídeos pépticos primeiro, conecte a coluna de Pepin e depois a coluna analítica ao sistema. Configure os parâmetros para cromatografia e espectrometria de massa no software de controle, escolhendo o tipo de gradiente e o método de espectrometria de massa.

Escolha um gradiente longo para garantir uma boa resolução cromatográfica. Habilite espectros de massa em tandem no espectrômetro de massa. Prepare 100 a 200 pomo de proteína de choque térmico 90 ou HSP 90 em 100 microlitros de tampão H dois L.

Adicione 100 microlitros de tampão de têmpera e misture pipetando para cima e para baixo. Injete a amostra de 200 microlitros na porta de injeção da válvula de injeção com uma seringa Hamilton. Coloque a válvula de injeção na posição de injeção e inicie o programa de cromatografia.

Em seguida, identifique os peptídeos pépticos da proteína de choque térmico 90 pesquisando em um banco de dados os peptídeos resultantes. Diminua a temperatura do sistema para zero graus Celsius adicionando água gelada. Repita esta etapa sem espectrometria de massa em tandem e com o gradiente que será usado para o experimento de troca de hidrogênio real.

Para a proteína de choque térmico 90 e STI um, use um gradiente de 10 minutos de 90% de solvente, um 10% de solvente B a 45% de solvente, A 55% de solvente B, determine os tempos de retenção dos peptídeos pépticos identificados no gradiente usado e crie uma lista compreendendo sequência de peptídeos, carga de peptídeos, estado e tempo de retenção. Isso será usado para identificar cada peptídeo após experimentos de troca de hidrogênio. Para identificar interfaces de interação proteína-proteína, primeiro configure o método de gradiente e espectrometria de massa.

No software de controle, use um gradiente linear de 10 minutos de 90% de solvente, um 10% de solvente B a 45% de solvente. Uma carga B de 55% de solvente é um método de espectrometria de massa otimizado para detecção entre 300 a 1.500 razões massa/carga, embora a maioria dos peptídeos esteja abaixo da proporção de 1000 massa/carga. Coloque a válvula de injeção na posição de carga e a válvula de seis portas.

Na posição de dessalinização de carregamento, defina a vazão da bomba de carregamento para 0.4 mililitros por minuto. Depois de executar a referência inalterada e a amostra de controle de 100% conforme descrito no protocolo de texto, prepare 20 a 100 pico mol de proteína de choque térmico 90 em um volume de um a cinco microlitros. Adicione tampão de óxido de deutério ajustado à temperatura para aumentar o volume da amostra até 100 microlitros incubar pelo período exato de tempo que foi definido anteriormente, conforme descrito no protocolo de texto.

Ao determinar a faixa dinâmica de troca, adicione 100 microlitros de gelado, tempere o tampão e pipete para cima e para baixo duas vezes injete rapidamente os 200 microlitros na válvula de injeção do HPLC. Coloque a válvula de injeção na posição de injeção e inicie imediatamente o programa de cromatografia. Após dois minutos, mude a válvula de seis portas da posição de carga de dessalinização para a posição de eluição.

Faça isso para cada proteína individualmente para determinar a incorporação de deutério em cada peptídeo na ausência da proteína de interação para determinar a proteína de choque térmico de mistura de superfície de interação 90 com um excesso de pelo menos duas vezes de STI um para mudar o equilíbrio para o estado ligado, incubado a temperatura desejada até que a formação do complexo esteja em equilíbrio. Após a incubação, adicione tampão de óxido de deutério ajustado à temperatura para aumentar o volume da amostra para 100 microlitros e incube exatamente por um período de tempo definido. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de têmpera gelada e pipete para cima e para baixo duas vezes, injete rapidamente a proteína e execute como antes.

Analise os dados adquiridos com software adequado e use os tempos de retenção determinados para encontrar cada peptídeo na análise. Calcule o OID da distribuição isotópica para a proteína inalterada e para os experimentos de troca de hidrogênio, compare a incorporação de deuteros da proteína-alvo sozinha e com o excesso de parceiro de ligação. Isso pode ser feito automaticamente com software comercial ou manualmente com o programa de planilha M, a interação direta da proteína proteica entre HS P 90 e STI um foi testada comparando os espectros de peptídeos STI um na ausência e presença HS P 90 após a marcação de óxido de deutério.

O gráfico de diferença resultante revela que a maioria dos peptídeos em TPR dois A e TPR dois B apresentam uma forte proteção na presença de HS P 90, indicando que essas regiões interagem com HS P 90. A proteção em TPR dois A pode ser facilmente racionalizada a partir da estrutura cristalina de STY um TPR dois A TPR dois B em complexo com um peptídeo HS P 90, que é colorido de acordo com o número de prótons amilóides protegidos da incorporação de DEUTERO. Essa proteção clara nas interações proteína-proteína nem sempre é observada.

A proteção no HSP 90 na presença de IST não é tão pronunciada e não é tão localizada quanto na IST um. Todos os peptídeos mostram proteção ligeiramente aumentada contra a incorporação de deutero. Aqui é mostrada uma representação de desenho animado da levedura HS P 90 colorida de acordo com o número de prótons amli protegidos da incorporação de deutério, STY estabiliza HS P 90 globalmente, pois nenhuma região da proteína mostra mais flexibilidade em sua presença.

Não está claro se essa incorporação reduzida de deutério se origina da interação direta com o chiqueiro ou por meio de efeitos alostéricos. Na confirmação da marcação contínua de HSP 90, a troca de hidrogênio, espectrometria de massas foi utilizada para estudar a dinâmica de diferentes regiões proteicas. Aqui são mostrados os espectros do peptídeo 43 a 62 do domínio de ligação de nucleotídeos do HSP 90.

Na presença e ausência de IST um, os espectros peptídicos mostram uma incorporação dependente do tempo de deutério que aumenta com a incubação mais longa. O grau de proteção muda ao longo do tempo de incubação, mostrando maior diferença nos tempos de incubação mais curtos e taxas de câmbio quase semelhantes no ponto de tempo mais longo. Isso sugere um menor grau de estabilização ou uma região de interações dinâmicas com dissociação e associação frequentes.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as condições meticulosamente constantes e ter tudo pronto antes de iniciar a reação de troca. Seguindo este procedimento, outros métodos podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como a localização dos locais de interação em complexos de proteínas.