Métodos para o estudo dos mecanismos de ação dos antipsicóticos Drogas em
4 de fevereiro de 2014
Abordagens para testar os efeitos de drogas antipsicóticas (APDs) em Caenorhabditis elegans são demonstrados. Os ensaios estão descritos para testar efeitos de drogas sobre o desenvolvimento ea viabilidade e sobre a taxa de bombeamento da faringe. Estes métodos também são aplicáveis para as experiências de farmacogenética com outras classes de drogas que APD.
O objetivo geral deste procedimento é examinar os efeitos dos medicamentos antipsicóticos no desenvolvimento e bombeamento faríngeo do elgan do mar. Isso é feito primeiro aumentando uma população de nematóides adultos e, a partir deles, gerando uma população sincronizada de animais. O próximo passo é transferir ovos ou adultos sincronizados para placas de ensaio com medicamentos.
A etapa final é observar e pontuar os efeitos das drogas nos vermes. Em última análise, os resultados podem mostrar que os medicamentos antipsicóticos retardam o desenvolvimento e inibem o bombeamento faríngeo em animais expostos a drogas. Embora esse método possa fornecer informações sobre os mecanismos de ação dos medicamentos antipsicóticos, ele também pode ser aplicado para estudar outras moléculas pequenas e até mesmo moléculas grandes, como lipídios.
Comece carregando uma placa de 12 poços com dois mililitros de NGM, médio por poço. Deixe o prato de lado para endurecer em temperatura ambiente. Em seguida, escolha uma colônia de bactérias OP 50 e transfira-a para uma garrafa de 50 mililitros de cultura LB.
A bactéria durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 220 RPM no dia seguinte em cada poço da placa preparada. A 20 microlitros da cultura bacteriana, defina a placa para incubar durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Carregue cada poço sentado com 80 microlitros de medicamento de interesse na concentração de trabalho.
Nesse caso, o medicamento é a C Clozapina. Certifique-se de vortex a solução antes de tomar alíquotas. Agite a solução para distribuí-la uniformemente no poço e deixe-a absorver à temperatura ambiente com a tampa da placa aberta.
Em seguida, prossiga com o ensaio ou armazene a placa a 20 graus Celsius durante a noite e inicie o ensaio no dia seguinte. Comece coletando ovos do genótipo de interesse. Comece com uma população de vermes com muitos adultos GR.
Lave os vermes em uma placa de 3,5 centímetros usando um tampão M nove. Em seguida, gire-os em um tubo de 15 mililitros a 2000 RPM por um minuto. Remova o sobrenadante por aspiração e substitua-o por cinco mililitros de alvejante.
Em seguida, interrompa suavemente os adultos invertendo o tubo e espere que os animais comecem a se dissolver continuamente. Observe os vermes em dissolução sob o escopo. Quando cerca de metade dos vermes se dissolveram.
Após cerca de cinco minutos, gire o tubo para coletar os ovos, aspire o sobrenadante e substitua-o rapidamente por um tampão M nove. Em seguida, gire o tubo para baixo novamente como antes e remova todos, exceto cerca de 100 microlitros do sobrenadante M nove. Para suspender os ovos, vórtice o tubo.
Em seguida, transfira dois microlitros da suspensão para uma placa NGM e conte o número de ovos transferidos. Em seguida, carregue a placa tratada com medicamento com 30 a 35 ovos por poço e incube a placa a 20 graus Celsius por 24 horas. Após 24 horas, marque o número de ovos eclodidos.
Se mais de 25 vermes estiverem presentes em algum, remova o excesso de vermes. Devolva os vermes da placa à incubadora para observação posterior em intervalos de 24 horas por dia, pontue o estágio de desenvolvimento dos vermes nos poços com base no tamanho dos vermes e na forma de suas vulvas. Efeitos robustos são geralmente observados no terceiro e quarto dias.
O experimento deve durar cerca de uma semana. Para este protocolo, preparei placas de teste de drogas conforme descrito anteriormente no dia anterior, iniciando o ensaio. Escolher 50 L de animais em quatro estádios para cada genótipo da experiência.
Transfira-os para placas NGM e incube as placas por 24 horas a 20 graus Celsius. No dia seguinte, a cada 15 a 20 minutos, carregue um poço de teste com 10 animais depois que um grupo tiver sido exposto à droga por meia hora. Comece a observar o bombeamento faríngeo sob um microscópio de dissecação.
Primeiro, encontre um verme e, em seguida, conte suas bombas faríngeas por 20 segundos. Uma vez marcado, pegue o verme do prato. Marque todos os vermes no poço da mesma maneira.
Os resultados esperados da realização do atraso experimental. O ensaio de letalidade com controles do tipo selvagem deve mostrar que, ao contrário da taxa de crescimento típica até o estágio adulto grave, os animais expostos à clozapina c ainda estão nos estágios larvais jovens ou estão mortos, testando mutantes em diferentes concentrações de clozapina revelados mutantes supressores, como mudo um, e mutantes potenciadores, como MU dois. Universalmente, a letalidade do mudo foi menor do que a do tipo selvagem, e a letalidade do MU dois foi maior como esperado em comparação com o controle que os animais mudos sobreviventes são mais capazes de desenvolver, enquanto os dois sobreviventes mudos são mais atrasados.
Um exame mais aprofundado revelou que a exposição à clozapina reduziu as taxas de bombeamento faríngeo de maneira dependente da concentração. No entanto, a taxa diminuída do tipo mudo foi menor do que a do tipo selvagem, enquanto a taxa diminuída do tipo mudo dois foi maior do que a do tipo selvagem. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar o ensaio de drogas antipsicóticas em pequena escala.
A mensagem também pode ser ampliada para realizar uma triagem genética em larga escala.
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Visão Geral
Este artigo demonstra abordagens para testar os efeitos de medicamentos antipsicóticos (APDs) em Caenorhabditis elegans. Os métodos incluem ensaios para avaliar os efeitos das drogas sobre o desenvolvimento, viabilidade e taxa de bombeamento faríngeo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Farmacologia
- Biologia do Desenvolvimento
Contexto
- Caenorhabditis elegans é um organismo modelo utilizado para estudar os efeitos de medicamentos.
- Medicamentos antipsicóticos podem influenciar processos de desenvolvimento.
- A bombagem faríngea é um comportamento crítico para avaliar o impacto de medicamentos.
- Experimentos farmacogenéticos podem ser realizados utilizando estes métodos.
Objetivo do Estudo
- Examinar os efeitos de medicamentos antipsicóticos no desenvolvimento de nematoides.
- Avaliar o impacto dessas drogas nas taxas de bombeamento faríngeo.
- Fornecer insights sobre os mecanismos de ação dos antipsicóticos.
Métodos Utilizados
- Cultive uma população de Caenorhabditis elegans adultas.
- Obtenha uma população sincronizada a partir de nematoides adultos.
- Transfira ovos ou adultos sincronizados para placas de ensaio contendo fármacos.
- Observe e avalie os efeitos dos fármacos sobre o desenvolvimento e o comportamento.
Resultados Principais
- Os medicamentos antipsicóticos atrasam o desenvolvimento em nematoides expostos.
- A bombagem faríngea é inibida em animais tratados com medicamentos.
- Os resultados podem contribuir para a compreensão dos mecanismos dos medicamentos.
- Os métodos são aplicáveis a outras moléculas pequenas e grandes.
Conclusões
- O estudo fornece uma estrutura para testar os efeitos de fármacos em C. elegans.
- Os conhecimentos obtidos podem ser estendidos a diversos estudos farmacológicos.
- Esses métodos podem ser adaptados para aplicações mais amplas além dos APDs.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Estudos sobre o mecanismo de drogas antipsicóticas em C. elegans permitem a desvinculação precoce de alvos ao associar resultados fenotípicos a vias neuromoleculares. Os ensaios de desenvolvimento e bombeamento faríngeo fornecem leituras quantitativas e escalonáveis para a investigação do mecanismo de ação na biologia de descoberta. Isso reforça a confiança preditiva na validação de alvos e na triagem de portfólios para indicações neuropsiquiátricas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investigar hipóteses terapêuticas associando a exposição a antipsicóticos com atraso no desenvolvimento e fenótipos de inibição faríngea.
- Valor Operacional: Permitir a validação funcional de alvos por meio de telas genéticas de supressores e potencializadores que identifiquem modificadores da resposta ao fármaco.
- Valor Preditivo: Apoiar a desmistificação mecanicista ao revelar efeitos dependentes da concentração sobre respostas neuromusculares conservadas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Preparar sistemas biológicos validados para triagem subsequente por meio de fluxos de trabalho sincronizados de embriões e preparação de adultos em estágios definidos.
- Valor Operacional: Abordar a padronização de ensaios por meio de pontuações diárias de desenvolvimento e protocolos de contagem de bombas faríngeas em 20 segundos.
- Valor de Escalabilidade: Destacar a prontidão para triagem e a reutilização da plataforma para testar moléculas pequenas e grandes além de antipsicóticos.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Valor Translacional: Discutir a relevância para doenças por meio de genes conservados na síntese de neurotransmissores e na função sináptica no genoma de C. elegans.
- Continuidade Pré-clínica: Descrever a continuidade desde a descoberta até a validação fenotípica em um sistema de organismo inteiro relevante para a doença.
- Avanço com Base em Risco: Abordar decisões baseadas em mecanismos do tipo avançar/interromper o desenvolvimento, utilizando letalidade no desenvolvimento e supressão da taxa de bombeamento como biomarcadores de eficácia.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método posiciona os estudos sobre o mecanismo de antipsicóticos dentro da fase inicial de descoberta até a identificação de compostos líderes, apoiando a verificação de hipóteses e a clarificação de vias na neurofarmacologia.
- Biologia da Descoberta: Explique como o método apoia o teste de hipóteses por meio do estadiamento do desenvolvimento e da quantificação da bombagem faríngea.
- Triagem: Descreva a preparação do ensaio por meio da transferência sincronizada de ovos para placas contendo fármacos e da pontuação fenotípica diária.
- Análises: Destaque as saídas quantitativas, incluindo a pontuação dos estágios de desenvolvimento e o número de bombagens faríngeas por unidade de tempo, para comparação entre condições.
- Pesquisa Translacional: Relacione o método com a continuidade pré-clínica por meio de fenótipos neuromusculares conservados, preditivos do mecanismo do fármaco.
- Reutilização Empresarial: Apresente o método como uma capacidade reutilizável para estudos de mecanismo de ação em diversas áreas terapêuticas, utilizando triagens genéticas e químicas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da ancoragem fenotípica dos efeitos antipsicóticos à função neuromuscular.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de populações sincronizadas e intervalos de pontuação definidos para desenvolvimento e comportamento.
- Valor Estratégico: Decisões mais assertivas de avançar/não avançar ao reduzir a ambiguidade mecanicista na triagem inicial de antipsicóticos.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco utilizando atraso no desenvolvimento e inibição faríngea como desfechos de biomarcadores transponíveis.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise necessária em cultura de nematoides, sincronização e análise fenotípica por microscopia estereoscópica.
- Os equipamentos necessários incluem incubadoras, microscópios e sistemas de dispensação de fármacos para ensaios em placas de 12 poços.
- A padronização entre equipes exige protocolos compartilhados para preparação de ovos, plaqueamento de fármacos e critérios de estadiamento do desenvolvimento.
- As considerações para adaptação entre sistemas modelo envolvem a conservação de alvos de neurotransmissores e o escalonamento dos ensaios para formatos de maior produtividade.
- As limitações práticas incluem a duração do ensaio de aproximadamente uma semana e a sensibilidade à qualidade do gramado bacteriano, que afeta a saúde dos vermes.
