Name: Membrana Potencial Dye imagem de Ventromedial Hipotálamo Neurônios de camundongos adultos para estudar Glucose Sensing (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-27T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprenda a avaliar o sensoriamento de glicose em neurônios do hipotálamo ventromedial de camundongos adultos usando imagem com corante de potencial de membrana. Este método permite quantificar respostas neuronais a alterações de glicose.

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NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

1. Animais <ol><li> Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use na Universidade de Medicina e Odontologia de New Jersey. </li><li> Casa grupo masculino camundongos C57BL / 6 em uma programação escuro light/12 hr 12 hr e permitir o acesso ad libitum à água e comida. Sacrifício em 4-5 meses de idade. A eutanásia dos ratos foi realizada por meio do plano cirúrgico de anestesia e uma forma secundária de eutanásia (ou seja penetrando incisão na cavidade torácica, através da membrana). Isto é consistente com as Diretrizes AVMA sobre eutanásia. </li></ol> 2. Preparação da solução de perfusão, Lamelas, pipetas de vidro, e Mídia <ol><li> Adicione uma solução de perfusão que consiste em 1L de KCl 2,5 mM, 7 mM de MgCl2, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 28 mM NaHCO3, 0,5 mM de CaCl2, 7 mM de glucose, 1 mM de ácido ascórbico, e 3 mM de piruvato em destilada dH2O Ajustar a osmolaridade para ~ 300 mOsm usando cerca de 80 g / L de sacarose. Oxigenar por borbulhamento com 95% de O2 / 5% de CO 2 e ajustar o pH para 7,4. Cada experiência requer aproximadamente 200 ml de solução de perfusão. As aliquotas podem ser guardadas a -20 ° C durante até 2 meses. </li><li> Adicione 250 ml de caldo contendo meio Neurobasal Neurobasal sem glicose, glicose 2,5 mM, e 100 U / ml de penicilina estreptomicina. Ajuste a osmolaridade do estoque Neurobasal a 280 mOsm usando sacarose. Fazer 500 ml Hibernate estoque contendo Hibernate-A mídia sem glicose, glicose 2,5 mM, e 100 U / ml de penicilina estreptomicina. </li><li> Mexa bem e ambas as ações filtro de esterilizar utilizando Stericup unidades de filtro de vácuo. Tenha cuidado para não introduzir a glicose ou outros contaminantes através das barras de vidro ou agitar. Envolva as garrafas em papel alumínio para proteger a mídia da luz e armazenar a 4 ° C por até 2 meses. </li><li> Inflamar as pontas dos 4 pipetas de vidro autoclavados (9) na forma que as pontas não são lodiâmetros nger afiadas e a abertura é grande (~ 0,9 milímetros), médio grande (~ 0,7 mm) em, meio (~ 0,5 mM), e pequeno (~ 0,3 mm),. O maior deve ser mal polido eo menor deve ser de cerca de um terço do que o diâmetro. </li><li> No dia antes de neurônios de colheita, limpo quatro 25 milímetros lamínulas utilizando etanol 70% e que passam sobre um queimador de chama de Bunsen. Coloque cada lamela em um estéril 35 milímetros prato de cultura e adicionar 2 ml estéril 1% de poli-D-lisina em dH 2 O. Colocar os pratos em uma incubadora (37 ° C) durante a noite. No dia seguinte, lava-se com dH 2 O estéril 3x e permitir lamelas para secar completamente. </li><li> Faça 75 mL alíquotas de 1 M de ácido láctico e 200 mL alíquotas de GlutaMAX; armazenar a -20 ° C. Totalmente descongelar alíquotas de ácido láctico e GlutaMAX antes da utilização para assegurar a homogeneidade. </li><li> No dia da colheita de neurônios, fazer 30 ml de meio de cultura fresco que consistem em Hibernate-A estoque contendo ácido láctico 1 mM, 0,5 mM GlutaMAX, e 2% B27 sem insulina. VoRTEx e ajustar o pH para 7,4 com NaOH 1 N. </li><li> Coloque 10 ml de meio de cultura em uma placa de Petri 60 milímetros de vidro no gelo, colocar 2 ml em um tubo de 15 ml no gelo e manter a mídia restante à temperatura ambiente. </li><li> No dia da colheita de neurónios, fazer 25 ml de meio de crescimento fresco consistindo de estoque Neurobasal que contém uma mM de ácido láctico, Glutamax 0,5 mM, e 2% B27 sem insulina. Vortex e ajustar o pH para 7,4 com NaOH 1 N. Permitir que o meio de crescimento fresco para equilibrar numa incubadora (37 ° C, 5% CO 2) durante pelo menos 30 min. </li></ol> 3. Perfusão cardíaca <ol><li> Descongelar completamente 200 ml de solução de perfusão e oxigenado com 95% O2 / 5% de CO 2 em gelo durante pelo menos 15 min. </li><li> Lavar uma lâmina vibratome com acetona, etanol a 70%, e dH2O Posicione a lâmina no vibratome. </li><li> Lave a câmara de resfriamento vibratome e tubos de perfusão com dH 2 O. Encher a câmara de refrigeração (4 ° C) Com solução de perfusão e continuar a oxigenar. </li><li> Anestesiar um rato com pentobarbital de sódio 50 mg / ml, diluído 1:1 com água estéril, injectado por via intraperitoneal. Verifique se o mouse é totalmente anestesiado por beliscar a cauda e observando nenhuma resposta. </li><li> Despeje solução de perfusão fria no reservatório de perfusão e tubos pouco antes da dissecção. Salve 20-30 ml para dissecação do cérebro e continuar a oxigenar no gelo. Fluxo por gravidade a partir de uma seringa de 60 ml elevada através de uma tubagem e uma agulha G 20 proporciona um fluxo suficiente. Permita que a solução para executar até que as bolhas de ar são lavadas. Continue para oxigenar. </li><li> Cortar a pele acima da caixa torácica do mouse. Levante a caixa torácica e, cuidadosamente, fazer um corte horizontal através do diafragma. Faça dois cortes laterais através da caixa torácica para cima em direção aos braços para expor o coração. Use uma pinça para segurar a caixa torácica. </li><li> Faça um pequeno corte 2 milímetros no átrio direito para fornecer um ponto de saída de sangue para ser lavada para fora do vascusistema lar. </li><li> Perfurar o ventrículo esquerdo com a agulha de perfusão, apenas o suficiente para inserir a abertura da agulha. Segurar a agulha no lugar com uma mão e iniciar o fluxo de solução de perfusão com a outra mão. Depois de 10-15 ml de solução de perfusão, o sangue deve ser lavado para fora e o efluente irá limpar. </li></ol> 4. Cérebro corte e Dissection <ol><li> Após a perfusão cardíaca, transferência oxigenado solução de perfusão a frio para uma placa de Petri em gelo imediatamente antes da utilização. </li><li> Decapitar Rapidamente, remover o cérebro do crânio e colocar o cérebro em solução de perfusão. Para remover o cérebro: puxe a pele para a frente, faça um corte na linha média no crânio em direção às órbitas, fazer 2 cortes laterais em direção a cada um dos olhos, use uma pinça para puxar para trás de cada lado do crânio, fazer um corte coronal entre as órbitas dos olhos, e use uma espátula para persuadir suavemente o cérebro para fora em solução de perfusão. Use a tesoura para cortar as vias ópticas, se necessário. Não tocar o hipotálamoc área e não puxe as vias ópticas, porque isso coloca muita pressão sobre a eminência mediana e tecido hipotalâmico subjacente. </li><li> Use uma lâmina de barbear e agulha lateralmente cortar o tecido cerebral de aproximadamente 3 mm posterior e anterior ao hipotálamo, enquanto o tecido está submerso (bregma -3,52 mm). É especialmente importante para o corte lateral anterior a ser de nível, de modo que o cérebro vai se sentar em frente a chuck vibratome. </li><li> Remover o tecido cerebral restante da solução e usar papel de filtro para afastar solução da seção cérebro montado. </li><li> Coloque um pouco de super-cola em um mandril vibratome e espalhar a cola com o tamanho do cérebro. Colocar o tecido cerebral em cima da cola com a face anterior virada para baixo e de frente para o hipotálamo da lâmina. Wick o excesso de cola e coloque a bucha na câmara de resfriamento vibratome. Tenha cuidado para não deixar muito cola, pois bolha em torno do cérebro, quando colocado em uma solução. </li><li> Com o Vibratome ajustado para uma velocidade lenta (nível 2) e alta amplitude (nível 9), fazer 300-500 mM fatias até chegar à área do hipotálamo. Agora faça finas fatias de corte 100 mm a partir do posterior ao anterior. As pistas visuais são como se segue. Posterior ao hipotálamo do terceiro ventrículo será muito pequeno (-2,70 para -2,30 bregma mm). No bregma -2,30 mm, o terceiro ventrículo é separado em dorsal e ventral em secções o corte coronal. </li><li> Uma vez que as seções do terceiro ventrículo fusível, faça dois 500 mm fatias que contêm a região correta do VMH (-2,18 para -1,22 bregma mm). Anterior à VMH, o terceiro ventrículo já não se estende para o chão ventral do cérebro (bregma -1.06 a -0.82) 8. </li><li> Transferir essas fatias para a placa de Petri, em gelo, contendo os meios de cultura. Dissecar VMH (VMN + ARC), como mostrado na Figura 1. Usar uma pipeta para transferir suavemente as peças VMH em 2 ml de meio de cultura sobre gelo. </li></ol> 5. Dissociação e Cultura <ol><li> Remover o VMH de gelo e colocar à temperatura ambiente. Adicionar 20 U / ml de papaína a 4 ml de meio de cultura. Inverter para misturar e coloque em um banho de água 34 C °. Verifique e misturar por inversão a cada minuto até que a mídia digestão não é mais nublado. Filtro (0,22 mM) em um frasco estéril e transferir o tecido para os meios de digestão. </li><li> Digerir o tecido, por agitação a 100 rpm a 34 ° C durante 30 min. </li><li> Prepare 1 ml de meio contendo 8% de albumina de soro bovino (BSA) durante a digestão. Dissolve-se 80 mg de BSA em 1 ml de meio de cultura e do filtro (0,22 mM) num tubo cónico. </li><li> Lavar o tecido através da transferência para 5 ml de meio de cultura num tubo cónico e, lentamente, invertendo uma vez. </li><li> Adicionar enzima DNase 30 mL de 6 ml de meio de cultura e misture para fazer mídia trituração. Aspirar a mídia de lavagem e adicionar 3 ml de mídia trituração. </li><li> Use as pipetas de vidro para triturar na ordem de largest para o menor. Gentilmente triturar 10x e aguarde 4 min para peças maiores para resolver. Utilizar a segunda pipeta para transferir o topo 2 ml contendo uma suspensão de células dissociadas de um novo tubo cónico. Adicionar 2 ml de mídia trituração, triturar 10x e esperar 3 min. Utilizar o terceiro pipeta para transferir os melhores 2 ml de suspensão de células. Adicionar 1 ml de mídia trituração, 5x triturar e esperar 2 min. Utilizar a quarta pipeta para transferir o topo 2 ml da suspensão de células. </li><li> A camada de suspensão de células dissociadas em cima da BSA 8%, tomando cuidado para não misturar. Centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. </li><li> Coloque autoclavado de 6 mm x 8 milímetros clonagem cilindros no centro de cada lamela. Lamelas deve estar completamente seca. Aspirar e ressuspender o sedimento em 440 mL de mídia crescimento quente. Preencha clonagem de cilindros com a suspensão neuronal e lugar na incubadora por 20 min. </li><li> Retire os cilindros de clonagem e muito gentilmente lavar detritos. Encha cada wi pratopo de 2 ml de meio de crescimento. Permitir que as células recuperar durante pelo menos 1 hr antes de quaisquer ensaios são realizados. </li></ol> 6. Preparação para o MPD imagem <ol><li> Adicione solução de gravação consiste de NaCl 121 mM, KCl 4,7 mM, CaCl2 2 mM, 0,1 mM de MgCl2, 1,2 mM de MgSO4, 0,97 mM de K 2 HPO 4, 0,23 mM, KH 2 PO 4, 5 mM de NaHCO3, e 25 mM HEPES. Ajustar o pH para 7,4. </li><li> Adicionar glucose para tornar a solução de teste de glicose baixo desejado (0,1-2,0 mM de glucose). Misturar bem e reservar 400 ml baixo solução de gravação de glicose. Adicionar glicose para os restantes 600 ml para fazer solução de gravação de glicose 2,5 mM e misture bem. </li><li> Proteger corante da luz tanto quanto possível. Adicionar 4 ml de temperatura ambiente de buffer para um frasco azul MPD. Misture bem e adicione 5 mL de corante por solução de gravação ml. Mantenha solução homogénea misturando com pipeta entre soluções. O corante fluorescente contém molecules, que entram células com despolarização, e supressor moléculas, que não podem atravessar a membrana celular. As aliquotas podem ser guardadas a -20 ° C e utilizado dentro de 4 dias. Não congelamento-descongelamento mais do que uma vez. </li><li> Incubar as células em 2 ml de 2,5 mM de solução de gravação de glicose mais corante a 34 ° C durante 30 min. Um bloco de aquecimento pode ser utilizado. Proteger da luz. </li><li> Prepare bombas de seringa e sistema de perfusão com 2,5 mM e 0,1 mM de soluções de gravação, mais corante. Tubos de 60 ml de seringas devem ser ligadas a um colector. </li><li> Depois de parar qualquer bomba, espere ~ 10 segundos antes de mudar soluções no colector para evitar o acúmulo de pressão na seringa. A mudança de pressão de distribuição de fluido para alterar a câmara fechada que contém os neurónios, causando alterações no foco do microscópio durante a experiência e distorção de imagens. </li><li> O tubo colector de saída deve ser ligado a um aquecedor em linha e, em seguida, tubo de polietileno, que se liga a uma câmara fechada.<html> Bolhas devem ser apuradas ea taxa de perfusão deve ser ajustada para 0,5 ml / min. Proteger da luz. </li><li> Transferir 25 milímetros lamela com os neurônios aderentes à câmara fechada, tomando cuidado para não permitir que lamela para secar e não introduzir bolhas de ar. O deslizamento é alinhada nas ranhuras da peça de fundo, um par de gotas de solução de gravação é colocado ao longo dos lados, e a parte superior está montada suavemente para segurar a lamela no lugar. </li><li> Usar uma pipeta para encher a câmara com a solução de gravação e, em seguida, colocar uma lamela de 18 milímetros na parte superior. Gentilmente caber anel branco na câmara para manter a lamela menor no lugar. Pressionar para baixo muito lentamente e levemente para evitar as bolhas de ar a ser introduzido no interior da câmara fechada. </li><li> Inicie a bomba de seringa para a solução de gravação de glicose 2,5 mM, pressione o anel branco, e conectar-se à câmara fechada. Solte lentamente a pressão do anel branco e se conectar a tubulação que conduz a um contentor de resíduos. </li></ol>e &quot;&gt; 7. MPD imagem <ol><li> Centralize os neurônios utilizando luz baixa de campo claro. Tentar minimizar a quantidade de tempo que as células estão a ser expostos à luz. </li><li> Permitir que o sistema de perfusão de correr por 10 min para permitir a estabilização da temperatura, foco e tingir o equilíbrio. </li><li> Enquanto priming, abra o programa MetaMorph e dar uma imagem de campo claro (10X) dos neurônios. Use a função de Auto-Focus para tomar 3 pilhas de imagens fluorescentes (150 ms, filtro de Cy3 Narrow, 10X) e determinar o foco dentro de 5 mm. No final do período de condicionamento de 10 min, verificar o foco mais uma vez. </li><li> Comece a gravar imagens fluorescentes a cada 30 seg por 40 min. Estabelecer uma linha de base em 2,5 mM de glicose durante 10 minutos, em seguida diminua glicose durante 15 minutos, e finalmente voltar a 2,5 mM de glucose, durante 15 min. Soluções são alteradas, parando uma bomba de seringa, à espera de 10 segundos, voltando-se uma porta no colector, e começar outra bomba de seringa. As mudanças devem ocorrer antes de desejados momentos based sobre a defasagem entre o colector e células. </li><li> Depois de gravar todas as imagens fluorescentes, dê uma imagem de campo claro dos neurônios. </li></ol> 8. Análise MPD imagem <ol><li> Use MetaMorph para criar regiões ovais ao redor de cada célula na imagem de campo claro tomada no final do experimento in. Regiões deve ser ligeiramente maior do que cada neurônio e podem ser feitas de 1 pixel fora de borda escura da célula. Não escolha células que são insalubres, sobreposição, ou perto de detritos. Células saudáveis, muitas vezes aparecem escuras. Por fim, criar 5 grandes regiões ovais em áreas com ausência de células ou detritos para as medições de fundo. </li><li> Transfira as regiões para todas as imagens fluorescentes e inspecionar para verificar que nenhum movimento / mudança ocorreu. Use a função de medida para registrar a intensidade de fluorescência de cada região para todas as imagens em um arquivo do Excel. O uso de Revistas em Metamorph é aconselhada. </li><li> No Excel, crie uma média de 5 regiões de fundo para cada fluorescimagem ent. Isto representa o valor médio do fundo em cada ponto de tempo. Para cada ponto de imagem / tempo, subtrair o fundo de todas as medições região. A intensidade de fluorescência subtraído-fundo será chamado de intensidade a seguir. </li><li> Para cada célula, calcular a intensidade média durante 2-8 minutos de gravação. Isso representa a linha de base da célula em glicose 2,5 mM. Um tampão de dois minutos em ambas as extremidades de cada tratamento é utilizado para minimizar o ruído. </li><li> Para cada célula, calcular a percentagem de alteração a partir da linha de base: (Intensidade-Base) / Base </li><li> Criar um gráfico de linha com a variação percentual da linha de base vs tempo. </li><li> Calcule a variação percentual média da linha de base durante minutos 18-23. Calcule a variação percentual média da linha de base durante 35-40 minutos. Durante o processamento da imagem não é utilizado, o ruído é reduzido por meio do cálculo da média de intensidade dentro de cada região celular, de subtracção do fundo, e a média da intensidade de região, durante 5 minutos or mais. </li><li> Experimentos de controle em que mM solução de gravação de glicose 2,5 mM é trocada com solução de gravação de glicose 2,5 devem ser realizados para determinar o limiar de ruído. Calcule a variação percentual média da linha de base durante 18-23 minutos, para, pelo menos, 6 pratos e 3 ratos. Determine a média e desvio padrão desses valores. </li><li> Definir o limiar de uma resposta positiva de despolarização à média mais dois desvios padrão. A média mais dois desvios padrão corresponde a uma diferença com p &lt;0,05. As experiências de controlo revelou uma alteração de 10% da linha de base como o valor limiar apropriado. </li><li> Para cada célula, avaliar a resposta de despolarização reversível com base em dois critérios. Em primeiro lugar, a alteração percentual média da linha de base durante 18-23 minutos, deve ser maior do que 10%, o limite determinado na etapa anterior. Em segundo lugar, a variação percentual média da linha de base durante 35-40 minutos, deve ser inferior a metade da variação percentual média delinha de base durante minutos 18-23. O segundo critério foi escolhido, uma vez que foi encontrado para ser mais rigoroso do que a estimulação com glutamato ou KCl. Neurônios não saudáveis ​​costumam responder à estimulação com glutamato ou KCl, embora suas respostas a diminuição da glicose não são reversíveis. </li><li> Para cada prato, calcular a% de neurônios despolarizadas. Este valor é utilizado para quantificar a% de neurónios GI entre os diferentes grupos de tratamento. </li></ol>

<ol><li>Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-sensing+neurons%3A+are+they+physiologically+relevant%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?</a> Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).</li>
<li>Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+impairs+glucose+and+insulin+regulation+of+nitric+oxide+production+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).</li>
<li>Canabal, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose%2C+insulin%2C+and+leptin+signaling+pathways+modulate+nitric+oxide+synthesis+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Reg.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).</li>
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<li>Song, Z., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+glucose+and+lactate+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 54, 15-22 (2005).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

A chave para ser capaz de estudar a atividade dos neurônios de camundongos adultos é a capacidade de dissociar os neurônios saudáveis. A dissociação dos neurônios do hipotálamo de camundongos adultos é mais difícil em vários passos-chave no protocolo em comparação com neurônios de ratos juvenis. Temos superar este problema de várias formas. Fazendo grossas fatias de 500 mm do cérebro minimiza danos mecânicos aos neurônios, em comparação com os habituais 250-350 mM fatias utilizados para o tecido cerebral de ratos mais j...

O cérebro regula a homeostase energética através da neuroendócrino e sistema nervoso autônomo. O hipotálamo ventromedial (VMH), constituída pelo núcleo ventromedial (VMN) e o núcleo arqueado (ARC), é importante para a central de regulação da homeostase da energia. Neurônios sensores de glicose Especializadas, no VMH, vincular a atividade neuronal e homeostase da glicose periférica 1. Existem dois tipos de sensores de glicose neurônios; glicose animado (GE) neurônios aumentar enquanto a glicose inibida (GI) neurônios diminuir a sua actividade com o aumento da glicose extracelular. Neurônios glicose VMH sensores geralmente são estudados utilizando eletrofisiologia ou cálcio / membrana potencial de imagem sensível corante. A técnica de patch clamp eletrofisiológico é considerada o padrão-ouro no estudo da atividade neuronal ex vivo. Nesta técnica, um eléctrodo de micropipeta de vidro é ligado à membrana celular através de uma elevada resistência(GÊ) selo. Eletrodos patch clamp permitir a gravação em tempo real do potencial de ação freqüência (pinça de corrente) ou condutância de íons (braçadeira de tensão) muda dentro de um único neurônio. Embora a técnica de patch clamp fornece informações detalhadas sobre mudanças na condutância de canais iônicos específicos, uma grande desvantagem é que apenas um neurônio pode observar ao mesmo tempo. Demora cerca de 30-45 minutos de gravação para verificar que se está a gravação de um neurônio sensor de glicose antes mesmo de iniciar um tratamento experimental específico. Além disso, GI e GE neurônios compreendem &lt;20% do total da população neuronal VMH. Para agravar este problema é a falta, em muitos casos, de um marcador celular de identificação para esses neurônios. Assim, é evidente que apesar de fornecer informação eléctrica valiosa que outras técnicas não é possível, a análise de fixação de membranas é trabalhoso, demorado e baixo rendimento. A utilização de imagens de fluorescência de neurónios dissociados VMH permite o estudo de hundreds de neurônios simultaneamente. Corantes sensíveis de cálcio pode ser utilizado para medir alterações de cálcio intracelular, que indirectamente se correlacionam com alterações na actividade neuronal. Corantes sensíveis potenciais de membrana são utilizados para monitorar mudanças potenciais de membrana. Medir o potencial de membrana celular é um indicador mais directa da actividade neuronal em comparação com alterações nos níveis de cálcio intracelular. Além disso, a membrana potencial corante (MPD) imagens potencialmente detectar pequenas mudanças no potencial da membrana onde a ação potencial de disparo não é alterada e os níveis de cálcio intracelular pode não mudar. Ambas as técnicas de imagiologia de fluorescência foram utilizados para estudar VMH neurónios sensores de glucose de ratinhos jovens 2-7. Embora os resultados são menos detalhadas do que as obtidas com patch clamp eletrofisiologia, a força de experimentos com imagens é que eles avaliam simultaneamente uma grande população de células que, inevitavelmente, incluem um número significativo de neurônios sensores de glicose. MPD i imagemé particularmente útil para estudar os neurónios GI que são mais uniformemente localizada ao longo de todo o VMH; proporcionando assim uma população adequada para estudar o VMH dissociado (~ 15% GI). Por outro lado, enquanto os neurônios da GE são densamente localizada no ventrolateral-VMN e celular pobre região entre o ARC e VMN, eles não representam um número significativo de neurônios dentro do VMH (&lt;1% GE). Além disso, através do estudo de neurônios isolados, astrocitária e efeitos pré-sinápticos são eliminados. Isto pode ser uma vantagem em estudar os efeitos de primeira ordem de neurónios, bem como uma desvantagem uma vez que as ligações e os processos fisiológicos estão perdidos. Um factor limitante, tanto Electrofisiologia de fixação de membranas e MPD / cálcio corante de imagem é a necessidade de utilizar animais mais novos (por exemplo, ratos ou ratazanas. &lt;8 semanas de idade). Isto é, predominantemente, devido a um aumento do tecido conjuntivo, em combinação com a diminuição da viabilidade neuronal que ocorre com a idade. No cérebro-slice eletrofisiologia do parafuso prisioneiros, o aumento do tecido conjuntivo faz com que seja mais difícil visualizar os neurônios. O aumento do tecido conjuntivo também torna mais difícil dissociar um grande número de neurônios saudáveis ​​para estudos de imagem. Além disso, os neurônios dos animais mais jovens sobrevivem por mais tempo durante o registo patch clamp ou imagem. No entanto, o uso de ratos jovens pode ser uma grande limitação. Actividade e / ou uma resposta a neurotransmissores ou nutrientes que circulam neuronal muda com a idade. Por exemplo, uma vez que o balanço energético está intimamente ligada ao estado reprodutivo, os neurônios do hipotálamo que regulam o balanço energético podem responder de forma diferente em pré-vs animais pós-púberes. Além disso, muitas doenças necessitam de um tratamento a longo prazo ou não se manifestar até a idade adulta. Os principais exemplos de tais doenças são a obesidade dietética ou Diabetes Mellitus Tipo 2. Desde neurônios sensores de glicose são acreditados para jogar um papel nestas doenças, desenvolvemos uma metodologia para cultivar com sucesso adultos VMH neurônios saudáveis ​​para uso em exp imagem MPDeriments.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal-A Medium (Custom)</td><td>Invitrogen</td><td>0050128DJ</td><td>custom made sem glicose</td></tr><tr><td>Hibernate-A Medium (Custom)</td><td>BrainBits</td><td></td><td>custom made sem glicose</td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin (20,000 U/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td>outros fornecedores aceitáveis</td></tr><tr><td>Stericup vacuum filter units (0.22 &mu; m)</td><td>Millipore</td><td></td><td>outros fornecedores aceitáveis</td></tr><tr><td>25 mm Lamínulas de vidro</td><td>Warner</td><td>#1 25mm redondo</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Lamínulas de vidro</td><td>Warner</td><td>#1 18mm redondo</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>B27 menos insulina (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>VWR</td><td>55411</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome & câmara de resfriamento</td><td>Vibratome</td><td>Série 1000 Sistema</td><td></td>de seccionamento</tr><tr><td>Lâminas de vibratome</td><td>Polysciences</td><td>22370</td><td>injetor ou lâminas de borda dupla de outros fornecedores aceitáveis</td></tr><tr><td>Papaína, suspensão</td><td>Worthington</td><td>LS003124</td><td></td></tr><tr><td>BSA, adequado para cultura de células</td><td>Sigma</td><td></td><td>outro fornecedor aceitável</td></tr><tr><td>DNAse, para cultura de células</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>outros fornecedores aceitáveis</td></tr><tr><td>cilindros de clonagem, 6 mm x 8 mm</td><td>Bellco Glass</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>Potencial de Membrana Corante (azul)</td><td>Molecular Devices</td><td>R8042</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor em linha</td><td>Warner</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>Bombas de seringa</td><td>WPI</td><td>sp100i</td><td>outro fornecedor aceitável</td></tr><tr><td>Câmara fechada</td><td>Warner</td><td>Tubo de polietileno RC-43C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Warner</td><td>PE-90</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>software de análise de imagem alternativo aceitável</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>BX61 WI</td><td> usado com 10X&nbsp; objetivo </td></tr><tr><td>Câmera</td><td>Photometrics</td><td>Cool Snap HQ</td><td></td></tr><tr><td>Estreito Cy3 Conjunto de Filtros</td><td>Chroma</td><td>41007a</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Iluminação</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda DG-4</td><td></td></tr></tbody></table>

membrana potencial dye imagem de ventromedial hipotálamo neurônios de camundongos adultos para estudar glucose sensing

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Estudos sobre a atividade neuronal são frequentemente realizadas utilizando neurônios de roedores com menos de 2 meses de idade, devido às dificuldades técnicas associadas com o aumento do tecido conjuntivo e diminuição da viabilidade neuronal que ocorrem com a idade. Aqui, descrevemos uma metodologia para a dissociação de neurônios do hipotálamo de ratos saudáveis ​​em idade adulta. A capacidade para estudar os neurónios de ratos adultos em idade permite a utilização de modelos de doenças que se manifestam numa idade mais avançada e pode ser mais preciso para a developmentally certos estudos. Imagens de fluorescência de neurónios dissociados pode ser utilizado para estudar a actividade de uma população de neurónios, em oposição ao uso de electrofisiologia para estudar um único neurónio. Isso é particularmente útil quando se estuda uma população neuronal heterogêneo no qual o tipo neuronal desejado é raro, como para glicose sentindo neurônios do hipotálamo. Utilizamos membrana potencial de imagem corante de neurônios do hipotálamo ventromedial adultos para estudar as suas respostas a chaNGES na glucose extracelular. Neurônios sensores de glicose são acreditados para jogar um papel na regulação central do equilíbrio energético. A capacidade para estudar a detecção de glicose em roedores adultos é particularmente útil uma vez que a predominância de doenças relacionadas com o balanço de energia disfuncional (por exemplo. Obesidade) aumentar com a idade.

A dissecção precisa do VMH longe de outras áreas do hipotálamo é importante para a obtenção de resultados consistentes. A inclusão de outras áreas podem diluir a população neuronal VMH, mudando a% de neurónios despolarizadas calculados. Além disso, os neurónios sensores de glicose foram identificados em outras regiões do hipotálamo, como o hipotálamo lateral, que pode ser diferente funcionalmente e mecanicamente a partir de glicose VMH detecção neurónios. Figura 1 ilustra as localizações anatómicas corr...

A atividade de neurônios individuais de ratos em idade adulta pode ser estudado por dissociar os neurônios de regiões específicas do cérebro e usando membrana fluorescente potencial de imagem corante. Por testes de respostas a alterações nos níveis de glucose, esta técnica pode ser utilizada para estudar a sensibilidade à glicose dos neurónios hipotalâmicos ventromediais adultos.

Membrana Potencial Dye imagem de Ventromedial Hipotálamo Neurônios de camundongos adultos para estudar Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a detecção de glicose em neurônios hipotalâmicos mediais ventrais ou VMH de camundongos mais velhos, usando corante sensível ao potencial de membrana como um índice de atividade neuronal. Isso é feito realizando primeiro a perfusão cardíaca para liberar o sangue do cérebro de um camundongo anestesiado antes da remoção do cérebro. O segundo passo é criar fatias de cérebro coronal e dissecar o VMH.Em seguida, os neurônios VMH são dissociados e cultivados em lamínulas. A etapa final é medir a fluorescência dos neurônios à medida que a glicose diminui na presença de corante potencial de membrana. Em última análise, cada mudança de neurônio na fluorescência é usada para quantificar a resposta desse neurônio inibido pela glicose às mudanças na glicose.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a eletrofisiologia, é a capacidade de estudar neurônios de camundongos adultos. Isso nos permite estudar os estados de doença na idade adulta. Comece este procedimento colocando o cérebro dissecado no mandril na câmara Vibram com o Vibram ajustado para velocidade lenta no nível dois e alta amplitude no nível nove, corte fatias de 300 a 500 mícrons até atingir a área hipotalâmica.Em seguida, corte fatias finas a 100 mícrons de posterior para anterior para isolar a região precisa do VMH. Preste muita atenção às alterações anatômicas em bgma menos 2,30 milímetros. O terceiro ventrículo é separado em seções dorsal e ventral. Corona.Uma vez que as seções transversais do fusível do terceiro ventrículo cortem duas fatias de 500 mícrons, essas fatias conterão a região correta de VMH. Transfira essas fatias para uma placa de Petri em gelo contendo meios de cultura. Em seguida, disseque o VMH.Use uma pipeta para transferir suavemente os pedaços de VMH em mililitros de meios de cultura no gelo. Nesta etapa, remova os meios de cultura contendo o VMH do gelo e deixe aclimatar à temperatura ambiente. Adicione 20 unidades por mililitro de pape a quatro mililitros de meios de cultura, depois inverta para misturar e coloque em banho-maria a 34 graus Celsius Verifique e misture por inversão a cada minuto até que o meio de digestão não esteja mais turvo.Depois disso, filtre-o em um frasco estéril e transfira o tecido para o meio de digestão. Em seguida, digerir o tecido agitando a 100 RPM a 34 graus Celsius por 30 minutos. Durante a digestão, preparar um mililitro de meio contendo 8% de albumina de soro bovino, dissolvendo 80 miligramas de BSA num mililitro de meio de cultura e filtrando-o para um tubo cónico.Lave o tecido transferindo-o para cinco mililitros de meio de cultura em um tubo cônico e invertendo-o lentamente. Uma vez depois, adicione 30 microlitros da enzima do DNA a seis mililitros de cultura, meio e misture para fazer o meio de tação. Em seguida, aspire o meio de lavagem e adicione três mililitros do meio de tação.Use as pipetas de vidro para triar na ordem do maior para o menor suavemente tritrate 10 vezes e, em seguida, espere quatro minutos para que os pedaços maiores assentem. Em seguida, use a segunda pipeta para transferir os dois mililitros superiores contendo a suspensão de célula dissociada para um novo tubo cônico. Adicione dois mililitros de tri media tri 10 vezes e aguarde três minutos.Use a terceira pipeta para transferir os dois mililitros superiores para a suspensão celular. Depois disso, adicione um mililitro de tri media tri rate cinco vezes e aguarde dois minutos. Use a quarta pipeta para transferir os dois mililitros superiores para a suspensão celular.Agora coloque a suspensão de células dissociadas em cima do 8% BSA, tomando cuidado para não misturá-los. Em seguida, centrifugou a 1000 RPM por cinco minutos. Em seguida, coloque os cilindros de clonagem de seis por oito milímetros da autoclave no centro de cada lamínula completamente seca.Em seguida, aspire e ressuspenda o pellet em 440 microlitros de meio de crescimento quente. Em seguida, encha os cilindros de clonagem com a suspensão neuronal e coloque-os na incubadora por 20 minutos. Remova os cilindros de clonagem e lave os detritos com muito cuidado.Em seguida, encha cada prato com dois mililitros de meio de crescimento e deixe as células se recuperarem por pelo menos uma hora antes de qualquer ensaio ser realizado. Neste procedimento, faça a solução de registro e ajuste o pH para 7,4. Agora adicione quatro mililitros de tampão de temperatura ambiente a um frasco MPD azul, misture bem e adicione cinco microlitros de corante por mililitro de solução de gravação a ele. Depois disso, incube as células em dois mililitros de solução de registro de glicose 2,5 milimolares com corante a 34 graus Celsius por 30 minutos protegido da luz.Em seguida, encha as bombas de seringa com uma solução de registo de glicose a 2,5 ou 0,1 milimolares e o sistema de profusão com uma solução de registo de glicose a 2,5 milimolares. Conecte o tubo de seringas de 60 mililitros a um coletor. A tubulação de saída do coletor deve ser conectada a um aquecedor em linha e, em seguida, à tubulação de polietileno, que é então conectada a uma câmara fechada.Limpe as bolhas executando o sistema de perfusão e batendo com um objeto duro, se necessário. Em seguida, defina a taxa de perfusão para 0,5 mililitros por minuto e use o mínimo de luz pelo menor tempo possível para configurar o sistema. Em seguida, transfira uma lamínula de 25 milímetros com neurônios aderentes para a câmara fechada.Cuidado para não deixar a lamínula secar e não introduzir bolhas de ar. Alinhe o deslizamento nas ranhuras da peça inferior. Coloque algumas gotas de solução de gravação nas laterais e encaixe suavemente a peça superior para segurar a lamínula no lugar.Em seguida, use um conta-gotas para encher a câmara com solução de gravação e coloque uma lamínula de 18 milímetros por cima. Encaixe suavemente o anel branco na câmara para manter a lamínula menor no lugar. Depois disso, pressione o anel branco para baixo muito lenta e levemente para evitar que bolhas de ar sejam introduzidas na câmara fechada.Ligue a bomba de seringa para a solução de registro de glicose 2.5 milimolar. Em seguida, pressione o anel branco e conecte à câmara fechada. Libere lentamente a pressão do anel branco e conecte ao tubo que leva a um recipiente de resíduos.Para o MPD Imaging Center, os neurônios usam luz de campo de baixo brilho. Tente minimizar a quantidade de tempo que as células estão sendo expostas à luz e permita que o sistema de perfusão funcione por 10 minutos para estabilização da temperatura, foco e equilíbrio da matriz durante a preparação. Abra o programa METAMORPH e tire uma imagem de campo brilhante dos neurônios com ampliação de 10 vezes.Use a função de foco automático para tirar três pilhas de imagens fluorescentes e determinar o foco dentro de cinco mícrons. No final do período de escorva de 10 minutos, verifique o foco mais uma vez e comece a gravar imagens fluorescentes a cada 30 segundos por 40 minutos. Estabeleça uma linha de base em glicose milimolar de 2.5 por 10 minutos.Em seguida, diminua a glicose por 15 minutos e, finalmente, retorne à glicose 2.5 milimolar por 15 minutos. Depois de registrar todas as imagens fluorescentes, tire uma imagem de campo claro dos neurônios. Esta figura mostra uma imagem de campo claro dos neurônios VMH saudáveis de um camundongo adulto.Esta imagem foi tirada 24 horas após a dissociação e tem sido usada para imagens MPD. Alguns exemplos de neurônios que seriam ou não usados para análise são marcados como mostrados. Aqui estão os traços de fluorescência MPD representativos de um neurônio GI indicado por verde e um neurônio não GI indicado por glóbulos laranja foram perfundidos com solução de registro de glicose 2,5 milimolares por 10 minutos, seguidos por uma diminuição para 0,1 milimolar G por 15 minutos e um retorno a 2,5 milimolar G por 15 minutos.Esta figura mostra a porcentagem de neurônios VMH adultos, que se despolarizam reversivelmente em resposta à diminuição da glicose detectada usando imagens fluorescentes de MPD. A magnitude da alteração da glicose está positivamente correlacionada com a porcentagem de neurônios despolarizantes após este procedimento. Outros métodos, como RTPC de célula única, podem ser realizados para identificar proteínas específicas expressas por neurônios sensores de glicose.

membrane-potential-dye-imaging-ventromedial-hypothalamus-neurons-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste protocolo, atualizar o progresso recente na imagem...

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O vídeo demonstra uma técnica para medir a captação de glicose em neurônios motores larvais de Drosophila usando um sensor de glicose intracelular baseado em transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). Depois de dissecar as larvas para expor o cordão nervoso ventral, os neurônios motores são visualizados através da fluorescência emitida pelo fluoróforo doador do sensor. Quando estimulado com glicose, o FRET entre os fluoróforos doadores e aceptores do sensor desencadeia a...

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Estudando o sinal de insulina hipotalâmico a intolerância de glicose periférica com um sistema de infusão contínua de drogas dentro do cérebro de rato

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

A absorção de glicose é aumentada em neurônios motores Drosophila afetados pela proteína de ligação de DNA TAR (TDP-43), como indicado por um sensor de glicose à base de FRET, geneticamente codificado.

Medição da captação de glicose em modelos de Drosophila de Proteinopatia TDP-43

A comunicação intestino-cérebro, facilitada pelo nervo vago, é crucial para a comunicação entre o sistema endócrino gastrointestinal e o cérebro. No entanto, ainda não se sabe se a injeção intragástrica de glicose pode alterar a atividade cortical. Aqui, oferecemos um protocolo abrangente para observar mudanças na atividade cortical após a injeção de glicose no duodeno.

Análise em tempo real da comunicação neural intestino-cérebro: dinâmica do cálcio em todo o córtex em resposta à estimulação intestinal da glicose

Aprenda a avaliar o sensoriamento de glicose em neurônios do hipotálamo ventromedial de camundongos adultos usando imagem com corante de potencial de membrana. Este método permite quantificar respostas neuronais a alterações de glicose.

Membrana Potencial Dye imagem de Ventromedial Hipotálamo Neurônios de camundongos adultos para estudar Glucose Sensing

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