Estabelecendo a Concentração Bactericidal Mínima de um Agente Antimicrobiano para Células Planktônicas (MBC-P) e Células Biofilm (MBC-B)

Este procedimento compara diretamente a resistência planctônica e ao biofilme para uma cepa bacteriana que pode formar um biofilme. Primeiro, estabeleça um biofilme, reabasteça o meio e aplique diluição em série do agente antimicrobiano de escolha. Em seguida, permita que as células se recuperem em meio fresco.

Agora, teste a viabilidade das células por plaqueamento em trado LB. Em última análise, a determinação da concentração bactericida mínima de células planctônicas e de biofilme é usada para mostrar o aumento da resistência resultante do crescimento em um biofilme. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades porque contaminam os poços adjacentes ou não permitem que as pontas do dispositivo multifacetado esfriem o suficiente para não matar as bactérias.

Cultura, o tipo selvagem e cepa mutante de bactérias por 16 horas em um meio rico a 37 graus Celsius, diluir as culturas saturadas durante a noite em um meio fresco como M 63, meio mínimo, suplementado com magnésio, sulfato e arginina. Então Eloqua. 100 microlitros por poço.

Alocando 24 poços para cada cepa, incube por 24 horas a 37 graus Celsius. Em seguida, prepare 10 x soluções de estoque de uma série de diluição de antibiótico para sete poços e armazene no gelo. Usando uma pipeta multicanal, remova o sobrenadante gasto que contém células planctônicas.

Em seguida, adicione 90 microlitros de M 63 a todos os poços e adicione 10 microlitros da solução estoque de antibióticos apropriada ao controle sem antibióticos. Bem, para cada réplica e cepa, adicione 10 microlitros de água. Incube a placa de microtitulação por 24 horas a 37 graus Celsius.

Usando uma pipeta multicanal, remova o sobrenadante gasto que contém células planctônicas. Adicione 115 microlitros de M 63 a todos os poços e continue a cultivar as culturas por 24 horas. A 37 graus Celsius.

Rotule uma placa de trado de lb por metade 96. Placa de microtitulação de poço para esterilizar o dispositivo multifacetado, mergulhe-o em 100% de etanol e passe os pinos pela chama aberta de um bico de bunsen. Deixe os pinos esfriarem um pouco.

Usando as pontas dos pinos. Transfira a cultura planctônica de cada poço da placa de microtitulação para a superfície de uma placa helicoidal LB. Coloque as placas do sem-fim LB a 37 graus Celsius por 16 horas.

Em seguida, determine visualmente o ponto de corte para o crescimento bacteriano como a concentração bactericida mínima da cultura antibiótica, o tipo selvagem e a cepa mutante de bactérias por 16 horas em um meio rico a 37 graus Celsius, dilua as culturas saturadas durante a noite de um a 100 em meio fresco para ensaios de resistência a antibióticos para cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços. Adicione 90 microlitros da diluição bacteriana. Agora, para expor as células planctônicas a um gradiente de concentração de antibiótico.

Comece com 10 x soluções estoque de uma série de diluição de antibióticos como a tobramicina micina. Adicione 10 microlitros dos talos de antibióticos de acordo com o projeto experimental. Em seguida, adicione 10 microlitros de água aos poços de controle sem antibióticos para cada réplica e cepa.

Incube a placa de microtitulação por 24 horas a 37 graus Celsius para testar células vivas. Comece rotulando uma placa de trado LB para cada metade de uma placa de microtitulação de 96 poços. Esterilize o dispositivo multifacetado queimando com 100% de etanol.

Repita uma vez. Em seguida, usando o dispositivo multipino, transfira cerca de três microlitros de cultura planctônica de cada poço da placa de microtitulação para a superfície de uma placa de trado LB. Incube as placas a 37 graus Celsius por 16 horas.

Em seguida, determine a concentração bactericida mínima do antibiótico identificando a olho nu o ponto de corte para o crescimento bacteriano. Neste experimento, os dois diferentes ensaios de concentração mínima de BACTERICIDA foram usados para comparar a sensibilidade do PA 14 tipo selvagem com uma cepa mutante que não possui resistência a antibióticos. Gene NDVB.

Aqui, as concentrações bactericidas mínimas do antibiótico tobramicina foram medidas para o biofilme. O MBCB para PA 14 é de 100 microgramas por mililitro, em comparação com 12,5 microgramas por mililitro para o mutante. Em contraste, as concentrações bactericidas mínimas de tobramicina para as células planctônicas foram de oito microgramas por mililitro para o tipo selvagem PA 14 e mutante.

Uma vez dominado, o NBCB pode ser feito em cerca de uma hora, dividido em cinco dias.