FtsZ Polimerização Ensaios: protocolos simples e Considerações

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar as condições adequadas para estudar FTSZ, polimerização e atividade usando ensaios e equipamentos simples. Isso é obtido realizando ensaios de sedimentação de polímeros FDSC sob várias condições para encontrar condições adequadas nas quais o FDSZ polimeriza. Como segundo passo, realizamos ensaios de espalhamento de luz para estudar a polimerização de FDSZ em tempo real.

Em seguida, realizamos ensaios de hidrólise de GTP para determinar a atividade de g gtpa associada à polimerização de FT SC. São obtidos resultados que mostram quais condições são mais adequadas para o estudo de FTSC de uma fonte bacteriana específica com base em sedimentação, espalhamento de luz e hidrólise de GTP. A técnica mostrada aqui é fácil de executar em qualquer laboratório e fornecerá uma ideia rápida das capacidades de polimerização de FT a z específico. Descobrimos que a escolha do tampão certo é especialmente importante quando se trabalha com FTAZ na presença de outras proteínas demonstrando que a técnica será EVA crawl, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.

Para começar, adicione cinco microlitros de cloreto de magnésio 100 milimolares e 12 micromolares das proteínas bacterianas, FDSC e/ou SEP F em um dos tampões de polimerização escolhidos que tenham vários valores e composições de pH, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, coloque os tubos em uma incubadora com função de agitação e incube as amostras por dois minutos a 30 graus Celsius e 300 RPM. Uma vez que os tubos tenham sido completamente misturados, comece a polimerização adicionando um microlitro de mistura GTP ou GDP de uma solução estoque de 100 milimolares para que a concentração final seja de dois milimolares.

Em seguida, coloque as amostras de volta na incubadora agitada por mais 20 minutos. Em seguida, gire os tubos em temperatura ambiente por 15 minutos a 20.000 RPM usando um rotor TLA 55 ou 24.600 Gs equivalentes se estiver usando outra coisa. Assim que a centrífuga terminar, transfira os sobrenadantes para tubos limpos e guarde os pellets para mais tarde.

Pegue 20 microlitros dos sobrenadantes transferidos e misture-os em um tubo separado com 20 microlitros de tampão de amostra concentrado duas vezes. Prenda as tampas e ferva as amostras por 10 minutos a 98 graus Celsius. Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão de amostra concentrado duas vezes a cada fração de pellet que foi previamente reservada e suspenda os polímeros fervendo as amostras por 10 minutos a 98 graus Celsius.

Assim que as amostras terminarem de ferver, adicione mais 50 microlitros de água desmineralizada aos tubos que contêm os pellets. Em seguida, carregue 10 microlitros de sobrenadantes e pellets de cada amostra lado a lado em um gel de página 10% SDS e execute o gel a 150 volts. Assim que o gel estiver completo, remova o gel e core-o com kumasi azul brilhante G dois 50.

Em seguida, faça a imagem do gel e quantifique a proteína usando citometria conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Primeiro ligue um espectrômetro fluorescente e deixe a lâmpada aquecer por vários minutos para evitar flutuações térmicas. Além disso, ligue um banho-maria circulante e ajuste a temperatura da água para 30 graus Celsius para manter a câmara veterinária a uma temperatura constante.

À medida que o sistema aquece, defina os parâmetros operacionais do espectrômetro. Defina a alta tensão do detector para 300 volts e os comprimentos de onda de emissão e excitação para 350 nanômetros com uma largura de fenda de quatro nanômetros. Em seguida, programe o protocolo de aquisição de dados escolhendo uma aquisição baseada em tempo com duração de 3.600 segundos.

Limpe cuidadosamente um veterinário de fluorescência de 200 microlitros com um comprimento de caminho de um centímetro, fornicando-o em uma solução de limpeza em banho-maria por cinco minutos. Em seguida, prepare 294 microlitros de uma mistura mestre para cada um dos nove tampões de polimerização descritos no protocolo de texto que acompanha, cada um com 10 milimolares de cloreto de magnésio e 12 micromolares FDSE como as concentrações finais calculadas para 300 microlitros. Em seguida, as misturas transferem brevemente 196 microlitros do primeiro tampão de polimerização para o veterinário.

Coloque-o no espectrômetro e incube por dois minutos para elevar a temperatura da amostra até 30 graus Celsius. Após dois minutos, inicie a aquisição de dados e aguarde 90 segundos para verificar se o sinal está estável. Em seguida, adicione quatro microlitros de 100 milimolares GTP ou PIB.

Misture a amostra e continue a aquisição de dados por uma hora inteira. Repita essas etapas para cada buffer listado. Prepare 1,5 mililitros de GTP de dois milimolares em um tampão de polimerização escolhido.

Preparar também uma diluição-padrão de fosfato na gama de zero a 40 micromolares no mesmo tampão. Em seguida, prepare o reagente de trabalho verde malaquita conforme descrito no kit de bioensaios. Em seguida, faça quatro master mixes com um volume total de 360 microlitros: master mix, um contém FDSZ derivado de B subtilis e master mix, dois contém FDSE derivado de e coli.

As misturas principais três e quatro são usadas como controles e contêm EDTA em vez de cloreto de magnésio. Em seguida, pipete alíquotas de 20 microlitros das misturas principais e padrões de fosfato. Na placa de 96 poços A-Q-P-C-R de modo que haja 16 poços para cada mistura principal e os padrões de fosfato dispostos conforme mostrado aqui.

Pipete 180 microlitros de dois milimolares de GTP para a última faixa da placa. Em seguida, coloque a placa em uma máquina de PCR. Execute um programa com um único ciclo definido para 30 graus Celsius por 40 minutos.

Em uma segunda pipeta de placa de 96 poços, alíquotas de 20 microlitros do reagente de trabalho verde malaquita em poços, de A a H 10. Em seguida, a 60 microlitros do tampão de polimerização do experimento, reivindica A de um a H oito, em seguida, a 20 microlitros da solução de GTP de dois milimolares para os poços em cada pista de placa. Um nos intervalos predeterminados, conforme mostrado aqui, para examinar a reação em vários pontos de tempo.

Canalize as misturas para cima e para baixo para misturá-las após 30 minutos, começando com a pista um na placa um, transfira 20 microlitros da pista um da placa um para a pista um da placa dois e pipete para cima e para baixo para misturar. Este é o ponto de partida do desenvolvimento da cor verde malaquita para a reação de 30 minutos após 30 minutos e meio, transfira 20 microlitros da pista dois da placa um para a pista dois da placa dois e misture. Este é o ponto de partida do desenvolvimento da cor verde malaquita para a reação de 20 minutos.

Repita essas etapas com as faixas restantes de três a sete em intervalos de 32 após 33 minutos e meio a 20 microlitros de GTP para a pista oito na placa um e misture. Em seguida, transfira 20 microlitros para a pista oito na segunda placa e misture. Isso representa a reação de minuto zero e é o ponto de partida para o desenvolvimento da cor verde malaquita.

Após 34 minutos, adicione 80 microlitros da pista nove da placa um contendo o padrão de fosfato à pista nove da placa dois e misture após 34 minutos e meio, transfira 80 microlitros do segundo padrão de fosfato na pista 10 da primeira placa para a pista 10 na placa dois e misture. Em seguida, remova todas as bolhas de ar das amostras e incube a placa em temperatura ambiente por mais 25 minutos e meio. Após a incubação.

Coloque a placa em um leitor de placas de 96 poços a partir de 60 minutos do início do experimento. Meça a placa a 630 nanômetros a cada 30 segundos por cinco minutos para que 10 pontos de tempo sejam tomados. A primeira medida da placa corresponderá à raia um, a segunda à raia dois, e de modo que cada raia tenha tido exatamente o mesmo tempo para que a cor verde malaquita se desenvolva.

Em seguida, calcule o fosfato livre em cada amostra usando a curva de calibração padrão de fosfato e plote os dados como liberação de fosfato ao longo do tempo. Em seguida, calcule a atividade de hidrólise F-D-S-Z-G-T-P a partir da faixa linear da curva. Aqui estão os percentuais de SEP F e FDSZ nos pellets das amostras.

O FDSZ foi recuperado no pellet acima dos níveis de fundo somente quando o SEP F e o GTP também estavam presentes na amostra. A estequiometria exata de SEPPE e FDSZ nesses túbulos não é conhecida, mas esses resultados sugerem que há mais SEPPE presente do que FDSZ. A dispersão de luz de FDSZ de B subtilis e e coli é mostrada aqui, montada na presença de dois GTP milimolares no tampão de cloreto de potássio 50 milimolar.

O F-D-S-E-B-S fornece um sinal de dispersão de luz 20 a 40 vezes maior do que o FDSC EC, dependendo do pH do tampão. Curiosamente, o aumento da concentração de cloreto de potássio no tampão não influenciou significativamente o sinal de espalhamento de luz de F-D-S-Z-E-C, mas o sinal de F-T-S-Z-B-S diminuiu cerca de 80 vezes em pH 7,5, 30 vezes em pH 6,8 e 45 vezes em pH 6,5 em 300 milimolares de cloreto de potássio em comparação com tampões com 50 milimolares de cloreto de potássio. A atividade de hidrólise de GTP de FDSZ foi medida sob diferentes condições de tampão usando um ensaio colorimétrico para fosfato livre.

Verificou-se que a atividade GTPS de FT SZ aumenta com o aumento da concentração de cloreto de potássio em cada uma das diferentes condições de pH. A 50 milimolares de cloreto de potássio, a atividade de gtpa foi reduzida devido ao agrupamento de filamentos F-D-S-Z-B-S a 50 milimolares. O cloreto de potássio FDSZ EEC teve uma atividade de GTPS três a seis vezes maior do que o FDSZ devido à desmontagem mais rápida dos polímeros FDSC EEC.

Finalmente, a diferença na atividade de hidrólise de GTP entre F-D-S-Z-B-S e F-D-S-Z-E-C foi reduzida a 300 milimolares de cloreto de potássio, possivelmente devido ao agrupamento reduzido de filamentos F-D-S-Z-B-S. Após este procedimento, outros metais, como eletromicroscopia, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais relacionadas à estrutura dos polímeros fts na amostra.