Name: Usando Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para estudar a homeostase de proteínas em um organismo multicelular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Aprenda a monitorar o misfolding de proteínas em Caenorhabditis elegans usando ensaios comportamentais, imunofluorescência e western blot. Este método permite estudar a homeostase proteica em níveis organizacional, celular e molecular.

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Todas as cepas de nematóides usadas neste trabalho foram fornecidas pelo Caenorhabditis Genetics Center, que é financiado pelo NIH National Center for Research Resources (NCRR). Os anticorpos monoclonais desenvolvidos por H.F. Epstein foram obtidos do Banco de Hibridoma de Estudos de Desenvolvimento desenvolvido sob os auspícios do NICHD e mantido pelo Departamento de Biologia da Universidade de Iowa. N. Shemesh foi apoiado pelo prêmio Fay e Bert Harbour. AB-Z. foi apoiado por uma bolsa Alon do Conselho Israelense de Educação Superior, por uma bolsa Marie Curie International Reintegration e por doações da Binational Science Foundation e da Israeli Science Foundation (Grant No. 91/11).

Usando ensaios comportamentais para monitorar o dobramento de proteínas em um organismo vivo
1. Sincronizando animais para ensaios comportamentais
<ol>
	<li>Siga os métodos padrão para manutenção de C. elegans36, incluindo preparação de meios e placas, preparação de alimentos e condições de crescimento animal. Controle cuidadosamente as condições de cultivo, incluindo temperatura (15-25 °C), tamanho da população e disponibilidade de alimentos. Descarte qualquer prato que apresente contaminação bacteriana ou fúngica.</li>
	<li>Escolher 15-30 embriões, transferi-los para novas placas e crescer à temperatura desejada (15-25 °C) durante a experiência. Como alternativa, coloque 10-20 adultos grávidas em um prato, deixe-os botar ovos por 30-60 min e depois remova-os do prato. Tanto a colheita direta de embriões quanto a fixação de adultos grávidas darão alguma variabilidade na idade (±6 horas). Para reduzir essa variabilidade, escolha embriões em um estágio específico, por exemplo, estágio de vírgula, ou defina de 10 a 20 adultos que estão apenas começando a botar ovos (dia 2 da idade adulta). Evite a sincronização por clareamento sempre que possível, pois esse tratamento é estressante e pode afetar a proteostase.</li>
	<li>Escolha os animais sincronizados, transfira para uma placa de ensaio para pontuação e depois descarte.</li>
</ol>
2. Ensaio de Movimento
Escolher animais sincronizados e transferir para um prato limpo à temperatura desejada para a pontuação de movimento (15-25 °C). Para cada repetição biológica, pontuar >20 animais e repetir o ensaio pelo menos 3x por condição experimental. Use o teste de soma de postos de Wilcoxon Mann-Whitney para comparar duas condições experimentais independentes.
<ol>
	<li>Para testar se há comprometimento leve do movimento, coloque 5-7 animais juntos no centro de um gramado bacteriano limpo e deixe os animais se moverem no prato por 2 min. Esse intervalo de tempo foi determinado com base no tempo que 90% dos animais selvagens levaram para limpar um círculo de 1 cm.</li>
	<li>Contar o número de animais que não limparam um círculo de 1 cm (por exemplo, que permaneceram num raio de 1 cm a partir do ponto em que foram colocados) no período de 2 minutos como descoordenados.</li>
	<li>Para testar se há comprometimento grave do movimento, coloque os animais em um gramado bacteriano limpo.</li>
	<li>Fotografe vários animais no tempo zero (t = 0) e novamente 5 minutos depois (t = 5). Pontue os animais que não se moveram um comprimento de corpo após 5 min como paralisados.</li>
</ol>
3. Resistência térmica
<ol>
	<li>Escolha >20 animais sincronizados e transfira para uma placa de 24 poços contendo 450 μl de tampão de choque térmico (HS) (Tabela 1). Para cada repetição biológica, pontuar >20 animais e repetir o ensaio pelo menos 4x por condição experimental.</li>
	<li>Transfira a placa de 24 poços para um banho aquecido. A temperatura e a duração do SH dependem fortemente das condições de crescimento, em particular, da temperatura de cultivo.</li>
	<li>Suplementar o tampão HS com 9 μl de laranja SYTOX.</li>
	<li>Pontue a sobrevivência do animal monitorando a absorção de corante, usando um estereoscópio fluorescente com um filtro TXR. Os animais que absorveram o corante estão mortos. Use o teste de soma de postos de Wilcoxon Mann-Whitney para comparar duas condições experimentais independentes.</li>
</ol>
Usando imunocoloração e proteínas marcadas para monitorar o dobramento de proteínas em células específicas
4. Monitore a localização de proteínas por imunocoloração
<ol>
	<li>Na fase requerida, transferir pelo menos 30 animais para um tubo Eppendorf contendo tampão M936.</li>
	<li>Lave os animais algumas vezes com tampão M9 realizando uma etapa de centrifugação curta e de baixa velocidade (3.000 rpm / 900 x g, 2 min) e ressuspendendo.</li>
	<li>Coloque os tubos no gelo por alguns minutos para esfriar.</li>
	<li>Remova o excesso de líquido e incube com 500 μl de solução gelada de paraformaldeído a 4% (Tabela 2). O tempo de incubação precisa ser calibrado para cada proteína examinada e deve ser em torno de 5-30 min à temperatura ambiente. A incubação prolongada a 4 °C também pode ser realizada, mas isso pode prejudicar a permeabilização da amostra.</li>
	<li>Lave os animais fixos 3x com tampão PBS-Tween (pH 7,2) por centrifugação (3.000 rpm, 1-2 min). Os animais podem ser armazenados nesta fase a 4 °C durante algumas semanas.</li>
	<li>Recolher os animais por centrifugação (3.000 rpm, 1-2 min).</li>
	<li>No exaustor, remover a maior parte do sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de solução de β-mercaptoetanol (β-ME) (quadro 2).</li>
	<li>Incubar a 37 °C durante a noite com um balanço suave num nutador.</li>
	<li>No capô, lave os animais 3x com tampão PBS-Tween (pH 7,2).</li>
	<li>Ressuspenda os animais em 50-100 μl de PBS-Tween (pH 7,2). Os animais podem ser armazenados nesta fase a 4 °C durante algumas semanas.</li>
	<li>Colete os animais por centrifugação (3.000 rpm, 1-2 min) e remova a maior parte do tampão PBS-Tween.</li>
	<li>Adicione 100-150 μl de solução de colagenase a cada tubo e incube a 37 ° C com forte agitação (usando um misturador térmico ou uma incubadora agitada).</li>
	<li>Examine os animais frequentemente sob um estereomicroscópio, começando após 5 minutos de incubação. Quando 20% dos animais estiverem quebrados, pare a reação colocando o tubo no gelo. Esta etapa é altamente sensível! A duração do tratamento depende das condições de fixação e pode variar muito entre as cepas. Uma incubação prolongada pode resultar na degradação completa dos animais. As condições devem ser calibradas para cada lote de enzimas utilizado e a degradação deve ser cuidadosamente monitorizada.</li>
	<li>Lave os animais duas vezes em PBS-Tween (pH 7,2) e, em seguida, colete os animais por centrifugação (3.000 rpm, 1-2 min) e remova a maior parte do tampão PBS-Tween.</li>
	<li>Adicione 1 ml de solução de AbA (Tabela 2) e incube com balanço suave por 1 hora em temperatura ambiente. Os animais podem ser armazenados nesta fase a 4 °C durante algumas semanas.</li>
	<li>Coletar os animais por centrifugação (3.000 rpm, 1-2 min) e ressuspender em 200 μl AbA.</li>
	<li>Adicione o anticorpo primário diluído a 1:100-1:1.000 em solução de AbA e incube com balanço suave. A temperatura e a duração da incubação podem variar entre os anticorpos e devem ser calibradas para cada proteína examinada. Começamos com uma incubação noturna à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave os animais por centrifugação (3.000 rpm, 1-2 min).</li>
	<li>Adicione tampão AbA (1 ml) e incube com mistura suave por 15-60 min em temperatura ambiente. Os animais podem ser armazenados nesta fase a 4 °C durante algumas semanas.</li>
	<li>Opcional: A amostra também pode ser corada com corantes fluorescentes. Para fazer isso, adicione o corante (por exemplo, DAPI (2 mg / ml) ou Faloidina (1: 100)) a 200 μl AbA e incube com balanço suave por até 1 hora. Esta etapa pode ser realizada durante uma das etapas de lavagem do anticorpo secundário.</li>
	<li>Lave os animais 3x repetindo os passos 4.18-4.19.</li>
	<li>Adicionar 100 μl de AbA com o anticorpo secundário marcado com fluorescência adequado, diluído a 1:100.</li>
	<li>Mantenha as amostras cobertas (ou em um tubo escuro) e incube com balanço por várias horas em temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave os animais 3x incubando em tampão AbA (1 ml) com mistura suave por 15-60 min em temperatura ambiente, seguida de centrifugação (3.000 rpm, 1-2 min). Os animais podem ser armazenados nesta fase a 4 °C durante algumas semanas.</li>
	<li>Para montar animais em lâminas, remova todo o líquido e ressuspenda em 10 μl do mesmo tampão.</li>
	<li>Corte a extremidade da ponta da pipeta para evitar o corte dos animais e transfira 1-2 μl da amostra para uma lâmina.</li>
	<li>Adicione o meio de montagem na proporção de 1:1.</li>
	<li>Cubra a lâmina suavemente com uma lamínula e sele com esmalte. Se a lâmina não for monitorada imediatamente, ela pode ser armazenada a -20 °C por um período prolongado de tempo.</li>
</ol>
5. Monitore a localização de proteínas marcadas
<ol>
	<li>Na fase requerida, recolher pelo menos 15 animais para uma gota de 10 ml de tampão M9 numa lâmina.</li>
	<li>Usando um "picareta de minhoca", coloque os animais em uma gota de 10 ml de solução de paraformaldeído (4%) (Tabela 2) e espere até que todos os animais parem de se mover (aproximadamente 5 min).</li>
	<li>Usando um "picareta de minhoca", mova os animais para uma gota de 2 ml de tampão M9 e meio de montagem (1:1) (Tabela 2).</li>
	<li>Cubra suavemente os animais com uma lamínula e sele com esmalte.</li>
</ol>
Usando ensaios ex vivo para monitorar o dobramento e a estabilidade de proteínas
6. Digestão Parcial
<ol>
	<li>Lave os animais de 15 placas (60 mm) usando 1-2 ml de tampão M9 em um tubo de microcentrífuga. Observe que os animais não devem estar aglomerados e que deve haver comida suficiente durante toda a experiência.</li>
	<li>Lave os animais algumas vezes com tampão M9 centrifugando (3.000 rpm, 2 min) e ressuspendendo os animais.</li>
	<li>Após a centrifugação final, ressuspender os animais em tampão M9 de 100 μl.</li>
	<li>Congelamento rápido no líquido N2. As amostras podem ser armazenadas a -80 °C.</li>
	<li>Usando um pilão resfriado e uma broca motorizada (uma broca de cultura de tecidos portátil também pode ser usada), triture a amostra. Mantenha a amostra no gelo e evite o superaquecimento.</li>
	<li>Examine os animais frequentemente sob um estereomicroscópio para determinar se a moagem está completa. Se restarem animais intactos, repita o procedimento.</li>
	<li>Estime o volume pipetando o extrato do verme.</li>
	<li>Adicione a proporção de 1:1 de (2x) solução de lise de vermes (Tabela 3). Não use inibidores de protease de qualquer tipo.</li>
	<li>Incube no gelo por 15 min.</li>
	<li>Remover os detritos por centrifugação (1.000 x g durante 2 min) numa centrífuga pré-arrefecida (4 °C).</li>
	<li>Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo. As amostras podem ser usadas diretamente ou armazenadas a -80 °C.</li>
	<li>Preparar a solução de quimotripsina (Tabela 3) e manter no gelo até à utilização.</li>
	<li>Determine a concentração total de proteínas usando o ensaio de Bradford.</li>
	<li>Diluir a amostra, se necessário, de modo a que a concentração total de proteínas seja de 3-3,5 mg/ml.</li>
	<li>Adicione a solução de quimotripsina ao lisado de proteína total (1:1.200).</li>
	<li>Para determinar o tempo de incubação, incubar a amostra com quimotripsina durante 60 min. Remover alíquotas de 20 μl da amostra em diferentes momentos (por exemplo, 0, 5, 20, 40 e 60 min), misturar imediatamente com tampão de amostra SDS e ferver durante 5 min a 96 °C. *Em alternativa, incubar a amostra com diferentes concentrações de quimotripsina e parar a reação após um tempo específico, adicionando tampão de amostra SDS e fervendo durante 5 min a 96 °C.</li>
	<li>Execute amostras em um gel SDS-PAGE.</li>
	<li>Realize a análise de western blot usando anticorpos apropriados para determinar a estabilidade relativa da proteína.</li>
	<li>Determine as condições ideais (concentração de quimotripsina e tempo de digestão) que mostram mudanças significativas entre as amostras e use essas condições para experimentos futuros.</li>
	<li>Determine a intensidade de diferentes produtos de digestão (fragmentos de menor peso molecular) usando software de densitometria, como o módulo de gel de imagem do NIH.</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

As sondas da capacidade de proteostase celular devem ser altamente sensíveis a mudanças no ambiente de dobramento e ser facilmente monitoradas para fornecer avaliação em tempo real das capacidades de controle de qualidade de dobramento de proteínas. Usando proteínas metaestáveis como sondas da capacidade de proteostase, monitoramos mudanças no fenótipo, localização de proteínas subcelulares e conformação de proteínas. Os protocolos aqui apresentados enfocam os fenótipos associados à proteína muscular, incluindo motilidad...

A interação das várias etapas da biossíntese de proteínas, como transcrição, processamento e tradução de mRNA, bem como dobramento, translocação e montagem/desmontagem de proteínas, determina a carga de proteínas metaestáveis que dependem das máquinas de controle de qualidade de proteínas celulares para sua função1. A ausência ou mau funcionamento das máquinas de controle de qualidade de proteínas pode, portanto, resultar no declínio funcional de diversos tipos de máquinas celulares e no aparecimento de doenças de desdobramento de proteínas2-7. Quando a capacidade das máquinas de dobramento e depuração de proteínas é equilibrada com a carga de proteínas metaestáveis, a homeostase proteica (proteostase) é alcançada, um estado que, em última análise, impede o acúmulo de proteínas mal dobradas e a agregação dentro das células6. Acredita-se que o acúmulo de proteínas mal dobradas seja o sinal que ativa fatores de transcrição induzíveis por estresse, como o fator de choque térmico (HSF-1), e resulta na ativação de respostas citoprotetoras ao estresse6,8.
Nossa compreensão das funções das redes de proteostase em metazoários tem sido derivada principalmente de estudos de reconstituição in vitro e de observações feitas com células de cultura de tecidos e organismos unicelulares9. Por exemplo, a pesquisa sobre chaperonas moleculares que previnem e resolvem danos proteicos tem se concentrado em estudos bioquímicos e biológicos celulares dos mecanismos de dobramento, desagregação e translocação de proteínas mediadas por chaperonas10-13. Em comparação, apenas informações limitadas estão disponíveis sobre a função integrada de vários componentes de proteostase nas diferentes células e tecidos de metazoários sob condições de crescimento "normais" e em resposta ao estresse11. A descoberta de que, em C. elegans, o controle de qualidade da proteína celular também pode ser regulado de forma não autônoma celular, como refletido em experimentos que mostram que mutações nos dois neurônios que percebem a temperatura podem bloquear a ativação da resposta ao choque térmico e reduzir a termotolerância, demonstrou a necessidade de estudar a regulação da proteostase em organismos multicelulares14-17. O que está faltando, no entanto, é uma imagem coesa de como as redes de proteostase, como as várias famílias de chaperonas moleculares, funcionam nos tecidos de um metazoário intacto e quão dinâmicas são essas redes durante o desenvolvimento e o envelhecimento. Para atingir esse objetivo, sensores confiáveis para monitorar a manutenção do proteoma em animais vivos são necessários para determinar a capacidade proteostática de diferentes células em um organismo multicelular durante o curso do desenvolvimento e envelhecimento.
Para que uma determinada proteína funcione como um sensor de proteostase celular, ela deve responder a mudanças no ambiente de dobramento celular, interferindo apenas minimamente no dobramento de proteínas não relacionadas na célula. Para explorar a manutenção e recuperação da proteostase celular em um organismo vivo, duas abordagens complementares que dependem de sensores de dobramento podem ser adotadas. O primeiro se baseia em sensores de dobramento projetados, baseados em proteínas metaestáveis identificadas experimentalmente que são conhecidas por dependerem da maquinaria de proteostase, como a luciferase18-20 do vaga-lume ou a GFP marcada com um degron21-24. Na segunda abordagem, proteínas metaestáveis endógenas, como proteínas agregantes sensíveis à temperatura (ts) ou dependentes da idade que respondem a mudanças incrementais no ambiente celular, são rastreadas25-27. Os sensores dobráveis projetados não têm nenhuma função biológica essencial, mas oferecem a vantagem de serem detectáveis por poderosos ensaios de relatórios, como proteínas marcadas com GFP, e podem ser empregados com muitos modelos celulares e animais diferentes18. No entanto, como a introdução de uma única proteína estranha pode afetar o ambiente de dobramento27, esses polipeptídeos podem sobrecarregar a maquinaria da proteostase celular. Alternativamente, sensores de dobra projetados que não são nativos da célula sobre a qual relatam podem não ser afetados por mudanças na capacidade de proteostase da célula. Por exemplo, um substrato repórter de proteassoma marcado com GFP exigia que ~ 90% do proteassoma fosse inibido antes que um fenótipo pudesse ser detectado23. Em contraste, as proteínas metaestáveis endógenas que dependem das máquinas de proteostase da célula oferecem a vantagem de estar dentro da faixa de sensibilidade celular. No entanto, a perda de função associada ao dobramento incorreto de tais proteínas também pode afetar a função celular e a viabilidade do organismo. Aqui, vamos nos concentrar no uso de sensores de dobra endógenos de C. elegans.
C. elegans é um modelo de metazoário bem estabelecido para o estudo do desenvolvimento e do envelhecimento que utiliza muitas vias biológicas conservadas e pode ser usado para seguir o dobramento de proteínas na célula, usando uma combinação de biologia celular, abordagens bioquímicas e genéticas. Empregamos proteínas metaestáveis como sondas da capacidade proteostática, monitorando mudanças em seu fenótipo, localização e estabilidade. Além disso, uma variedade de funções proteicas pode ser estudada por uma simples análise comportamental. Da mesma forma, a má localização substancial de proteínas ocorre quando as redes de controle de qualidade de proteínas celulares não conseguem se ajustar às demandas celulares. As proteínas podem ser facilmente visualizadas em células de animais vivos usando proteínas marcadas com fluorescência ou por meio de imunocoloração. Finalmente, usando métodos ex vivo, é possível monitorar a expressão e a estabilidade da proteína. Isso permite a triagem rápida e simples de alterações comportamentais e fisiológicas, juntamente com uma análise aprofundada da localização e estabilidade da proteína, permitindo o monitoramento de modificadores de proteostase. Ao combinar esses diferentes métodos, uma visão ampla do ambiente de dobramento de proteínas de uma célula pode ser obtida. De fato, essa estratégia tem sido usada com sucesso para monitorar a perturbação da proteostase em C. elegans, leveduras, cultura de tecidos e bactérias15,25-35.

<table><tbody><tr><td>Posicionamento de anticorpos e fiaxtion</td><td>paraformaldeído</td><td>Merc</td><td>8187151000</td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>C5138-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merc</td><td>8034560100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>&beta; -ME</td><td>Sigma</td><td>8057400250</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Di Cam</td><td>000-40-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Resumo parcial&nbsp;</td><td>Quimotripsina</td><td>Sigma</td><td>C4129-250MG</td></tr><tr><td>Termo-resistência</td><td>SYTOX Laranja</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Amaresco</td><td>0433-250G</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPAMENTO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M165 FC estereoscópio fluorescente</td><td>Leica</td><td></td><td>TXR filtro</td></tr><tr><td>EXi Câmera de Microscopia de Fluorescência Azul</td><td>QImaging</td><td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal ConfoCor 3/510 META</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pellet pestles</td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Pellet Pestle Motor sem fio</td><td>Kontes</td><td>K749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17 Microcentrifuge Series</td><td>Thermo</td><td>75002455</td><td>Refrigerado, , 230 V 50/60 Hz, inclui 24x rotor de 1,5/2,0 ml com Tampa de Biocontenção ClickSeal</td></tr></tbody></table>

usando caenorhabditis elegans como um sistema modelo para estudar a homeostase de proteínas em um organismo multicelular

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

O dobramento e a montagem de proteínas são essenciais para a função da proteína, a saúde a longo prazo da célula e a longevidade do organismo. Historicamente, a função e a regulação do enovelamento de proteínas foram estudadas in vitro, em células isoladas de cultura de tecidos e em organismos unicelulares. Estudos recentes descobriram ligações entre homeostase proteóstase (proteostase), metabolismo, desenvolvimento, envelhecimento e detecção de temperatura. Essas descobertas levaram ao desenvolvimento de novas ferramentas para monitorar o dobramento de proteínas no organismo metazoário modelo Caenorhabditis elegans. Em nosso laboratório, combinamos ensaios comportamentais, imagens e abordagens bioquímicas usando proteínas metaestáveis sensíveis à temperatura ou de ocorrência natural como sensores do ambiente de dobramento para monitorar o dobramento incorreto de proteínas. Os ensaios comportamentais associados ao dobramento incorreto de uma proteína específica fornecem uma leitura simples e poderosa do dobramento de proteínas, permitindo a triagem rápida de genes e condições que modulam o dobramento. Da mesma forma, esse dobramento incorreto pode estar associado à localização incorreta de proteínas na célula. O monitoramento da localização de proteínas pode, portanto, destacar mudanças na capacidade de dobramento celular que ocorrem em diferentes tecidos, em vários estágios de desenvolvimento e diante de mudanças nas condições. Finalmente, usando ferramentas bioquímicas ex vivo, podemos monitorar diretamente a estabilidade e a conformação das proteínas. Assim, combinando ensaios comportamentais, técnicas de imagem e bioquímicas, somos capazes de monitorar o desdobramento de proteínas na resolução do organismo, da célula e da proteína, respectivamente.

Um ambiente de dobramento comprometido pode levar ao mau dobramento e agregação de proteínas. O mau dobramento proteico está associado a alterações na conformação e resulta em perda da função proteica. Utilizamos abordagens complementares para monitorar o dobramento e a função proteica em animais inteiros, células específicas e extratos proteicos. Uma escolha inteligente de sensores de dobramento, baseada em fenótipos comportamentais e celulares fortes associados a uma mutação desestabilizadora conhecida, pode então ser ...

Para estudar a relação entre homeostase proteica, estresse e envelhecimento, monitoramos as mudanças no dobramento proteico acompanhando a disfunção proteica, a localização da proteína na célula e a estabilidade proteica nos níveis organismo, celular e proteico, usando o metazoário geneticamente tratável Caenorhabditis elegans como sistema modelo.

Usando Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para estudar a homeostase de proteínas em um organismo multicelular

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

O objetivo geral dos experimentos a seguir no metazoário geneticamente tratável CENO R elegance é monitorar o desdobramento de proteínas em três níveis, o organismo, as células e as proteínas. Fenótipos comportamentais, como motilidade ou termorresistência, funcionam como leituras de mudanças na homeostase proteica no nível do organismo, sensíveis à temperatura ou que ocorrem naturalmente. Proteínas metaestáveis são usadas para seguir a localização incorreta da proteína, que pode estar associada ao dobramento incorreto da proteína.Um ensaio de digestão parcial ex vivo monitora diretamente a estabilidade da proteína. Os resultados podem mostrar mudanças na capacidade de proteostase em diferentes temperaturas de cultivo com base no ensaio de termorresistência, microscopia de imunofluorescência e análise de sangue ocidental. Esses procedimentos serão demonstrados por alunos de pós-graduação em meu laboratório.O ensaio comportamental será demonstrado por ish ido e Shai demonstrará a coloração imunológica e reprovação de ANA e sheron demonstrará a digestão parcial. Este protocolo para medir a tolerância à temperatura é acompanhado por etapas preparatórias para sincronizar os animais e um ensaio de movimento. Ambos são descritos no protocolo de texto começam com a coleta de réplicas contendo pelo menos 20 animais sincronizados.Em 24, poços bem jogados contendo 450 microlitros de amortecedor de choque térmico. Suplementar cada poço com nove microlitros de citoxina. Agora transfira o prato para um banho aquecido.O choque térmico, a temperatura e a duração dependem fortemente das condições de crescimento. Em particular, a temperatura de cultivo pontua a sobrevivência do animal monitorando sua absorção de matriz. Usando um estereoscópio fluorescente com um filtro TXR, os animais que pegam a matriz estão mortos.A principal vantagem desta técnica dos métodos existentes como o kine, a tolerância por pontuação manual é o uso da leitura visual da mortalidade dos animais, o que torna este ensaio muito mais rápido e reprodutível. Na fase requerida, transferir pelo menos 30 animais para um tubo de microcentrífuga contendo tampão M nove. Lavar os animais algumas vezes com M nove, executando etapas de centrifugação curtas e de baixa velocidade e suspendendo-os em M nove.Em seguida, coloque os tubos no gelo por alguns minutos para esfriar. Depois de resfriado, remova o excesso de líquido e incube os tubos. Em 500 microlitros de gelado, 4%PARAFORM aldeído.O tempo de incubação precisa ser calibrado para cada proteína examinada e deve ser de cerca de cinco a 30 minutos à temperatura ambiente. Agora, lave os animais fixos três vezes com PBS tween em pH 7,2 por centrifugação. As centrifugações são sempre realizadas a 3000 RPM por um ou dois minutos, a menos que especificado de outra forma.No exaustor, remover a maior parte do sobrenadante e ressuspender o pellet em um mililitro de solução de mercaptoetanol de feixe. Em seguida, incube os animais a 37 graus Celsius durante a noite com um balanço suave no dia seguinte no capô. Lavar os animais três vezes com PBST por centrifugação e Resus.Finalize a lavagem com 50 a 100 microlitros de PBST e remova a maior parte deste PBST após outra centrifugação. Em seguida, adicione 100 a 150 microlitros de solução de colagenase e incube os animais a 37 graus Celsius com forte agitação. Use um misturador térmico ou uma incubadora agitada.Após cinco minutos, comece a fazer verificações periódicas sob um microscópio estéreo. Quando um quinto dos animais estiver quebrado, pare a reação colocando o tubo no gelo. Esta etapa é altamente sensível.A duração do tratamento depende das condições de fixação e pode variar muito entre as cepas. Uma incubação prolongada pode resultar na degradação completa dos animais. As condições devem ser calibradas antes de cada lote de enzimas e a degradação deve ser cuidadosamente monitorizada.Em seguida, lave os animais duas vezes em PBST. Recolha os animais por centrifugação e remova a maior parte do PBST. Em seguida, adicione um mililitro de uma solução BA seguida de incubação com balanço suave por uma hora em temperatura ambiente, colete os animais por centrifugação e ressuspenda-os em 200 microlitros de b, A. Agora adicione o anticorpo primário e comece uma incubação durante a noite com balanço suave à temperatura ambiente.Esses parâmetros precisam ser calibrados. Em seguida, lave os animais por centrifugação. Ressuspenda-os em um mililitro de b, A e incube-os com uma mistura suave por 15 minutos a uma hora em temperatura ambiente.Neste ponto, uma adição opcional de corante fluorescente pode ser adicionada. Em seguida, repita a lavagem tampão BA mais três vezes e termine as lavagens suspendendo em 100 microlitros de um BA com o anticorpo secundário marcado com fluorescência apropriado em uma diluição de um a 100. Incubar as amostras com balanço por várias horas em temperatura ambiente protegida da luz para limpar o secundário.Faça três lavagens com a, b, a. Em seguida, monte os animais nas lâminas primeiro com Resus, suspendendo-os em 10 microlitros de b, a e, em seguida, usando uma pipeta de diâmetro largo para transferir um ou dois microlitros da amostra para cada lâmina, adicione um volume igual de meio de montagem e cubra a lâmina. Sele suavemente a lâmina com esmalte.As lâminas podem ser armazenadas a 20 graus Celsius negativos por períodos prolongados. Geralmente, os indivíduos novos neste protocolo terão dificuldades porque o protocolo é longo e inclui muitas etapas que podem afetar sua eficiência, dificultando a solução de problemas. Comece coletando os animais de placas de cerca de 1560 milímetros em um ou dois mililitros de tampão M nove.Os animais não devem estar superlotados. Lavar os animais algumas vezes com tampão M nove, centrifugando e suspendendo os animais. Após a rotação final, resus suspende os animais em 100 microlitros de tampão M nove.Em seguida, congele rapidamente os animais e, usando um pilão resfriado e uma broca, triture a amostra enquanto estiver no gelo. Freqüentemente pausado para verificar se os animais estão suficientemente moídos. Assim que os animais estiverem totalmente esmagados, estime o volume do extrato do verme.Em seguida, adicione um volume igual de duas soluções de lise de vermes e incube a amostra no gelo por 15 minutos. Em seguida, remova os detritos por um ciclo de centrifugação resfriado e transfira o sobrenadante para um tubo de microfuga limpo. Após um ensaio de Bradford, diluir a amostra para três a 3,5 miligramas de proteína por mililitro.Em seguida, adicione a solução de tripsina de camuflagem gelada recém-preparada na proporção de um para 1200. Neste ponto, defina a amostra para incubar por uma hora. Durante a incubação, pegue periodicamente alíquotas de 20 microlitros e misture-as imediatamente com tampão SDS, seguido de cinco minutos a 96 graus Celsius.Execute as amostras e siga com uma análise de sangue ocidental para determinar a estabilidade relativa da proteína. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não adicionar coquetel inibidor de protease à amostra de digestão e, em vez disso, manteremos as amostras rapidamente no gelo. A mutação E 781 K ts na chaperona muscular em 45 afeta fortemente o dobramento e a montagem da miosina e, portanto, afeta a motilidade animal.Quando esses mutantes foram cultivados em temperaturas acima de 20 graus Celsius, eles ficaram completamente paralisados, mas não a 15 graus Celsius. Quando animais selvagens criados a 25 graus Celsius foram submetidos a um choque térmico prolongado, a maioria sobreviveu. Enquanto apenas 30% sobreviveram se elevados a 15 a 20 graus Celsius para monitorar os modificadores efetivos na resposta ao choque térmico, as condições de estresse de controle foram elevadas para uma taxa de sobrevivência de 70% para animais selvagens.Os animais foram expostos a um choque térmico de 37 graus Celsius por seis horas. No primeiro dia da idade adulta, a sobrevivência foi testada pelo ensaio de captação de laranja cyt. Os animais mortos são indicados por setas brancas e os animais vivos por setas amarelas.A localização de várias proteínas metaestáveis foi visualizada usando anticorpos específicos. Por exemplo, a paramina é localizada em conjuntos policristalinos em vez de no sarcômero muscular sob condições restritivas. Da mesma forma, a miosina TS forma filamentos desorganizados em vez das estruturas filamentosas altamente ordenadas na temperatura restritiva.Animais expressando várias proteínas mutantes TS co-expressas com myo três. A GFP mostrou uma rápida deterioração na organização do miofilamento, conforme detectado pelo monitoramento das alterações da GFP na confirmação da miosina que podem refletir mudanças na capacidade de dobramento das células musculares. O padrão de fragmentação proteolítica da cadeia pesada da miosina, co-expresso com UNC 45 Ts, mostra características distintas em comparação com o perfil de digestão da miosina de animais selvagens, apoiando a afirmação de que o dobramento da miosina é afetado pelo UNC 45.Perda de função. Embora este método possa fornecer informações sobre a regulação da proteostase na elegância do mar, ele também pode ser aplicado em outros sistemas, como diferentes organismos modelo.

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