Visualizando o fluxo citoplasmático durante a cicatrização de feridas unicelulares em Stentor coeruleus

O objetivo geral deste procedimento é medir o fluxo de citoplasma durante a cicatrização de feridas em uma única célula. Isso é feito coletando primeiro células vivas de stent ou SEIUs para usar como um sistema modelo para ferimento celular. O segundo passo é preparar as ferramentas de vidro para cortar as células.

Em seguida, as células do stent são abertas em uma configuração de microscópio personalizada que permite a cirurgia simultânea de baixa ampliação e imagens de alta resolução. A etapa final é realizar a análise computacional do fluxo citoplasmático usando o software de simetria velo de imagem de partículas. Em última análise, imagens de alta resolução do citoplasma são usadas para mostrar a resposta ativa das células durante a cicatrização de feridas.

Este método pode ser usado para abordar questões-chave sobre a cicatrização de feridas celulares, como se o citoplasma se torna ou não gelatinoso ao redor da região de um corte, a fim de evitar vazamento para o meio circundante. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de preparação e corte da ferramenta de manuseio de células são difíceis de aprender, pois exigem destreza manual. Para começar a obter células de stent ou Sirius de ponte natural, conforme descrito pelo tártaro, ou de um fornecedor comercial, adicione 300 mililitros de stent modificado ou meio adaptado de receitas de tártaro e deter, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Mantenha as culturas cultivando-as no escuro a 20 graus Celsius. Em seguida, cultive culturas de algas chlamydomonas Rhine Hardy em meio fosfato de acetato tris. Usando métodos de cultura padrão antes da alimentação, lave as células de chlamydomonas girando-as suavemente para baixo, removendo o sobrenadante e suspendendo-as no stent ou meio modificado.

Alimente as culturas de stent ou sarius de 300 mililitros com cerca de 30 milhões de células chm duas ou três vezes por semana, quando necessário. Colete stent ou células para cirurgia. Para começar, agite suavemente a cultura borbulhando ar através de uma ponta de pipeta até que as células comecem a se desprender e nadar livremente.

Em seguida, capture as células natatórias usando uma pipeta de um mililitro equipada com uma ponta de furo largo para evitar o cisalhamento das células. Depois de coletadas, deixe as células assentarem. Em seguida, pipete lentamente o meio acima deles e adicione um novo stent ou meio modificado.

Prepare as agulhas de vidro usadas para cortar as células do stent segurando duas hastes de agitação de vidro sobre a abundância e o queimador até que as pontas comecem a derreter. Em seguida, toque as extremidades das duas hastes até que o vidro fundido se funda. Depois de fundir, retire-os do fogo e deixe-os esfriar por um a dois segundos.

Em seguida, separe-os lentamente para fazer uma quebra limpa. Idealmente, isso produzirá uma agulha de aproximadamente um a dois centímetros de comprimento com uma ponta fina na extremidade. Se a agulha resultante estiver abaixo do ideal, quebre a ponta na cintura de vidro e reutilize as hastes.

Em seguida, use um carimbo de borracha quadrado revestido com vaselina para preparar uma câmara quadrada com paredes de vaselina, pressionando-a em uma lamínula de vidro. Em seguida, adicione 100 microlitros de stent modificado ou meio contendo 2% de metilcelulose ao quadrado de vaselina. Coloque a lamínula preparada em um adaptador de plástico e, em seguida, adicione as células de stent lavadas à lamínula.

Finalmente, organize as células na metilcelulose de modo que fiquem uniformemente espaçadas e sejam empurradas para perto o suficiente da superfície da lamínula para estarem em foco durante a imagem. Para começar, coloque a lâmina no palco do microscópio invertido. Em seguida, remova o corpo do microscópio de dissecação de seu suporte e determine a posição aproximada em que ele precisará ser colocado para visualizar a lâmina em baixa ampliação a partir do topo.

Em seguida, construa um microscópio de dois andares adicionando uma caixa de papelão com o espaçamento desejado entre a ocular do microscópio invertido e o escopo de dissecação. Prenda a caixa no lugar usando fita adesiva para que possa ser facilmente removida Quando o experimento for concluído, certifique-se de que a amostra estará no campo de visão e em foco sem a necessidade de mover o escopo de dissecação Depois de conectado, segure o escopo de dissecação contra a caixa e cole-o na caixa usando fita adesiva. Em seguida, configure o microscópio invertido usando a óptica DIC, colocando uma objetiva de ar de 20 x no lugar.

Além disso, certifique-se de usar um condensador DIC de longa distância de trabalho para fornecer espaço suficiente para realizar a microcirurgia de cima. Em seguida, coloque as células em foco com o microscópio invertido com tudo preparado e em foco de ambos os lados. Comece a adquirir imagens a uma taxa de quadros de duas imagens por segundo, usando uma câmera CCD de cinco 12 por cinco 12

Em seguida, corte a célula usando a agulha de vidro. Capture o padrão de fluxo citoplasmático inicial e observe todos os estágios do processo de ferimento e cicatrização da ferida. Encerre a aquisição quando a célula tiver retomado a aparência normal ou tiver reiniciado a motilidade ativa.

Para começar, baixe o PIV lab, um pacote MATLAB para medir o fluxo citoplasmático usando a simetria veloc da imagem de partículas. Em seguida, carregue a pilha de imagens TIFF para cada sequência de vídeo no programa de simetria veloc da imagem de partículas no manual do MATLAB. Gere manualmente uma máscara para cada pilha de imagens para mascarar regiões dos dados brutos fora do corpo do stent.

Em seguida, configure o laboratório PIV para usar a configuração de transformada rápida de Fourier e um tamanho de compartimento de 64 por 64 pixels, que agrupará os pixels em cada quadro em pixels quadrados maiores. Em seguida, execute o laboratório PIV para calcular correlações cruzadas entre os pixels em cada quadro com pixels próximos. No próximo quadro, isso produzirá um vetor de fluxo dependente do tempo centralizado em cada pixel de dobra, que tem a mesma resolução de tempo que os dados brutos.

Em seguida, calcule as médias de tempo da saída do campo vetorial resultante para comparar os dados obtidos com o stent antes do corte e durante a cicatrização da ferida. Além disso, calcule histogramas de velocidades de fluxo para estudar a força do fluxo e a mudança de velocidade em um determinado pixel ao longo do tempo, a fim de estudar as flutuações do fluxo. Ao obter sequências de imagens com o stent ou célula clivada ao meio, calcule o fluxo total de citoplasma de volta ao corpo celular propriamente dito, multiplicando a velocidade média do fluxo pela área da seção transversal da base da bolha do citoplasma extracelular.

Aqui é mostrada a imagem ao vivo de um stent ou célula enquanto é cortado e interrompido com uma agulha de vidro. Após o corte, uma quantidade substancial de citoplasma foi retirada do corpo celular principal, mas flui rapidamente de volta para a célula. Após este procedimento, inibidores químicos podem ser adicionados para responder a perguntas adicionais, como quais componentes do citoesqueleto podem contribuir para o movimento citoplasmático durante a cicatrização do stent ou da ferida.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar as ferramentas para cortar o stent em nossas células e como obter imagens do fluxo citoplasmático durante o processo de corte e cicatrização de feridas dentro de uma única célula gigante.