Name: High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-21T21:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Aprenda microinjeção de alta vazão em zigotos de ouriço-do-mar para estudar expressão de RNA e proteínas em embriões. Este método permite análise eficiente do desenvolvimento embrionário em biologia do desenvolvimento.

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Agradecemos Santiago Suarez para a leitura crítica do manuscrito e Betty Cowgill de ajuda em fotografia. Agradecemos também aos revisores anônimos por seus comentários críticos. Este trabalho é suportada pela University of Delaware Research Fund.

1. Preparação de sulfato de protamina (PS) Pratos revestidos <ol><li> Preparar a solução de 1% de sulfato de protamina (PS) por adição de 0,5 g de PS em 50 ml de água destilada e desionizada (ddH2O) em um tubo de 50 ml. Agitar bem a alta velocidade num misturador de bancada à temperatura ambiente durante 1-2 horas para garantir a dissolução completa do PS. Esta solução pode ser guardada a 4 ° C durante pelo menos 3 meses (certifique-se dissolver completamente precipitado do tipo gel, antes de cada utilização) 3. </li><li> Dê uma manga de 60 mm x 15 mm de poliestireno placas de Petri e colocar para fora as duas tampas e fundos no banco. </li><li> Despeje solução PS 1% em cada prato (ambos os fundos e as tampas podem ser usados) apenas o suficiente para cobrir a superfície, deixe por pelo menos 2 min. A solução residual PS pode ser reutilizado muitas vezes dentro de 3 meses, quando armazenada a 4 ° C. </li><li> Local PS-tratados pratos num copo cheio de água destilada (dH2O). Deixe o copo sob execução dH 2 O, pelo menos,10 min. </li><li> Pratos PS-revestidos podem ser utilizados imediatamente ou ar seco para o armazenamento. Cubra-os para evitar o acúmulo de poeira. Eles podem ser armazenados à temperatura ambiente por 1 mês 3. </li></ol> 2. Obter Sea Urchin Gametas e imobilizar os ovos em um prato PS-revestido para microinjeção <ol><li> Ouriços do mar de Spawn por agitação ou injecção intracoelomática de até 1 ml de 0,5% de KCl para induzir a contracção da musculatura lisa para libertar gâmetas 3 (Figura 2). </li><li> Se o animal é um macho, como indicado pela cor branca de esperma, recolher seco esperma a partir da superfície de um animal para um tubo de 1,5 ml. Esperma seco pode ser armazenado a 4 ° C durante uma semana sem perda significativa da função biológica. </li><li> Se o animal é uma fêmea, como indicado pela cor amarela devido ao teor de gema de ovo, recolher os seus gâmetas por imersão dos gonopores num copo cheio de água do mar. Os ovos serão liberados a partir de gonopores e estabelecer-se pela gravidade. &lt;/ Li&gt; <li> Filtrar os ovos de detritos, como espinhos animais usando 80 um filtro de malha de nylon. Os melhores resultados são obtidos se os ovos são utilizados dentro de 5-7 h após a desova. </li><li> Dejelly os ovos: <ol><li> Preparar 100 ml de água do mar ácida para cerca de 1 ml de ovo. Use ácido cítrico 0,5 M para ajustar o pH da água do mar a partir de pH 8,0 para 5,1-5,2. Muito baixo de um pH diminuirá fertilização e muito alto de um pH não vai permitir que os ovos para anexar as placas revestidas PS. </li><li> Adicione os ovos (não mais do que 1 ml) de água do mar ácida e permitir que os ovos para assentar sobre gelo durante 10 min. Alternativamente, a remoção do revestimento de gelatina pode ser facilitada por agitação suave do que os ovos durante o tratamento. Pode-se efetivamente dejelly ovos de S. purpuratus em 3-4 min desta forma. </li><li> Com cuidado, despeje a água do mar ácida, adicione a água fresca do mar e deixar que os ovos se estabelecer no gelo novamente. Ovos Dejellied pode ser armazenado em gelo durante até 6 horas sem problemas de fertilização </li></ol></li&gt; </ol> 3. Linha do Eggs <ol><li> Prepare uma solução de estoque de M 3-aminotriazole (3-AT, PM = 84,08) através da dissolução de 0,84 g de 3-AT, em 10 ml de ddH 2 O. Esta solução pode ser guardada a 4 ° C durante até 6 meses. </li><li> Preparar uma solução de trabalho mM de 3-AT por adição de 50 ul de uma solução de estoque M a 50 ml de água do mar previamente arrefecido. Manter a solução em gelo. </li><li> Prepare pipeta boca (Figura 3) para manuseio suave dos ovos: <ol><li> Ponteira é puxado manualmente a partir de micropipetas de vidro (100 x 1,09 milímetros OD). Segure a micropipeta com ambas as mãos sobre a chama aberta. Como o vidro começa a derreter, puxar cuidadosamente as pontas da pipeta em direcções opostas. </li><li> Conecte uma puxada pipeta a um tubo de plástico (ID 1,14 milímetros), o selo apertado com Parafilm. O comprimento do tubo deve ser de aproximadamente de 50-70 cm. </li><li> Insira uma P20 ou P200 ponta filtrada estéril no fim do tubo oposto ao tubo de vidro deser utilizado como parte de boca. </li><li> Clipe da ponta da micropipeta de vidro com uma tesoura para ajustar o diâmetro da ponta. O diâmetro óptimo excede ligeiramente o diâmetro do ovo (80 mM). </li></ol></li><li> Despeje 4 ml de 1 mM de 3-AT água do mar em cada prato PS-revestido (em baixo ou tampa). </li><li> Tome a pipeta boca, coloque a ponta P20/P200 na boca e prenda-o com os dentes. Para aspirar ovos, primeiro aspirar uma pequena quantidade de água do mar. Por ter uma coluna de líquido antes de carregar os ovos, uma terá máximo controle sobre a técnica de pipetagem boca. </li><li> Posicione a ponta da micropipeta perto dos ovos e aspirar suavemente em várias centenas de ovos na pipeta. Confinar os ovos dentro da micropipeta de vidro. </li><li> Row dejellied ovos em uma linha reta em um prato suavemente soprando-los para fora da pipeta boca enquanto se move a ponta em uma linha reta. Linha dos ovos imediatamente antes das injeções, porque os problemas de fertilização pode ocorrer devido ao prolonged exposição a 3-AT água do mar 3. Além disso, os adesivos catiónicos como o PS pode ser tóxico para ovos, e que não é aconselhável para expor embriões destes reagentes por longos períodos, especialmente se os envelopes de fertilização ter sido removido. </li><li> Faça um arranhão no prato perto da linha de ovos remado usando uma pipeta de vidro. Este zero será importante para quebrar a agulha de injecção para ajustar o fluxo de solução, conforme necessário. Alternativamente, o zero pode ser feita antes de derramar 3-AT água do mar para o prato. </li></ol> 4. Microinjeção do Mar Urchin zigotos <ol><li> Ligue estação de microinjeção. Aqui nós descrevemos o uso de sistema de injeção FemtoJet. </li><li> Puxe capilares injeção usando um extrator de agulha. Um exemplo de um bom agulha está representado na Figura 4. Nota: Para injeções de RNA, os capilares de injeção devem ser pré-tratados para evitar a contaminação RNAase 31: <ol><li> Coloque capilares de injeção em 50 ml cônicotubos e adicionar 50 ml de metanol / HCl filtrada (9:1). Agite bem e deixe durante a noite para não mais do que 10 horas. </li><li> Decantar o metanol / HCl e enxaguar os capilares 2x com metanol filtrada no mesmo tubo. </li><li> Drenar o metanol, tanto quanto possível, e liofilizar de capilares durante a noite para assegurar a remoção completa do metanol. </li></ol></li><li> Monte cuidadosamente o capilar agulha em um suporte de agulha carga e carregá-lo com &lt;0,5 mL de uma solução de amostra usando dicas Microloader. As soluções de amostra normalmente contêm 20% de glicerol, de acordo com o material injectado 3. </li><li> Coloque o prato com ovos remavam no palco microscópio (ovos devem estar alinhados verticalmente quando visto através oculares) e concentrar-se nos ovos. </li><li> Cuidadosamente montar a agulha carregada no suporte de agulha microinjecção e ajustar a posição da agulha ter uma ponta perfeitamente centrada no meio do campo. </li><li> Pressione o botão para aplicar a pressão máxima for limpeza da agulha. Solução deve sair da agulha. Regule a pressão, se necessário: a pressão de injecção deve estar no intervalo de 90-360 hPa, com a pressão de compensação de cerca de 1/3 da pressão de injecção. </li><li> Ajuste o fluxo da solução através da injeção em óvulo não fertilizado. Usando um micromanipulador joystick, direcionar a ponta da agulha de injeção para o óvulo não fertilizado. Para facilitar a entrada da agulha, criar um ligeiro tremor agitando ligeiramente do palco com um objeto duro, como uma chave de fenda. Uma injecção de bolus formando dentro do ovo deve ser visto (Figura 5). </li><li> Se o bolo de injecção não é visível, aumentar ligeiramente a ponta da agulha acima dos ovos, localizar a zero no prato e ajustá-lo para ser posicionado no meio do campo. Bata levemente a ponta da agulha para a marca zero para quebrar a ponta da agulha de injeção. Ajustar as pressões de injecção e de compensação para assegurar que o bólus não exceder 1/5 do tele diâmetro do ovo (1-2 horas). </li><li> Uma vez que a injecção de bolus é calibrado, fertilizar os ovos por adição de esperma diluído (1:1000) ou 1-2 ul de esperma. Misture bem com cuidado para evitar a retirada da linha de ovos. </li><li> Iniciar injecções imediatamente após a fertilização do envelope torna-se visível (Figura 5). Mover ao longo da linha de ovos remavam usando o controlador de palco e injetar tantos zigotos possível, cutucando-os com a agulha controlado por joystick micromanipulador. </li><li> Depois de 10-15 minutos, os ovos recentemente fertilizados se tornará endurecido e não pode ser injectado mais. Retire o prato do palco e aspirar cuidadosamente para fora o esperma em 3-AT água do mar usando uma pipeta Pasteur de plástico. </li><li> Não deixe que os zigotos seco. Adicione rapidamente a água prechilled fresco do mar para cobrir o prato. Incubar os embriões a 15 ° C. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não competindo interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.

A microinjecção é uma técnica poderosa para entregar vários tratamentos, tais como o ADN, ARNm, proteínas recombinantes, perda de função e ganho de reagentes funcionais, corantes e as suas combinações em ovos, embriões, e as células de vários organismos 1-7. No entanto, várias considerações devem ser mantidos em mente ao projetar um experimento de microinjeção. É criticamente importante considerar a solubilidade do tratamento entregue e o volume de injecção. Se a solução microinje...

Entrega eficiente e reprodutível tratamento é um dos principais desafios metodológicos para os investigadores. Vários métodos têm sido estabelecidos para entregar transitoriamente soluções de tratamento para os ovos, embriões e células. Estes métodos incluem electroporação (com base em um gerando poros transientes na membrana utilizando impulsos eléctricos curtos) 1,2, lipofecção (entrega através da fusão de lipossomas contendo de tratamento com a membrana) 1, bombardeamento com micropartículas 1 (ADN é precipitado na mícron partículas de dimensão de metal que são, então, utilizadas para penetrar as células a alta velocidade), e transdução (vírus é utilizado como um veículo de entrega de transgenes). No momento, a microinjecção é a única abordagem que tem a vantagem de fornecer uma solução com uma eficiência de 100%, com o mínimo de reagentes. Além disso, uma única solução para injecção pode ser composto por um complexo coquetel de tratamentos. Esta técnica tem sido utilizada para o sucessoly microinject os ovos e embriões de várias espécies, como ouriços do mar, 3,4 zebra peixe 5, 6 rato, sapo 7 e 8 de gado, bem como as células individuais na cultura de tecidos 9. Blastômeros Solteiro injeções em fases posteriores de desenvolvimento também foram realizados 10-12. Os métodos atuais de microinjeções são baseados no método de pressão de injeção, que foi inicialmente descrita por Hiramoto 10, no entanto, grandes progressos foram feitos no sentido de otimização deste processo. Técnicas de microinjeção Excelentes foram descritos em outro 11, e aqui nós descrevemos um dos métodos específicos que atualmente é usado para microinject ouriço do mar (Strongylocentrotus purpuratus) ovos recém-fertilizados. Por mais de um século, ouriços do mar têm sido um valioso modelo experimental 15,16. Ouriços do mar são evolutivamente intimamente relacionado com cordados (incluindo nós) e análise deseu genoma revelou que contêm todas as principais famílias de genes como o 17 humana. Eles produzem um grande número de embriões em desenvolvimento sincronicamente transparentes que podem ser facilmente manipuladas. Usando ouriço do mar como um organismo modelo, a comunidade ouriço do mar tem contribuído para o nosso entendimento do processo de fertilização 18-21, processos biológicos celulares 22-24, e as redes de regulação gênicas (GRNs) 25-28. Microinjeção em zigotos ouriço-do-mar requer várias etapas. Em primeiro lugar, os ovos devem ser imobilizada antes das injecções (descrito abaixo). Pratos de micro-injecção são revestidas com sulfato de protamina (PS), que cria uma superfície positivamente carregada a que os ovos carregados negativamente podem aderir 3. Os ovos são dejellied por incubação em água do mar acidificada (pH 5,15) durante 10 min, seguido por duas lavagens em água do mar natural ou de água do mar artificial (pH 8,0). Os ovos são cuidadosamente dejellied remou em uma linha retano meio do prato de PS-revestido na presença de 1 mM de 3-aminotriazole (3-AT), que é necessária para inibir a actividade da ovoperoxidase, que é segregada a partir dos grânulos corticais do ovo como um resultado de fertilização 29. Esta etapa é importante para prevenir o endurecimento do invólucro de fertilização e de facilitar a entrada da agulha de microinjecção. Como uma alternativa para 1 mM de 3-AT, 10 mM de ácido paraminobenzoic (PABA) pode ser utilizado. A solução injectável é carregado para uma agulha de microinjecção utilizando ponta microloading pipeta especializado e montado sobre um suporte ligado a micromanipulador e da unidade de pressão (Figura 1). Cada agulha pode ser usado para microinject zigotos individuais em várias experiências em dias separados. Microinjecção pode ser realizada durante 10-15 minutos, até os zigotos endurecer. Os zigotos foram então lavadas com a água do mar e cultivadas a 15 ° C. Quando os embriões atingem incubação blastula fase, eles liberam enzimas incubação que digere componentes da fertilization envelope 30 e permitir-lhes retirar naturalmente a partir do prato de PS-revestido. Se necessário, os embriões podem ser suavemente separado do prato usando uma pipeta de boca ou pipeta Pasteur soprando suavemente por água do mar para os embriões. O método descrito permite a microinjecção eficiente e fiável de 100-400 ovos recentemente fertilizados num prato único, fornecendo um método de alto rendimento para a análise a jusante.

<table><tbody><tr><td>Pipetas Glass Pasteur</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio invertido&nbsp; Axiovert 40 &deg; C</td><td>Zeiss</td><td>4109431007990000</td><td>Microscópio de injeção</td></tr><tr><td>Pontas de microcarregador</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td>Solução de injeção de carga</td></tr><tr><td>Malha de filtro de nylon 80&nbsp; &mu; m</td><td>Amazon.com</td><td>03-80-37</td><td>Filtre os ovos para se livrar dos detritos</td></tr><tr><td>P20 ou P200 Pontas de pipeta de barreira de aerossol</td><td>Fisher Scientific</td><td>02707432 ou 02707430</td><td>Parte de uma pipeta bucal</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13 374 12</td><td>Parte de uma pipeta bucal</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>Intramedic</td><td>PE-160</td><td>Parte de uma pipeta bucal</td></tr><tr><td>Sulfato de protamina</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>194729</td><td>Anexar ovos gelatinosos a pratos de injeção</td></tr><tr><td>Ouriços-do-mar S. purpuratus</td><td>Pt. Laboratório de Invertebrados Marinhos Loma</td><td>N/A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Água do mar</td><td>qualquer loja de animais</td><td>Instant Ocean</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri de poliestireno estéril 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td>Placas de injeção</td></tr><tr><td>Micromanipulador de posicionamento grosso de três eixos MMN-1</td><td>Narishige</td><td>9124</td><td>Manipular agulha de injeção</td></tr><tr><td>Micromanipulador fino hidráulico de óleo tipo joystick de três eixos MMO-202ND</td><td>Narishige</td><td>9212</td><td>Manipular agulha de injeção</td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Extrator de agulhas vertical&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>Puxe as agulhas de injeção</td></tr></tbody></table>

high throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjecção de células e de embriões é uma técnica comum que é usado para o estudo de uma ampla gama de processos biológicos. Neste método, uma pequena quantidade de solução de tratamento é colocado numa agulha de microinjecção que é utilizado para injectar células imobilizadas fisicamente ou embriões individuais. Apesar da necessidade de formação inicial para realizar esse procedimento para entrega de alto rendimento, a microinjeção oferece o máximo de eficiência e entrega reprodutível de uma ampla variedade de soluções de tratamento (incluindo misturas complexas de amostras) em células, ovos ou embriões. Aplicações para microinjeções incluem entrega de construções de DNA, mRNAs, proteínas recombinantes, ganho de função e perda de reagentes de função. Corante fluorescente ou colorimétrica é adicionado à solução injectada para permitir a visualização instantânea de entrega eficiente, bem como uma ferramenta para a normalização fiável da quantidade de solução apresentadas. O método descrito permite microinjeção de 100-400 mar ouriço-do-zygotes dentro de 10-15 minutos.

GFP e mCherry construções repórter foi transcrito in vitro e microinjectado em ovos recentemente fertilizados. Os embriões foram incubados a 15 ° C durante 24 horas (até a fase de blástula) e fotografada usando Zeiss Observador Z1 microscópio. Injecção de construções repórter não conduziu a quaisquer defeitos do desenvolvimento (Figura 6). Para a quantificação dos sinais fluorescentes, a aquisição de imagem foi realizada a baixa ampliação (100X) para capturar maximamente pixels fluorescentes <s...

A microinjecção é uma técnica comum usada para fornecer estruturas de ADN, ARNm, oligonucleidos morfolino anti-sentido ou outros tratamentos em ovos, embriões, e as células de várias espécies.

High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar microinjeções de alto rendimento de zigotos de ouriços-do-mar. Para fazer isso, a desova é induzida nos ouriços-do-mar e os gametas masculinos e femininos são coletados. Os ovos são então feitos com água do mar ácida e imobilizados em uma fileira em placas de Petri.O esperma é então adicionado aos óvulos para fertilizá-los e a microinjeção da perda de função, reagentes ou proteínas desejada do Mr.N.A é realizada após a microinjeção. Os três espermatozóides contendo água A T são trocados por água do mar doce. Esses embriões podem ser examinados quanto à sua morfologia e à expressão temporal e espacial de RNA e proteínas específicas.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como eletroporação, perfeição labial, micropartícula, bombardeio e transdução, é que ela permite a entrega de qualquer solução com 100% de eficiência usando o mínimo de reagentes. Este método permite uma microinjeção eficiente e confiável de 100 a 400 x em um único prato de milhares de X por experimento, fornecendo um método de alto rendimento para análise a jusante. Antes de realizar este experimento, prepare todas as soluções de estoque e equipamentos necessários.Consulte o documento que acompanha as receitas, será necessária uma pipeta bucal para o manuseio suave dos ovos. Para preparar um, comece segurando uma micropipeta de vidro com as duas mãos sobre uma chama aberta quando o vidro começar a derreter, puxe cuidadosamente as extremidades da pipeta em direções opostas até que a pipeta se separe em duas metades. Em seguida, conecte uma pipeta puxada a um tubo de plástico de 50 a 70 centímetros de comprimento.Aplique paraforma para criar uma vedação hermética. Insira uma ponta filtrada estéril P 20 ou P 200 na outra extremidade do tubo para uso como bocal, finalmente, prenda a extremidade da micropipeta de vidro com uma tesoura para ajustar o diâmetro da ponta, o diâmetro ideal excederá ligeiramente o diâmetro do ovo, que é de aproximadamente 80 micrômetros. Em seguida, prepare pratos revestidos com sulfato de protamina.Disponha placas de Petri de poliestireno de 2060 milímetros por 15 milímetros na bancada e remova as tampas dos pratos. Estes também serão usados como pratos é despejado 1% solução de sulfato de protamina a seguir, referido como solução PS em cada prato. Adicione apenas o suficiente para cobrir a superfície e incube por pelo menos dois minutos após a incubação.Remova a solução PS e guarde-a para uso posterior. A solução PS restante pode ser reutilizada muitas vezes em três meses quando armazenada a quatro graus Celsius. Coloque os pratos tratados com PS em um copo cheio de água destilada.Em seguida, colocar o copo em água destilada corrente durante, pelo menos, 10 minutos. Os pratos revestidos com PS podem ser usados imediatamente ou secos ao ar para armazenamento. Cubra-os para evitar o acúmulo de poeira.Eles podem ser armazenados em temperatura ambiente por até um mês. Para fabricar capilares de injeção, use um extrator de agulha. As configurações do extrator de agulha precisam ser determinadas empiricamente conforme declarado no manuscrito.Para desovar o ouriço-do-mar, retire um animal do tanque usando uma rede e coloque-o sobre uma toalha de papel. Em seguida, pegue o animal e segure-o com força. Agite-o.Como alternativa, execute uma injeção êmica da seguinte maneira. Depois de remover um animal do tanque, segure-o em uma das mãos e use uma agulha de calibre 20 conectada a uma seringa de 10 mililitros para injetar um mililitro de cloreto de potássio 0,5 molar na membrana perial, a única parte mole do animal. Após um a 10 minutos, o sexo do animal se tornará aparente.Os machos começarão a liberar espermatozóides brancos e as fêmeas começarão a liberar óvulos amarelos. Se o animal for macho, colete o esperma seco da superfície do animal usando uma pipeta para transferi-lo para um tubo de 1,5 mililitro. O esperma seco pode ser armazenado a quatro graus Celsius por uma semana sem perda significativa da função biológica.Se o animal for uma fêmea, mergulhe os poros do gno em um copo cheio de água do mar para coletar suas carnes de ga. Os ovos liberados dos poros do gno se estabelecerão por gravidade. Após a desova, filtre os ovos de detritos, como espinhos de animais, despejando a água do mar contendo os ovos.Através de uma malha de filtro de nylon de 80 mícrons em um béquer limpo no gelo. Para descompactar os ovos, transfira até um mililitro de ovos para 100 mililitros de água do mar ácida em um copo de plástico, agite suavemente os ovos e deixe-os assentar no gelo por 10 minutos. Após o tratamento, despeje cuidadosamente a água do mar ácida.Em seguida, adicione água fresca do mar e deixe os ovos assentarem no gelo. Outra vez. Os ovos gelatinosos podem ser armazenados no gelo por até seis horas sem afetar a fertilização. Imediatamente antes de realizar micro injeções, despeje três a quatro mililitros de um milimolar, três a TC de água em cada prato revestido com PS.O X deve ser todo o tipo antes da hospitalização da injeção O problema pode ocorrer se houver uma exposição prolongada a três 80 c de água a mais ou adesivos onic, como o sulfato de proteína, pode ser tóxico para o X.So tempo de exposição deve ser vinculado, especialmente se o animal de fertilização tiver sido removido. Prenda a ponta da pipeta bucal com os dentes e aspire uma pequena quantidade de água do mar. Isso aumentará o controle sobre os óvulos quando eles forem aspirados.Em seguida, posicione a ponta da micropipeta perto dos ovos e aspire suavemente várias centenas de ovos, confinando-os dentro da micropipeta de vidro. Em seguida, enquanto move a ponta em linha reta, sopre-os suavemente para fora da pipeta para o prato para formar uma fileira. Usando uma pipeta de vidro, faça um arranhão no prato perto da linha de ovos da estrada.Este arranhão pode ser usado posteriormente para quebrar a agulha de injeção. Para ajustar o fluxo da solução conforme necessário durante o processo de microinjeção. Ligue a estação de microinjeção aqui.Um sistema de injeção de jato femto é usado cuidadosamente usando um par de fórceps. Monte o capilar da agulha em um suporte de carregamento de agulha. Evite tocar na extremidade da agulha para evitar a contaminação da abertura da agulha.Usando uma ponta de microcarregadeira, carregue-a com 0,5 a 1,0 microlitros de solução de injeção de amostra. Coloque o prato com ovos de estrada no microscópio stage e posicione o prato de forma que os ovos fiquem alinhados verticalmente. Quando vistos através das oculares, coloque os ovos em foco.Monte cuidadosamente a agulha carregada no porta-agulha do microinjetor e ajuste a posição da agulha para que a ponta fique perfeitamente em foco no meio do campo de view. Em seguida, para limpar a agulha, pressione o botão para aplicar a pressão máxima viewatravés do microscópio. A solução será vista à medida que for expelida da agulha.Ajuste a pressão para estar na faixa de 90 a 360 HP para injeção com a pressão de compensação em aproximadamente um terço da pressão de injeção. Em seguida, injete um óvulo não fertilizado para examinar o fluxo da configuração da injeção. Usando um micromanipulador de joystick, direcione a ponta da agulha de injeção para o óvulo não fertilizado.Para facilitar a entrada da agulha, crie um leve tremor batendo suavemente no palco com um objeto duro, como uma chave de fenda. Pressione o pedal para injetar o ovo. Se o bólus de injeção não estiver visível, leve a agulha até a marca de arranhão.Bata suavemente a ponta da agulha na marca de arranhão para quebrar a ponta da agulha de injeção. A abertura da ponta ligeiramente mais larga permitirá um fluxo de solução mais fácil e a borda afiada da ponta quebrada facilita a entrada da agulha. Fertilize os óvulos adicionando esperma imediatamente após o envelope de fertilização se tornar visível.Inicie as injeções usando o micro manipulador. Com a mão direita, pressione a ponta da agulha contra o óvulo fertilizado, causando um leve recuo quase simultaneamente. Bata suavemente no microscópio stage com a chave de fenda segurada pela mão esquerda.Mova-se ao longo da linha de zigotos da estrada usando o controlador de estágio e injete o maior número possível de zigotos. O bólus de injeção não deve exceder um quinto do zigoto. Após 10 a 15 minutos, os óvulos recém-fertilizados ficarão endurecidos e não poderão mais ser injetados.Retire o prato do stage e usando uma pipeta de macarrão de plástico aspire cuidadosamente os três A TC água contendo esperma. Não deixe os zigotos secarem e adicione rapidamente água do mar fresca pré-resfriada. Cubra o prato e incube a 15 graus Celsius.Após a injeção. Monitore os embriões quanto a alterações fenotípicas ou moleculares, conforme apropriado para o experimento, para determinar se a injeção de construções repórter afetou o desenvolvimento. As construções repórter GFP e m cherry foram transcritas in vitro e microinjetadas nos óvulos recém-fertilizados.Os embriões injetados mostrados aqui podem ser claramente distinguidos daqueles não injetados, que são indicados pelas setas. Os embriões foram incubados a 15 graus Celsius por 24 horas até o estágio de blástula e fotografados como pode ser visto aqui. Os embriões injetados que são coloridos têm a mesma morfologia dos embriões não injetados, que são cinza.Isso sugere que a injeção de construtos repórter não leva a nenhum defeito de desenvolvimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como microinjetar o ouriço. A microinjeção de zigotos é uma ferramenta valiosa para pesquisas em genética, biologia celular e do desenvolvimento.Usando esta técnica, a comunidade de ouriços-do-mar fez uma contribuição significativa para nossa compreensão das vias de desenvolvimento, como especificação de sulfato, regulação gênica, expressão gênica e vias bioquímicas subjacentes à biologia do desenvolvimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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