Usando Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para estudar a homeostase de proteínas em um organismo multicelular

O objetivo geral dos experimentos a seguir no metazoário geneticamente tratável CENO R elegance é monitorar o desdobramento de proteínas em três níveis, o organismo, as células e as proteínas. Fenótipos comportamentais, como motilidade ou termorresistência, funcionam como leituras de mudanças na homeostase proteica no nível do organismo, sensíveis à temperatura ou que ocorrem naturalmente. Proteínas metaestáveis são usadas para seguir a localização incorreta da proteína, que pode estar associada ao dobramento incorreto da proteína.

Um ensaio de digestão parcial ex vivo monitora diretamente a estabilidade da proteína. Os resultados podem mostrar mudanças na capacidade de proteostase em diferentes temperaturas de cultivo com base no ensaio de termorresistência, microscopia de imunofluorescência e análise de sangue ocidental. Esses procedimentos serão demonstrados por alunos de pós-graduação em meu laboratório.

O ensaio comportamental será demonstrado por ish ido e Shai demonstrará a coloração imunológica e reprovação de ANA e sheron demonstrará a digestão parcial. Este protocolo para medir a tolerância à temperatura é acompanhado por etapas preparatórias para sincronizar os animais e um ensaio de movimento. Ambos são descritos no protocolo de texto começam com a coleta de réplicas contendo pelo menos 20 animais sincronizados.

Em 24, poços bem jogados contendo 450 microlitros de amortecedor de choque térmico. Suplementar cada poço com nove microlitros de citoxina. Agora transfira o prato para um banho aquecido.

O choque térmico, a temperatura e a duração dependem fortemente das condições de crescimento. Em particular, a temperatura de cultivo pontua a sobrevivência do animal monitorando sua absorção de matriz. Usando um estereoscópio fluorescente com um filtro TXR, os animais que pegam a matriz estão mortos.

A principal vantagem desta técnica dos métodos existentes como o kine, a tolerância por pontuação manual é o uso da leitura visual da mortalidade dos animais, o que torna este ensaio muito mais rápido e reprodutível. Na fase requerida, transferir pelo menos 30 animais para um tubo de microcentrífuga contendo tampão M nove. Lavar os animais algumas vezes com M nove, executando etapas de centrifugação curtas e de baixa velocidade e suspendendo-os em M nove.

Em seguida, coloque os tubos no gelo por alguns minutos para esfriar. Depois de resfriado, remova o excesso de líquido e incube os tubos. Em 500 microlitros de gelado, 4%PARAFORM aldeído.

O tempo de incubação precisa ser calibrado para cada proteína examinada e deve ser de cerca de cinco a 30 minutos à temperatura ambiente. Agora, lave os animais fixos três vezes com PBS tween em pH 7,2 por centrifugação. As centrifugações são sempre realizadas a 3000 RPM por um ou dois minutos, a menos que especificado de outra forma.

No exaustor, remover a maior parte do sobrenadante e ressuspender o pellet em um mililitro de solução de mercaptoetanol de feixe. Em seguida, incube os animais a 37 graus Celsius durante a noite com um balanço suave no dia seguinte no capô. Lavar os animais três vezes com PBST por centrifugação e Resus.

Finalize a lavagem com 50 a 100 microlitros de PBST e remova a maior parte deste PBST após outra centrifugação. Em seguida, adicione 100 a 150 microlitros de solução de colagenase e incube os animais a 37 graus Celsius com forte agitação. Use um misturador térmico ou uma incubadora agitada.

Após cinco minutos, comece a fazer verificações periódicas sob um microscópio estéreo. Quando um quinto dos animais estiver quebrado, pare a reação colocando o tubo no gelo. Esta etapa é altamente sensível.

A duração do tratamento depende das condições de fixação e pode variar muito entre as cepas. Uma incubação prolongada pode resultar na degradação completa dos animais. As condições devem ser calibradas antes de cada lote de enzimas e a degradação deve ser cuidadosamente monitorizada.

Em seguida, lave os animais duas vezes em PBST. Recolha os animais por centrifugação e remova a maior parte do PBST. Em seguida, adicione um mililitro de uma solução BA seguida de incubação com balanço suave por uma hora em temperatura ambiente, colete os animais por centrifugação e ressuspenda-os em 200 microlitros de b, A. Agora adicione o anticorpo primário e comece uma incubação durante a noite com balanço suave à temperatura ambiente.

Esses parâmetros precisam ser calibrados. Em seguida, lave os animais por centrifugação. Ressuspenda-os em um mililitro de b, A e incube-os com uma mistura suave por 15 minutos a uma hora em temperatura ambiente.

Neste ponto, uma adição opcional de corante fluorescente pode ser adicionada. Em seguida, repita a lavagem tampão BA mais três vezes e termine as lavagens suspendendo em 100 microlitros de um BA com o anticorpo secundário marcado com fluorescência apropriado em uma diluição de um a 100. Incubar as amostras com balanço por várias horas em temperatura ambiente protegida da luz para limpar o secundário.

Faça três lavagens com a, b, a. Em seguida, monte os animais nas lâminas primeiro com Resus, suspendendo-os em 10 microlitros de b, a e, em seguida, usando uma pipeta de diâmetro largo para transferir um ou dois microlitros da amostra para cada lâmina, adicione um volume igual de meio de montagem e cubra a lâmina. Sele suavemente a lâmina com esmalte.

As lâminas podem ser armazenadas a 20 graus Celsius negativos por períodos prolongados. Geralmente, os indivíduos novos neste protocolo terão dificuldades porque o protocolo é longo e inclui muitas etapas que podem afetar sua eficiência, dificultando a solução de problemas. Comece coletando os animais de placas de cerca de 1560 milímetros em um ou dois mililitros de tampão M nove.

Os animais não devem estar superlotados. Lavar os animais algumas vezes com tampão M nove, centrifugando e suspendendo os animais. Após a rotação final, resus suspende os animais em 100 microlitros de tampão M nove.

Em seguida, congele rapidamente os animais e, usando um pilão resfriado e uma broca, triture a amostra enquanto estiver no gelo. Freqüentemente pausado para verificar se os animais estão suficientemente moídos. Assim que os animais estiverem totalmente esmagados, estime o volume do extrato do verme.

Em seguida, adicione um volume igual de duas soluções de lise de vermes e incube a amostra no gelo por 15 minutos. Em seguida, remova os detritos por um ciclo de centrifugação resfriado e transfira o sobrenadante para um tubo de microfuga limpo. Após um ensaio de Bradford, diluir a amostra para três a 3,5 miligramas de proteína por mililitro.

Em seguida, adicione a solução de tripsina de camuflagem gelada recém-preparada na proporção de um para 1200. Neste ponto, defina a amostra para incubar por uma hora. Durante a incubação, pegue periodicamente alíquotas de 20 microlitros e misture-as imediatamente com tampão SDS, seguido de cinco minutos a 96 graus Celsius.

Execute as amostras e siga com uma análise de sangue ocidental para determinar a estabilidade relativa da proteína. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não adicionar coquetel inibidor de protease à amostra de digestão e, em vez disso, manteremos as amostras rapidamente no gelo. A mutação E 781 K ts na chaperona muscular em 45 afeta fortemente o dobramento e a montagem da miosina e, portanto, afeta a motilidade animal.

Quando esses mutantes foram cultivados em temperaturas acima de 20 graus Celsius, eles ficaram completamente paralisados, mas não a 15 graus Celsius. Quando animais selvagens criados a 25 graus Celsius foram submetidos a um choque térmico prolongado, a maioria sobreviveu. Enquanto apenas 30% sobreviveram se elevados a 15 a 20 graus Celsius para monitorar os modificadores efetivos na resposta ao choque térmico, as condições de estresse de controle foram elevadas para uma taxa de sobrevivência de 70% para animais selvagens.

Os animais foram expostos a um choque térmico de 37 graus Celsius por seis horas. No primeiro dia da idade adulta, a sobrevivência foi testada pelo ensaio de captação de laranja cyt. Os animais mortos são indicados por setas brancas e os animais vivos por setas amarelas.

A localização de várias proteínas metaestáveis foi visualizada usando anticorpos específicos. Por exemplo, a paramina é localizada em conjuntos policristalinos em vez de no sarcômero muscular sob condições restritivas. Da mesma forma, a miosina TS forma filamentos desorganizados em vez das estruturas filamentosas altamente ordenadas na temperatura restritiva.

Animais expressando várias proteínas mutantes TS co-expressas com myo três. A GFP mostrou uma rápida deterioração na organização do miofilamento, conforme detectado pelo monitoramento das alterações da GFP na confirmação da miosina que podem refletir mudanças na capacidade de dobramento das células musculares. O padrão de fragmentação proteolítica da cadeia pesada da miosina, co-expresso com UNC 45 Ts, mostra características distintas em comparação com o perfil de digestão da miosina de animais selvagens, apoiando a afirmação de que o dobramento da miosina é afetado pelo UNC 45.

Perda de função. Embora este método possa fornecer informações sobre a regulação da proteostase na elegância do mar, ele também pode ser aplicado em outros sistemas, como diferentes organismos modelo.