Name: Estabelecendo a Concentração Bactericidal Mínima de um Agente Antimicrobiano para Células Planktônicas (MBC-P) e Células Biofilm (MBC-B) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-02T20:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Aprenda a determinar a concentração bactericida mínima para células planctônicas e biofilmes usando placas de microtitulação de 96 poços. Este método compara diretamente a resistência antimicrobiana entre estados bacterianos.

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O autor gostaria de agradecer li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz, e Clayton Hall para ajuda editorial com este manuscrito. Este ensaio foi inicialmente desenvolvido no laboratório de George O'Toole, Geisel School of Medicine em Dartmouth. A pesquisa no laboratório do Dr. Mah é apoiada por bolsas do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá e da Fibrose Cística do Canadá.

1. MBC-B
<ol><li>
Crescimento de um biofilme (adaptado de O'Toole9).
	<ol>
<li>Cresça uma cultura do tipo selvagem de interesse e tensão mutante por 16 horas em um meio rico a 37 °C.</li>
		<li>Diluir as culturas saturadas durante a noite 1:100 em meio fresco para ensaios de resistência a antibióticos. Um meio padrão para P. aeruginosa é m63 médio mínimo suplementado com sulfato de magnésio e arginina (ver Tabela 1). Este meio estimula a formação de um biofilme mais robusto.</li>
		<li>Adicione 100 μl da diluição por poço em um prato de microtiter de 96 poços (ver Tabela 1). Uma vez que esses ensaios são tipicamente realizados em triplicado para cada cepa, deve haver 24 poços de cada cepa.</li>
		<li>Incubar a placa de microtútmetro por 24 horas a 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Expondo o biofilme pré-formado a um gradiente de concentração de antibiótico
	<ol>
<li>Prepare uma série de diluição de 10x de antibiótico para 7 poços. Exemplo: para a tobramicina antibiótico, as concentrações finais nos poços são 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 e 0,006 mg/ml 5-8 . A partir de um estoque de 25 mg/ml, prepare diluições de 10x de 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 e 0,06 mg/ml. Deixe no gelo.</li>
		<li>Remova o supernatante gasto (contendo células planctônicas) usando uma pipeta multicanal (ver Tabela 1).</li>
		<li>Adicione 90 μl M63 (Mg/Arg) a todos os poços.</li>
		<li>Adicione 10 μl de cada concentração de antibiótico de 10x para alcançar as concentrações finais desejadas. Adicione 10 μl de água (sem controle de antibióticos) ao poço final para cada réplica e tensão.</li>
		<li>Incubar a placa de microtútmetro por 24 horas a 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Refrescar a mídia e permitir o desprendimento de células vivas.
	<ol>
<li>Remova o supernatante gasto (contendo células planctônicas) usando uma pipeta multicanal.</li>
		<li>Adicione 115 μl M63 (Mg/Arg) a todos os poços.</li>
		<li>Incubar a placa de microtútmetro por 24 horas a 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ensaio para células vivas.
	<ol>
<li>Rotule duas placas de ágar LB por placa de microtiter de 96 poços.</li>
		<li>Esterilize o dispositivo multifaceto (ver Tabela 1) mergulhando as pontas em 100% etanol e passando as pontas através da chama aberta de um queimador de Bunsen. repetir. Deixe as pontas esfriarem ligeiramente. Usando o dispositivo multifacetado, transfira ~3 μl (quantidade que normalmente é retida nas pontas das pontas) da cultura planctônica de cada poço da placa de microtítmetro para a superfície de uma placa de ágar LB.</li>
		<li>Incubar as placas de ágar LB por 16 horas a 37 °C.</li>
		<li>Determine a concentração bactericida mínima do antibiótico identificando, por olho, o corte para o crescimento bacteriano(Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. MBC-P
<ol><li>
Preparando cepas bacterianas
	<ol>
<li>Cresça uma cultura do tipo selvagem de interesse e tensão mutante por 16 horas em um meio rico a 37 °C.</li>
		<li>Diluir as culturas saturadas durante a noite 1:100 em meio fresco para ensaios de resistência a antibióticos. Um meio padrão para P. aeruginosa é m63 médio mínimo suplementado com sulfato de magnésio e arginina (ver Tabela 1).</li>
		<li>Adicione 90 μl da diluição por poço em um prato de microtiter de 96 poços (ver Tabela 1). Uma vez que esses ensaios são tipicamente realizados em triplicado para cada cepa, deve haver 24 poços de cada cepa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Expondo células planctônicas a um gradiente de concentração de antibiótico
	<ol>
<li>Prepare a série de diluição de 10x de antibiótico para 7 poços. Exemplo: para a tobramicina antibiótico, as concentrações finais nos poços são 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 e 0,0005 mg/ml. A partir de um estoque de 25 mg/ml, prepare diluições de 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 e 0,005 mg/ml. Deixe no gelo.</li>
		<li>Adicione 10 μl de cada concentração de antibiótico de 10x para alcançar as concentrações finais desejadas. Adicione 10 μl de água (sem controle de antibióticos) ao poço final para cada réplica e tensão.</li>
		<li>Incubar a placa de microtútmetro por 24 horas a 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ensaio para células vivas.
	<ol>
<li>Rotule duas placas de ágar LB por placa de microtiter de 96 poços.</li>
		<li>Esterilize o dispositivo multifaceto (ver Tabela 1) mergulhando as pontas em 100% etanol e passando as pontas através da chama aberta de um queimador de Bunsen. repetir. Deixe as pontas esfriarem ligeiramente. Usando o dispositivo multifacetado, transfira ~3 μl (quantidade que normalmente é retida nas pontas das pontas) da cultura planctônica de cada poço da placa de microtítmetro para a superfície de uma placa de ágar LB.</li>
		<li>Incubar as placas de ágar LB por 16 horas a 37 °C.</li>
		<li>Determinar a concentração bactericida mínima do antibiótico identificando, por olho, o corte para o crescimento bacteriano(Figura 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).</li>
<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).</li>
<li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-specific+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li>
<li>Zhang, L., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Involvement+of+a+Novel+Efflux+System+in+Biofilm-Specific+Resistance+to+Antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics.</a> J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).</li>
<li>Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+tssC1+Links+Type+VI+Secretion+and+Biofilm-specific+Antibiotic+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance.</a> J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).</li>
<li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biofilm-Specific+Antibiotic+Resistance+Gene%2C+ndvB%2C+is+Important+for+Expression+of+Ethanol+Oxidation+Genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+tolerance+of+biofilms+and+persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multidrug tolerance of biofilms and persister cells.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).</li>
<li>Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. 31, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2011).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMerritt%2C+JH+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22">Curr. Protoc. Microbiol</a>. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.1.1-1B.1.17 (2005).</li>
<li>Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamey%2C+BE+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22">Curr. Protoc. Microbiol</a>. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.3.1-1B.3.14 (2005).</li>
</ol>

A autora declara que não tem interesses financeiros concorrentes.

A resistência a antibióticos em células planctônicas é definida como um aumento na concentração inibitória mínima (MIC) de um antibiótico devido a uma mudança permanente nas células (por exemplo, uma mutação). Os mecanismos de resistência ou tolerância específicas de biofilmes que foram identificados até hoje são o resultado da expressão de genes do tipo selvagem dentro de biofilmes. Assim, a definição clássica de resistência não se aplica a biofilmes. No entanto, outro conjunto de definições foi apresentado: me...

Ensaios de resistência a antibióticos foram inicialmente desenvolvidos para avaliar a resistência de culturas planctônicas (natação livre) de bactérias. Como muitas infecções bacterianas envolvem biofilmes (células ligadas à superfície), estávamos interessados em desenvolver um método para avaliar a resistência a antibióticos específicos do biofilme. No entanto, a maioria dos ensaios de resistência a antibióticos são pouco adequados para medir a resistência de biofilmes. Por exemplo, determinar a concentração inibitória mínima (MIC) é o padrão-ouro para determinar a resistência a antibióticos das culturas bacterianas planctônicas 1. Este ensaio implica misturar uma cultura plantiônica diluída com uma série de diluição de antibióticos.  A concentração de antibiótico que inibe o crescimento visível das células planctônicas é o MIC. Uma vez que este ensaio se baseia na inibição do crescimento, por definição, ele não pode trabalhar com culturas de biofilme, o que requer examinar a sensibilidade antibiótico das células em um biofilme pré-cultivado. Em vez de medir a inibição do crescimento, o ensaio MBC-B descrito aqui determina a concentração de antibiótico que mata células já existentes em um biofilme. Assim, este ensaio visa imitar tratamentos antibióticos de infecções por biofilmes estabelecidas, e fornecer uma visão mais relevante da resistência a antibióticos bacterianos in vivo.
Uma vez que os biofilmes são geralmente mais resistentes a antibióticos do que as culturas planctônicas 2-4, foi necessário elaborar um método que relaciona diretamente a resistência a antibióticos de um biofilme com o de uma cultura planctônica. Assim, outro objetivo deste método é ser capaz de comparar diretamente o nível de resistência a antibióticos entre células planctônicas e biofilmes. Os ensaios MBC-P e MBC-B descritos aqui tornam isso possível porque as células são cultivadas em condições semelhantes. Utilizamos este método para estudar vários genes que são importantes para a resistência a antibióticos específicas de biofilme 5-8 .

<table><tbody><tr><td> 1x&nbsp; M63 </td><td></td><td></td><td> Prepare como um 5x&nbsp; M63 dissolvendo 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 e 10g (NH4)2SO4 em 1 L de água. Este estoque não precisa ser autoclavado e pode ser armazenado à temperatura ambiente.&nbsp; Diluir 5x&nbsp; estoque 1:5, autoclave, esfrie e, em seguida, adicione os componentes desejados. </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td>Fisher</td><td>P285-500</td><td> </td></tr><tr><td> K2HPO4 </td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td> </td></tr><tr><td> (NH4)2SO4 </td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td> </td></tr><tr><td> Sulfato de magnésio </td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td> Adicione à concentração final de 1 mM.&nbsp; Prepare como um estoque de 1 M em água e autoclave. </td></tr><tr><td> Tobramicina </td><td>Sigma</td><td></td><td> Prepare 50 mg/m&nbsp; estoque. Alíquota e armazene em -20&deg;C. </td></tr><tr><td> Arginina </td><td>Sigma</td><td>A5131</td><td> Adicione à concentração final de 0,4%&nbsp; Prepare como um estoque de 20% em água e esterilize por filtro.&nbsp; Esta fonte alternativa de carbono/energia pode substituir a glicose e os ácidos casaminos </td></tr><tr><td> placas de microtitulação de 96 poços </td><td>Corning</td><td>3595</td><td> Estéril, fundo plano, baixa evaporação </td></tr><tr><td> Tranferpette (pipeta multicanal) </td><td>BrandTech</td><td>2703610</td><td> 8 canais, 20-200 &mu; l </td></tr><tr><td> Dispositivo multipinos </td><td>Dan-Kar</td><td>MC48</td><td> 48 pinos se encaixam em &frac12; de uma placa de microtitulação de 96 poços </td></tr></tbody></table>

estabelecendo a concentração bactericidal mínima de um agente antimicrobiano para células planktônicas (mbc-p) e células biofilm (mbc-b)

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

Este protocolo permite uma comparação direta entre a resistência planctônica e biofilme para uma cepa bacteriana que pode formar um biofilme in vitro. Bactérias são inoculadas nos poços de uma placa de microtismo de 96 poços. No caso do ensaio plantônico, diluições seriais do agente antimicrobiano de escolha são adicionadas às suspensões bacterianas. No ensaio de biofilme, uma vez inoculado, as bactérias são deixadas para formar um biofilme durante um determinado período de tempo. Células nãoectadas são removidas dos poços, a mídia é reabastecida e diluições seriais do agente antimicrobiano de escolha são adicionadas. Após a exposição ao agente antimicrobiano, as células planctônicas são avaliadas para o crescimento. Para o ensaio de biofilme, a mídia é atualizada com mídia fresca sem o agente antimicrobiano e as células de biofilm são deixadas para se recuperar. A viabilidade da célula biofilm é avaliada após o período de recuperação. O MBC-P para o agente antimicrobiano é definido como a menor concentração de droga que mata as células na cultura planctônica.  Em contrapartida, o MBC-B para uma cepa é determinado expondo biofilmes pré-formados ao aumento das concentrações de agente antimicrobiano por 24 horas. O MBC-B é definido como a menor concentração de agente antimicrobiano que mata as células do biofilme.

Foram realizados ensaios MBC-P e MBC-B, comparando a sensibilidade do tipo selvagem PA14 com o PA14 ∆ndvB. A tobramicina foi usada como antibiótico. São apresentados resultados correspondentes à etapa 1.4.4 (Figura 1) e à etapa 2.3.4 (Figura 2). PA14 e ∆ndvB foram inoculados nos ensaios MBC-P e MBC-B em triplicado. Após a conclusão das etapas 1.0-1.4 do protocolo MBC-B e as etapas 2.0-2.3 do protocolo MBC-P, as células viáveis foram emplacar em uma placa de ágar LB. Con...

Este protocolo permite uma comparação direta entre a resistência planctônica e biofilme para uma cepa bacteriana que pode formar um biofilme in vitro usando uma placa de microtismo de 96 poços. Bactérias planctônicas ou biofilmes são expostas a diluições seriais do agente antimicrobiano de escolha. A viabilidade é avaliada pelo crescimento em placas de ágar.

Estabelecendo a Concentração Bactericidal Mínima de um Agente Antimicrobiano para Células Planktônicas (MBC-P) e Células Biofilm (MBC-B)

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

Este procedimento compara diretamente a resistência planctônica e ao biofilme para uma cepa bacteriana que pode formar um biofilme. Primeiro, estabeleça um biofilme, reabasteça o meio e aplique diluição em série do agente antimicrobiano de escolha. Em seguida, permita que as células se recuperem em meio fresco.Agora, teste a viabilidade das células por plaqueamento em trado LB. Em última análise, a determinação da concentração bactericida mínima de células planctônicas e de biofilme é usada para mostrar o aumento da resistência resultante do crescimento em um biofilme. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades porque contaminam os poços adjacentes ou não permitem que as pontas do dispositivo multifacetado esfriem o suficiente para não matar as bactérias.Cultura, o tipo selvagem e cepa mutante de bactérias por 16 horas em um meio rico a 37 graus Celsius, diluir as culturas saturadas durante a noite em um meio fresco como M 63, meio mínimo, suplementado com magnésio, sulfato e arginina. Então Eloqua. 100 microlitros por poço.Alocando 24 poços para cada cepa, incube por 24 horas a 37 graus Celsius. Em seguida, prepare 10 x soluções de estoque de uma série de dilu

establishing-minimal-bactericidal-concentration-an-antimicrobial

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Testes de susceptibilidade antimicrobiana Atualmente, o diagnóstico baseia-se no crescimento planctônico dos isolados em ricas em nutrientes, condições aeróbicas. Aqui, nós utilizamos um meio de escarro alternativa artificial para estudar susceptibilidade antimicrobiana de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa em ambas as condições de aerobiose e microaerofilia mais representativas do pulmão da fibrose cística.

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

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Um método de placa de microtitulação para avaliar a concentração inibitória mínima de um antibiótico

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