Name: Indução de carcinoma da bexiga invasivo de células transicionais em imunológico intacto Humanos MUC1 Ratos transgênicos: um modelo de desenvolvimento Imunoterapia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-30T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprenda a induzir resposta de linfócitos T citotóxicos em câncer de bexiga usando vacina peptídica direcionada ao antígeno MUC1 em camundongos transgênicos. Este modelo avalia a eficácia da imunoterapia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer ao Programa de Biologia Rato Davis UC para a reprodução dos ratos. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha.

Todos os estudos em animais e experimentos foram conduzidos em um protocolo aprovado pela University of California, Davis Institutional Animal Care e do Comitê Use Consultivo Administrativo. 1. MUC1.Tg Rato Breeding e Propagação <ol><li> O Davis Programa de Biologia Rato UC (MBP) raças tipo camundongos C57BL / 6 machos selvagens com heterozigotos MUC1.Tg C57BL / 6 do sexo feminino para estabelecer a nossa colônia de reprodução. MUC1.Tg filhotes são entregues para os estudos, conforme necessário. </li><li> Pessoal MBP cortar os dedos do filho em um padrão definido (0-99) para identificação mouse, e quando aplicável clipe da cauda. O dedo do pé ou o tecido da cauda é processado para a genotipagem utilizando a extracção de ADN padrão e Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR), análise. </li></ol> 2. Desenho do Estudo <ol><li> Estudar trabalhos de grupo <ol><li> Pesar cada rato separadamente em uma balança e registrar o peso em gramas de cada mouse. </li><li> Esta parte do processo de invOlvés a metodologia e desenho do estudo. Para a primeira parte do estudo, atribuir pareados por idade camundongos tipo MUC1.Tg e selvagem para começar a indução de câncer de bexiga com OH-BBN. Eutanásia ratinhos 8 semanas após a última dose de OH-BBN para confirmar a presença de tumores de bexiga por histologia. </li><li> Para a segunda parte do estudo, os ratinhos aleatoriamente MUC1.Tg macho para um número adequado de tratamento e grupos de controlo. Estes ratinhos ser monitorizadas as citocinas no soro e as respostas imunitárias de células T durante a indução e desenvolvimento de tumores, e, em seguida, no final do estudo 8 semanas após a última dose de OH-BBN. </li></ol></li><li> Indução de cancro da bexiga <ol><li> OH-BBN é uma substância cancerígena e altamente tóxica. Por favor, leia e siga as orientações da ficha de segurança ao manusear e armazenar este produto químico. </li><li> Calcular a concentração da solução de dosagem necessária para administrar a dose apropriada (3 mg), num volume de 100 ul, a cada rato com base nos pesos médios e number de ratinhos em cada grupo de estudo e. </li><li> Dilui-se a OH-BBN em etanol a 100%. Levar a concentração final de 30 mg / ml com água estéril. O final de etanol: concentração de água deve ser de 20:80, v / v </li><li> Administrar o OH-BBN oralmente utilizando aço inoxidável, 20 g de agulhas de gavage diárias, 5 dias / semana, durante 12 semanas, com base na atribuição de grupo de tratamento inicial com a idade de 8 semanas. </li></ol></li><li> Tratamentos de vacinação <ol><li> Reconstituir cada frasco de vacina peptídeo liofilizado em 600 ml de solução salina 0,9% estéril e completamente ressuspender desenhando a solução através de um 0,5 polegadas 27 agulha G 6x. Usando salina, ajustar a concentração de modo que a dose desejada é entregue num volume de 100 ul. </li><li> Começando na semana 20, após a última dose de OH-BBN, administrar a vacina numa base semanal, para um ciclo de oito semanas por injecção subcutânea de 100 ul usando uma agulha 25 G (número de semanas corresponde à idade dos ratinhos). </li></ol></li><li> Monitoramento e Coleta de Amostras <ol><li> Pesar todos os ratinhos e palpar para a presença de novos tumores uma vez por semana. Eutanásia quaisquer ratinhos que perderam ≥ 20% do peso do corpo, ou se existem tumores palpáveis, sangue na urina, e / ou retenção urinária. </li><li> Antes da primeira dose de OH-BBN e depois com intervalos de 4 semanas depois, recolher o sangue total através de sangrias submandibulares. Recolher o sangue em tubos de coagulação de soro Microtainer (BD) e 30 min para permitir a coagulação do sangue. </li><li> Centrifugar as amostras de sangue numa microcentrífuga a 3500 xg durante 10 min. Transferir cuidadosamente o soro para estragar criotubos tampão usando uma pipeta. </li><li> Congelamento flash em azoto líquido e armazenam-se a -80 ° C até análise posterior por multiplex. </li><li> Oito semanas após a última dose de OH-BBN, sacrificar todos os animais por asfixia CO 2. </li><li> Coloque cada rato em uma placa de dissecção e fechar por quatro membros. </li><li> Utilizando uma pinça e tesouras, make uma incisão horizontal na região abdominal superior. Inserir a tesoura na incisão entre a camada epidérmica e parede abdominal e separar cuidadosamente a pele do tecido subjacente com a ajuda de fórceps. </li><li> Adicione uma incisão vertical da incisão horizontal seguindo o eixo central em direcção à extremidade anterior do rato. Separe a pele da caixa torácica, e usando uma seringa de 1 ml e uma agulha de 22 G, perfure o coração e coleta de sangue com um empate suave e constante. </li><li> Consulte o passo 2.4.3 e 2.4.4 para o isolamento e armazenamento de soro. </li><li> Utilizando uma pinça e tesoura, cortar e descascar o resto da camada epidérmica. Corte através da parede abdominal e peritônio e retire assepticamente tumor da bexiga por imuno-histoquímica (IHQ) e Western blot. </li><li> Colete baço para análise da viabilidade celular (Muse) e ELISpot. Para IHC, lugar bexiga espécime tumor em cassete tecido e fixar em formol durante a noite gelada à temperatura ambiente. </li&gt; <li> No dia seguinte, substitui o formol com etanol a 70%. </li><li> Para a análise de Western blot de tumor, homogeneizar o tumor, adicionar tampão de extração de proteínas além de inibidores de protease Parada e transferir para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Vortex para 30-60 segundos e manter em gelo por 5 min. Flash congelar em nitrogênio líquido e descongelamento na água ambiente. Repetir o processo de vórtice, a congelação e descongelação duas vezes. </li><li> Centrifugar as amostras a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C e transfere-se os extractos celulares para novos tubos etiquetados. </li><li> Quantificar a concentração através da realização de um ensaio de proteína ácida bicinconínico (BCA) para medições de proteínas. Armazenar as amostras a -80 ° C até estar pronto para a análise de Western blot. </li></ol></li></ol> 3. Biologia Molecular / Western Os seguintes procedimentos foram realizados para verificar a expressão de MUC-1 no tecido de tumor da bexiga do rato utilizando o protocolo padrão de Western blot (dados não mostramn). <ol><li> Separa-se os extractos de proteína por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) e em seguida, transferir para uma membrana de PVDF utilizando um aparelho semi-secos. </li><li> Bloquear a membrana da proteína transferida com 5% de leite desnatado em 0,1% de Tween-20 em tampão fosfato salino (PBS-T), a pH 7,4, durante 1 hora num agitador orbital à temperatura ambiente. </li><li> Incubar a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente num agitador com o anticorpo anti-MUC-1 ou anti-β-actina em 0,1% PBS-T. </li><li> Lava-se a membrana por meio de decantação da solução e adicionando 0,1% de PBS-T. Redemoinho da membrana no agitador durante 5 minutos e decantar. Repita esta etapa duas vezes. </li><li> Incubar a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente com peroxidase de rábano (HRP) conjugado com anticorpo secundário. </li><li> Lave 3x (consulte o passo 3.4). </li><li> Siga o protocolo para o Chemiluminesence kit avançado (ECL) para ativar e ler o fluorografia. </li></ol> 4. Multiplex Fluorimétrica Imunoensaio Microbead &lt;ol&gt; <li> Configuração e Cálculos <ol><li> Usando um mapa da placa de 96 poços, ceder espaços em branco, padrões, controles e amostras nas cavidades. Calcular o número e volume de analitos, anticorpos de captura e estreptavidina-Ficoeritrina (SA-PE), necessária para o ensaio. </li><li> Permitir que todos os tampões e diluentes para equilibrar à temperatura ambiente. Preparar os padrões e as diluições da amostra, utilizando uma placa de 96 poços em branco. </li><li> Reconstituir a matriz de soro padrão e liofilizada de acordo com o protocolo e fazer uma série de diluições 1:05 do padrão com o diluente apropriado na placa de 96 poços do fabricante. Para os poços em branco, utilizar o diluente apropriado. </li><li> Dilui-se todos os controlos e as amostras desconhecidas 1:02 no diluente apropriado no resto da placa de 96 poços. </li><li> Para a mistura de grânulo, pipetar o volume necessário de o diluente apropriado em um tubo de 15 ml. Vortex de cada frasco talão durante 20 seg e pipetar o volume necessário de cada analito para o tubo de 15 ml. </li&gt; <li> Proteja sempre as contas de luz, para evitar a fotodegradação. Não colocar a placa de 96 poços em material absorvente para evitar a perda de amostra através de capilaridade. </li></ol></li><li> Protocolo de Ensaio <ol><li> Prewet a placa de fundo de filtro de 96 poços com 200 ul de tampão de ensaio e para permitir a imersão completa do filtro. Suavemente drenar através do aparelho de vácuo de placas de 96 poços e secar o fundo da placa com uma toalha de papel. </li><li> Usando uma pipeta multicanal, pipeta 25 ul de soro padrão aos poços designados para os espaços em branco e padrões e pipeta de 25 mL de tampão de ensaio aos poços designados para os controlos e amostras. </li><li> Pipetar 25 mL do branco, as normas, controles e incógnitas para os respectivos poços atribuídos. Vortex a mistura de esferas durante 20 segundos e transferir os grânulos a um reservatório. </li><li> Pipetar 25 ul da mistura de contas para cada poço. Cobrir a placa com uma folha de alumínio ou de uma tampa de placa opaco para proteger da luz. </li><li&gt; Agitar a placa a 500 rpm durante duas horas à temperatura ambiente num agitador de placas. Drenar e lavar a placa com 200 ul de 0,1% de Tween 20 em tampão fosfato salino (PBS-T), duas vezes. Escorrer e secar. </li><li> Preparar a solução de anticorpo de captura. Pipetar a quantidade necessária de 0,1% em PBS-T e anticorpo de captura num tubo ml e 15 vórtice durante 10 seg. Transferir a mistura de anticorpo de captura a um reservatório e uma pipeta de 25 uL em cada poço. </li><li> Agitar a placa a 500 rpm durante uma hora à temperatura ambiente num agitador de placas. Drenar e lavar a placa com 200 ul de 0,1% de PBS-T por duas vezes. Escorrer e secar. </li><li> Prepare a solução de SA-PE. Pipete o volume requerido de 0,1% de PBS-T e SA-PE num tubo ml e vortex durante 10 seg 15. Transferir a solução para um reservatório e uma pipeta de 25 uL em cada poço. </li><li> Agitar a placa a 500 rpm durante 30 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas. Drenar e lavar a placa com 200 ul de 0,1% de PBS-T por duas vezes. Escorra e bmuito seco. </li><li> Pipete 100 pi de 0,1% de PBS-T e agitar num agitador de placas a 500 rpm durante pelo menos dois minutos para ressuspender as esferas. Ler e analisar a placa na máquina LX200 Luminex. </li></ol></li></ol> 5. IFN-γ/IL-4 ELISpot Elaboração e Análise <ol><li> Em uma cabine de segurança biológica, processar os baços a 100 tecido Nylon mM peneiras em 5 ml de fosfato estéril, solução salina tamponada (PBS) em placas de Petri estéreis. Camada de esplenócitos em 3 ml de meio de separação de linfócitos em tubos estéreis de 15 ml. </li><li> Centrifugar os tubos a 600 xg durante 15 minutos para separar os linfócitos das células vermelhas do sangue. Transferir as camadas de linfócitos acima do gradiente para novos tubos estéreis de 15 ml. </li><li> Ajustar o volume para 10 ml com PBS estéril. Centrifugar a suspensão a 600 xg durante 10 min para sedimentar as células. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de PBS para a viabilidade celular e contar com a Musaanalisador. Siga o Muse Conde &amp; protocolo Kit de Viabilidade. </li><li> Fazer diluições seriadas dos linfócitos em 1,5 ml de parafusos de fixação em tubos de centrífuga de factores de diluição de 1:10, 1:20 e 1:40 (ou conforme o necessário) em Contagem &amp; Reagente Viabilidade (mínimo volume total de 300 ul). Pipeta cada diluição cima e para baixo várias vezes para misturar e analisar sobre o Muse. </li><li> Prepare um mapa da placa das amostras e as condições para a placa ELISpot. Preparar a placa de ELISpot de acordo com o protocolo do fabricante e pipeta de 100 uL de meio, o péptido (10 ug / ml), ou péptido (10 ug / ml) a cada poço precipitação. </li><li> Pipete 100 pi da suspensão de células, proporcionando 1,0 x 10 6 células para cada poço da placa e incubar a 37 ° C durante a noite. </li><li> Seguir o protocolo do fabricante para o ensaio ELISPOT. Analisar a placa ELISpot desenvolvido utilizando um microscópio de dissecação. </li><li> Quantificar os resultados por meio da contagem do número de manchas coloridas corresng para cada substância, em cada poço. As manchas correspondendo ao número de células formadoras de mancha (SFC) em cada poço. </li></ol> 6. Imuno-histoquímica (IHQ) e Hematoxilina &amp; Eosina (H &amp; E) Coloração <ol><li> Aqui o tecido do tumor da bexiga conservados, tal como descrito acima (secção 2.4.11), incorporar em parafina e secção passo de 4 mm para análise imuno-histoquímica. </li><li> Realizar IHC utilizando um anticorpo que reconhece a proteína MUC1 região de MUC1 de repetições em cadeia. Usar o animal Kit peroxidase Investigação para minimizar a reactividade do anticorpo secundário rato com imunoglobulina endógena presente no tecido. </li><li> Realizar coloração H &amp; E, utilizando protocolos padrão. </li></ol> 7. Métodos Estatísticos Para o Multiplex Fluorimétrica Imunoensaio Microbead, use o teste t de Student bicaudal para comparar a média de concentrações séricas de citocinas entre os grupos de tratamento e controle observado. Para ELISpot, usar um único way ANOVA para comparar o local formando colônias entre o controle da mídia, mexidos peptídeo e grupos de peptídeos. Use teste de comparações múltiplas de Dunnett para diminuir a probabilidade de um resultado falso-positivo. Um valor de p ≤ 0,05 é considerado significativamente diferente de todas as análises.

<ol><li>Siegel, R., Naishadham, D., et al. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).</li>
<li>Lynch, C. F., Davila, J. A. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLynch%2C+CF+%22SEER+Survival+Monograph%3A+Cancer+Survival+Among+Adults%3A+U.S.+SEER+Program%2C+1988-2001%2C+Patient+and+Tumor+Characteristics%22">SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics</a>. Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. , National Cancer Institute, SEER Program. Bethesda, MD. 07-6215(2007).</li>
<li>Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+cancer+in+2010%3A+how+far+have+we+come%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Bladder cancer in 2010: how far have we come.</a> CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).</li>
<li>Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+cancer%3A+a+review+of+non-muscle+invasive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Control%22%5BJournal%5D)">Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease.</a> Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).</li>
<li>Bohle, A., Jocham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+bacillus+Calmette-Guerin+versus+mitomycin+C+for+superficial+bladder+cancer%3A+a+formal+meta-analysis+of+comparative+studies+on+recurrence+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity.</a> J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).</li>
<li>Shokeir, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Squamous+cell+carcinoma+of+the+bladder%3A+pathology%2C+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment.</a> BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).</li>
<li>Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+human+tumour+immunology+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progress in human tumour immunology and immunotherapy.</a> Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).</li>
<li>Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Final+results+from+a+national+multicenter+phase+II+trial+of+combination+bacillus+Calmette-Guerin+plus+interferon+alpha-2B+for+reducing+recurrence+of+superficial+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer.</a> Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).</li>
<li>Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+MUC1%2C+MUC2%2C+and+MUC5AC+in+carcinomas+of+various+sites%3A+an+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study.</a> Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).</li>
<li>Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucins+in+cancer%3A+protection+and+control+of+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mucins in cancer: protection and control of the cell surface.</a> Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).</li>
<li>Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC1+mucin+in+urological+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">MUC1 mucin in urological malignancy.</a> BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).</li>
<li>Devine, P. L., McKenzie, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucins%3A+structure%2C+function%2C+and+association+with+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Mucins: structure, function, and association with malignancy.</a> Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).</li>
<li>Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-lymphocytes+derived+from+patients+with+breast+adenocarcinomas+recognize+an+epitope+present+on+the+protein+core+of+a+mucin+molecule+preferentially+expressed+by+malignant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells.</a> Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).</li>
<li>Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+MUC1+on+myeloma+cells+and+induction+of+HLA-unrestricted+CTL+against+MUC1+from+a+multiple+myeloma+patient%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient.</a> J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).</li>
<li>Choi, C., Witzens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+functional+CD8+memory+T+cells+specific+for+MUC1+in+bone+marrow+of+patients+with+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma.</a> Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).</li>
<li>Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific%2C+major+histocompatibility+complex-+unrestricted+recognition+of+tumor-associated+mucins+by+human+cytotoxic+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).</li>
<li>Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-cells+from+ovarian+malignant+tumors+can+recognize+polymorphic+epithelial+mucin+core+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides.</a> J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).</li>
<li>Tang, C. K., Katsara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+used+for+MUC1+immunotherapy%3A+human+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies.</a> Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).</li>
<li>Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC1-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+eradicate+tumors+when+adoptively+transferred+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo.</a> Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).</li>
<li>Acres, B., Limacher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC1+as+a+target+antigen+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Vaccines%22%5BJournal%5D)">MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy.</a> Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).</li>
<li>Butts, C., Murray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+phase+IIB+trial+of+BLP25+liposome+vaccine+in+stage+IIIB+and+IV+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer.</a> J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).</li>
<li>Butts, C., Maksymiuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+survival+analysis+in+patients+with+stage+IIIB+or+IV+non-small-cell+lung+cancer+receiving+BLP25+liposome+vaccine+%28L-BLP25%29%2C+phase+IIB+randomized%2C+multicenter%2C+open-label+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer.+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial.</a> J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).</li>
<li>Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+of+primary+human+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cell+responses+against+cancer-associated+MUC1+peptide+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes.</a> Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).</li>
<li>Palmer, M., Parker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+the+BLP25+%28MUC1+peptide%29+liposomal+vaccine+for+active+specific+immunotherapy+in+stage+IIIB%2FIV+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer.</a> Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).</li>
<li>Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin+expression+by+transitional+cell+carcinomas+of+the+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder.</a> Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).</li>
<li>Murray, A., Simms, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+rhenium-188-C595+antibody+for+radioimmunotherapy+of+transitional+cell+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer.</a> J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).</li>
<li>Hughes, O., Bishop, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+superficial+bladder+cancer+by+the+intravesical+administration+of+67copper-labelled+anti-MUC1+mucin+monoclonal+antibody+C595%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595.</a> J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).</li>
<li>Conn, I. G., Crocker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMFG-2+as+a+prognostic+indicator+in+superficial+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer.</a> J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).</li>
<li>Hughes, O., Denley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC1+mucin+expression+in+transitional+cell+carcinoma+of+the+bladder%3A+a+target+for+diagnosis+and+therapy+with+monoclonal+antibody+C595%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595.</a> J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).</li>
<li>Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+and+immunity+to+MUC1+in+a+human+MUC1+transgenic+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model.</a> Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).</li>
<li>Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin-1+specific+immunotherapy+in+a+mouse+model+of+spontaneous+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer.</a> J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).</li>
<li>McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+total+dose+and+dose+schedule+on+induction+of+urinary+bladder+cancer+in+the+mouse+by+N-butyl-N-%284-hydroxy-butyl%29nitrosamine%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine.</a> Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).</li>
<li>Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+effects+of+L-BLP25+antigen-specific+tumor+immunotherapy+in+a+novel+human+MUC1+transgenic+lung+cancer+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model.</a> J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).</li>
<li>Kunze, E., Schauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+transformation+in+the+development+of+N-butyl-N-%284hydroxybutyl%29-nitrosamine-induced+transitional+cell+carcinomas+in+the+urinary+bladder+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Krebsforsch+Klin.+Onkol.+Cancer+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats.</a> Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).</li>
<li>Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+human+bladder+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Experimental models of human bladder carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).</li>
<li>Samma, S., Uemura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+of+carcinoma+in+situ+in+dog+urinary+bladder+by+sequential+treatment+with+N-methyl-N%27-nitrosourea+and+N-butyl-N-%284-hydroxybutyl%29-nitrosamine%5BTitle%5D)+AND+%22Gann%22%5BJournal%5D)">Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N'-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine.</a> Gann. 75 (5), 385-387 (1984).</li>
<li>Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+urinary+bladder+urothelial+cancers+in+the+rabbit+by+dibutylnitrosamine+with+an+artificial+bladder+calculus+as+cocarcinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Urologe+A%22%5BJournal%5D)">Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen.</a> Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).</li>
<li>Irving, C. C., Tice, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+N-n-butyl-N-%284-hydroxybutyl%29nitrosamine-induced+urinary+bladder+cancer+in+rats+by+administration+of+disulfiram+in+the+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet.</a> Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).</li>
<li>Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-BLP25+vaccine+plus+letrozole+induces+a+TH1+immune+response+and+has+additive+antitumor+activity+in+MUC1-expresssing+mammary+tumors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice.</a> Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).</li>
</ol>

DPV, GTW, SMG, CJK, AMG, e GKH declaram que não há interesses conflitantes. MWD é o investigador principal de um subsídio recebido da Merck KGaA, e MW é um funcionário da Merck KGaA.

A indução bem-sucedida de carcinoma de células transicionais da bexiga e escamosas invasivo em ratos MUC1.Tg humanos oferece um modelo pré-clínico para o desenvolvimento de imunoterapia. Estudos imunoteraptico requerem o uso de um modelo espontâneo intacto, imune a fim de avaliar a resposta inflamatória a progressão do tumor ao longo do tempo, bem como a resposta imunitária a imunoterapia. Em um modelo de desenvolvimento de tumores espontâneos, o microambiente do tumor permanece intacta e os tumores se desenvolvem a uma...

O câncer de bexiga é o quarto tipo mais comum de câncer ea oitava causa de morte por câncer em homens americanos. Nos Estados Unidos, estima-se 72.500 novos casos e 15.000 mortes por câncer de bexiga são esperados entre homens e mulheres juntos em 2013 1. A incidência de câncer de bexiga é aproximadamente três vezes maior nos homens em relação às mulheres. Nos Estados Unidos, os carcinomas de células transicionais (TCC) são responsáveis ​​por mais de 90% dos casos, enquanto os carcinomas espinocelular (CEC) têm uma incidência de menos de 2% 2. A taxa de sobrevida em 5 anos relativo global para papilar TCC é de 91,5% em comparação com apenas 30,9% para o SCC 2. Embora TTCs papilares não invasivos representam aproximadamente 75% dos casos no momento do diagnóstico, mesmo com o tratamento de mais de 50% dos pacientes experimentam a recorrência dentro de 5 anos, com um máximo de 30% destes pacientes a progredir para doença invasiva do músculo 3,4 . Regimes de tratamento típicas para inv não-músculodoença ASIVE incluem a ressecção transuretral (TUR), seguido de quimioterapia intravesical. Em pacientes com Ta de alto grau ou tumores T1, um TUR repetição pode ser realizada antes da quimioterapia 3,4. Para os pacientes com recidiva Ta de baixo grau ou de alto grau de Ta ou lesões T1, TUR seguido por quimioterapia adjuvante, imunoterapia ou na forma de Bacilo Calmette-Guerin (BCG), podem ser utilizados 3,4. Intravesical BCG tem sido mostrado para ser superior ao intravesical mitomicina C no que diz respeito ao tempo de recorrência 5. Para doença invasiva muscular T2, cistectomia radical com ou sem quimioterapia neoadjuvante é o curso de tratamento recomendado 3. Em pacientes com SCC, cistectomia radical parece ser o tratamento mais eficaz 6. Dadas as altas taxas de reincidência, apesar dos melhores tratamentos disponíveis, existe claramente uma necessidade de terapias novas e mais eficazes para o câncer de bexiga. Ampliação de novos immunotherapies para bladdcâncer er é uma abordagem possível, que podem ser uma esperança para prolongar a sobrevivência livre de doença. Historicamente, a BCG tem sido a única imunoterapia para o câncer de bexiga. O seu mecanismo de acção está pensado para envolver a indução não específica de uma resposta imunitária de tipo T helper 1 (Th1), através de aumento dos níveis de interleucina-2 (IL-2) e interferão gama (IFN-γ) 4. Celular, ou a imunidade de Th1, é crítico na imunoterapia do cancro como humoral, ou Th2, a imunidade nunca foi demonstrado ser eficaz contra tumores sólidos, com excepção de anticorpos dirigidos contra os receptores do factor de crescimento de 7. Na tentativa de melhorar os benefícios da BCG monoterapia, IFN-α 2B/BCG combinação de imunoterapia foi avaliada em um ensaio clínico de fase II com resultados inconclusivos 8. Uma abordagem alternativa para a imunoterapia para o câncer de bexiga pode ser alvo antígenos associados a tumores (TAAs), a identificação de que fez imunoterapia do cancro mais específico 7 </sup&gt;. Um tal AT é a mucina 1 (MUC1), que é uma glicoproteína de superfície celular, em muitos cancros superexpresso de células epiteliais, tais como de bexiga, mama, pulmão, e cancro do pâncreas 9,10. A expressão e modificação da proteína MUC1 também é substancialmente alterada durante a carcinogénese, de tal forma que expõe underglycosylation sequências antigénicas de aminoácidos conhecidas como número variável de repetições em tandem (VNTR) no núcleo do péptido. Enquanto MUC1 é um auto-molécula, essas regiões imunodominantes VNTR não são normalmente expostos devido a uma extensa glicosilação e, assim, eles são vistos pelo sistema imune como 11,12 estrangeira. Os linfócitos T citotóxicos (CTLs) que reconhecem especificamente MUC1 epitopos tenham sido isolados a partir dos nódulos linfáticos drenantes tumores de pacientes de cancro da mama 13, bem como do sangue e da medula óssea de doentes com mieloma 14,15, tornando MUC1 um alvo potencial para um resposta imune celular. Os VNTRs imunodominantes da underglycosylateforma d de MUC1 são reconhecidas pelas CTLs, resultando na destruição de células tumorais 16-19. As respostas imunes celulares e / ou humorais nativas para MUC1 cancerosas são, no entanto, não é suficientemente forte para eliminar tumores. Para aumentar a resposta imune fraca já existente para MUC1, os péptidos imunodominantes sintéticos podem ser introduzidas através de vacinação para gerar uma resposta de CTL forte o suficiente para ser de benefício clínico 18,20. Uma vacina lipossomal MUC1 já foi mostrada para aumentar a sobrevivência em pacientes com cancro do pulmão 21,22, gerar CTL capazes de matar as células do tumor MUC-1-positivos, e produzir uma resposta de citocinas tipo Th1 polarizadas 23,24. Com um nível elevado de expressão de MUC-1 9,11,25, cancro da bexiga é um candidato lógico para testar a MUC1 dirigida imunoterapia 26,27. Além disso, a MUC1 tem potencial como fator prognóstico no câncer de bexiga 28, MUC1 expressão em TCC está significativamente associado com o estágio e grau, e metastático TCCFoi demonstrado que continuam a expressar MUC1 29. A fim de avaliar o potencial utilidade da imunoterapia MUC1 dirigida no cancro da bexiga, foi desenvolvido um MUC-1 humano intacto imune (hMUC1)-expressando Congênicos transgénico modelo de cancro da bexiga de rato (MUC1.Tg) no C57BL / 6 do fundo 30. MUC-1 humana expressa-se como uma auto-proteína sob o controlo do seu próprio promotor, resultando num padrão de expressão do tecido consistente com a observada em humanos 30,31. Os ratinhos foram induzidos com a bexiga cancerígeno conhecido N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN), 32, e, em seguida, os tumores resultantes foram avaliados quanto à expressão hMUC1 e tipo de tumor e grau. Para avaliar o efeito do agente cancerígeno sobre os níveis de citocinas Th1/Th2, durante o desenvolvimento do tumor, amostras de soro foram recolhidas periodicamente para análise multiplex. Os ratinhos foram, em seguida, tratou-se com uma vacina de péptido MUC1-alvo, e a citoquina de soro e as respostas imunes foram avated por multiplex fluorometric imunoensaio microbead e ELISpot.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-butil-N-(4-hidroxibutil)-nitrosamina (OH-BBN)</td><td>TCI America</td><td>B0938</td><td></td></tr><tr><td>20 G Agulhas de Gavagem</td><td>Popper Sons, Inc.</td><td>7921</td><td>Vacina</td></tr><tr><td>Peptídica</td> de aço inoxidável <td>N / A</td><td>N / A</td><td>agente investigacional</td></tr><tr><td>BD Microtainers</td><td>BD</td><td>365957</td><td></td></tr><tr><td>de tecido</td><td>Simport</td><td>M490-12</td><td></td></tr><tr><td>10% Forma tamponada neutra</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td>Pierce</td><td>87787</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease & Coquetel de inibidor de fosfatase</td><td>Thermo Scientific</td><td>78444</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Cytokine 20plex Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LMC006</td><td></td></tr><tr><td>Contas de microesferas magnéticas</td><td>Luminex</td><td>MC100xx-01</td><td>xx é a região do grânulo</td></tr><tr><td>Anti-mouse TNF- Anticorpo de captura</td><td>BD Pharmingen</td><td>551225</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de detecção de TNF anti-rato</td><td>BD Pharmingen</td><td>554415</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de captura IFN anti-rato</td><td>Abcam</td><td>ab10742</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato IFN- Anticorpo de detecção</td><td>Abcam</td><td>ab83136</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de ensaio</td><td>Millipore</td><td>L-MAB</td><td></td></tr><tr><td>Placas de filtro padrão</td><td>Millipore</td><td>MXM8070</td><td></td></tr><tr><td>Multi-screen HTS 96well</td><td>da Cytokine Millipore</td><td>MSBVN1210</td><td></td></tr><tr><td>SA-PE</td><td>Peneiras</td><td></td> de tecido de nylon de 100 m do SA10044 <td></td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Meios de separação de esplenócitos</td><td>Lonza</td><td>17-829E</td><td></td></tr><tr><td>TNF- /IL-4 Placas ELISpot</td><td>R& D Systems</td><td>ELD5217</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonal anti-MUC1 de coelho</td><td>Epitomics</td><td>2900-1</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonal anti-actina de cabra</td><td>Sigma</td><td>A1978</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo HRP anti-coelho</td><td>Promega</td><td>W401B</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo HRP anti-rato de cabra</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-2005</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>BioRad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean TGX Géis Pré-moldados</td><td>BioRad</td><td>456-1083</td><td></td></tr><tr><td>Muse Count & Kit de Viabilidade</td><td>Millipore</td><td>MCH100104</td><td></td></tr><tr><td>MUC1 Anticorpo</td><td>BD Pharmingen</td><td>550486</td><td>IHC</td></tr><tr><td>Anticorpo Animal Research Peroxidase</td><td>Kit Dako</td><td>K3954</td><td>Coloração IHC</td></tr><tr><td>Equipamento e Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millipore Aparelho de vácuo de placa</td><td>Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td></td></tr><tr><td>Luminex Lx200</td><td>Millipore / Luminex</td><td>40-013</td><td>Fabricado pela Luminex, distribuído pela Millipore</td></tr><tr><td>Luminex Xponent Software</td><td>Millipore / Luminex</td><td>N/A</td><td>Versão 3.1; incluído com o Luminex Lx200</td></tr><tr><td>Milliple Analyst Software</td><td>Milliplex / VigeneTech</td><td>40-086</td><td>Versão 5.1</td></tr><tr><td>Muse Cell Analyzer</td><td>Millipore</td><td>0500-3115</td><td></td></tr><tr><td>Muse Software</td><td>Millipore</td><td>N/A</td><td>Versão 1.1.0.0; incluído com</td></tr> o <tr><td>Microscópio de Dissecação</td><td>Unitron</td><td>Z730</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism Software</td><td>Graphpad Software Inc.</td><td>N / A</td><td>Versão 5.1</td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell Gel aparelho</td><td>BioRad</td><td>165-8001</td><td></td></tr><tr><td>Trans Blot SD Cell e PowerPac</td><td>BioRad</td><td>170-3849</td><td></td></tr></tbody></table>

indução de carcinoma da bexiga invasivo de células transicionais em imunológico intacto humanos muc1 ratos transgênicos: um modelo de desenvolvimento imunoterapia

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

A modelo pré-clínico de câncer de bexiga invasivo foi desenvolvido em mucina humana 1 (MUC1) camundongos transgênicos (MUC1.Tg) com a finalidade de avaliar a imunoterapia e / ou quimioterapia citotóxica. Para induzir o cancro da bexiga, C57BL / 6 (tipo selvagem e MUC1.Tg) foram tratados oralmente com o agente cancerígeno de N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN) a 3,0 mg / dia, 5 dias / semana durante 12 semanas. Para avaliar os efeitos de OH-BBN no perfil de citocinas no soro durante o desenvolvimento do tumor, sangue foi coletado por meio de hemorragias submandibular antes do tratamento ea cada quatro semanas. Além disso, uma vacina de péptido MUC1-alvo e um placebo foram administrados a grupos de ratinhos por semana durante oito semanas. Multiplex fluorométricos immunoanalyses microbead de citocinas no soro durante o desenvolvimento do tumor e após a vacinação foram realizadas. No término, o interferão gama (IFN-γ) / interleucina-4 (IL-4) análise ELISpot para MUC1 resposta imunitária das células T específicas e as avaliações histológicas do tipo de tumore grau foram realizados. Os resultados mostraram que: (1) a incidência de câncer de bexiga em ratos tipo tanto MUC1.Tg e selvagem foi de 67%, (2) carcinomas de células transicionais (TCC) desenvolvidos na proporção de 2:1 em relação ao carcinoma de células escamosas (SCC) , (3) as citocinas inflamatórias aumentou com o tempo, durante o desenvolvimento do tumor, e (4) a administração do péptido de vacina induz um perfil de citocinas Th1 soro polarizado e uma resposta de células T específica MUC1. Todos os tumores em MUC1.Tg camundongos foram positivos para MUC1 expressão, e metade de todos os tumores em camundongos tipo MUC1.Tg e selvagens foram invasivo. Em conclusão, utilizando uma abordagem de equipe, através da coordenação dos esforços dos farmacologistas, imunologistas, patologistas e biólogos moleculares, desenvolvemos um modelo de camundongo transgênico imune intacto de câncer de bexiga que expressa hMUC1.

A avaliação pré-clínica dos efeitos de novas imunoterapias e combinações no cancro da bexiga, exige o desenvolvimento de um modelo animal adequado. Em nosso modelo de camundongo transgênico, a indução com o carcinógeno químico OH-BBN resultou em uma alta taxa de incidência de câncer de bexiga predominantemente TCC com algum SCC, que é semelhante ao câncer de bexiga em humanos. Para determinar a histologia do tumor, estado de MUC1 expressão e a resposta imunitária ao tratamento com a vacina peptídica, MUC1.Tg 21 e 18 rat...

Um N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina induzida pelo modelo de cancro da bexiga foi desenvolvido em mucina humana 1 (MUC1) ratinhos transgénicos para o fim de testar a MUC1-imunoterapia dirigida. Após a administração de uma vacina de péptido MUC1-alvo, uma resposta de linfócitos T citotóxicos para MUC1 foi confirmada por medição dos níveis de citocinas no soro e da actividade específica da célula T.

Indução de carcinoma da bexiga invasivo de células transicionais em imunológico intacto Humanos MUC1 Ratos transgênicos: um modelo de desenvolvimento Imunoterapia

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

O objetivo geral do experimento a seguir é induzir efetivamente uma resposta de linfócitos T citotóxicos direcionada a um antígeno associado a tumor no câncer de bexiga. Isso é conseguido induzindo câncer de bexiga em camundongos que expressam o antígeno humano associado ao tumor mach um. Em seguida, uma vacina peptídica é injetada nos camundongos e uma resposta específica de linfócitos T citotóxicos mach one é gerada.Em seguida, o tumor sérico e o baço são isolados e os tecidos são analisados quanto a citocinas, antígenos e resposta imune, respectivamente. A utilização de multiplex western blot, microesferas fluorométricas, imunoensaio imuno-histoquímico e uma análise de ponto vivo nos permite testar a eficácia de uma vacina peptídica contra o câncer de bexiga. Olá, sou o Dr. Gregory Wetz, pesquisador do Sistema de Saúde Davis da Universidade da Califórnia em Sacramento, Califórnia.A principal vantagem dessa técnica em comparação com os métodos existentes, como xenoenxertos, é que os xenoenxertos requerem hospedeiros imunocomprometidos, enquanto nosso modelo utiliza um camundongo transgênico imune intacto que expressa um antígeno associado a tumor humano que é o alvo da vacina pep

induction-invasive-transitional-cell-bladder-carcinoma-immune-intact

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Rato injeção parede da bexiga é uma abordagem útil para estudo de células da bexiga ortotopicamente-tronco e biologia do câncer. Este método de microcirurgia delicada pode ser dominada com técnica cuidadosa e prática.

Injeção do mouse parede da bexiga

Tumores de bexiga são estabelecidos em camundongos fêmeas, de uma forma minimamente invasiva através de cateterismo, cauterização local, ea adesão posterior de células de carcinoma aos locais queimar.

Um modelo ortotópico de câncer de bexiga murino

Estabelecer um modelo de tumor de bexiga ortotópico para avaliar os efeitos antitumorais de sarna intravesical entregue e acompanhamento do crescimento tumoral por ultra-som e de imagem de bioluminescência.

Um modelo de tumor de bexiga ortotópico e Avaliação de Tratamento de sarna intravesical

Neste vídeo, descrevemos o procedimento intravesical de entrega de células cancerígenas na bexiga de um modelo de camundongo. Esse procedimento ajuda a gerar um modelo de tumor ortotópico de bexiga que pode ser usado para desenvolver estratégias terapêuticas.

Modelagem de tumor ortotópico de bexiga em modelo de camundongo: um procedimento para administração intravesical de células cancerígenas na bexiga murina

Implantação de células cancerosas para o órgão de origem pode servir como um modelo pré-clínico útil para avaliar novas terapias. Células de carcinoma da bexiga MB49 pode ser cultivada no interior da bexiga, após a instilação intravesical. Este protocolo demonstra a cateterização da bexiga do rato com a finalidade de implantação do tumor e entrega adenoviral.

Um modelo de cancro da bexiga para Ortotópico Gene Estudos de entrega

A técnica criada para inocular xenografts ortotópico de câncer de bexiga invasivo primário requer laparotomia e mobilização da bexiga. Este procedimento inflige morbidade significativa nos ratinhos, é tecnicamente difícil e demorado. Por isso, desenvolvemos um de alta precisão, a abordagem percutânea utilizando a orientação do ultra-som.

Minimamente Invasiva Estabelecimento de murino ortotópico bexiga Xenoenxertos

Este protocolo descreve a geração de tumores da bexiga ortotópico de murídeo em Ratinhos C57BL / 6J e a monitorização do crescimento do tumor.

Um modelo de tumor de murino de bexiga ortotópico e Tumor Detection System

Tumores de bexiga murino são induzidas com carcinógeno nitrosamina N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) (BBN). Geração de tumor de bexiga é heterogênea; Portanto, uma avaliação correcta da carga do tumor é necessária antes de randomização para tratamento experimental. Aqui nós apresentamos um protocolo de MRI, rápido e confiável para avaliar o estágio e o tamanho do tumor.

Ressonância magnética avaliação dos tumores de bexiga murino induzida por substância cancerígena

Este protocolo descreve a geração de modelos transplantação orthotopic do paciente-derivados do xenograft por intra-vesically incutir pilhas urotelial de primeira qualidade da carcinoma da pilha ou de injetar intra-rectal pilhas de cancro colorretal em não-obeso diabético/severo combinado ratos da imunodeficiência (NOD/SCID) para o crescimento preliminar do tumor e metástases espontâneas a influência de pilhas stromal do nó de linfa, que imita a progressão de doenças metastáticas humanas.

Modelos de xenoenxertos Ortotópicos derivados do paciente para Carcinoma de células urotelial humana e crescimento do tumor do câncer colorretal e metástase espontânea

Este protocolo fornece medidas experimentais detalhadas para estabelecer uma cultura in vitro tridimensional de organoides tumorais da bexiga derivados do câncer de bexiga induzido pelo cancerígeno. Métodos culturais, incluindo passaging, engenharia genética e transplante ortotópico de organoides tumorais são descritos.

Cultura, Manipulação e Transplante Ortotópico de Organoides tumorais da bexiga de camundongo

Aprenda a induzir resposta de linfócitos T citotóxicos em câncer de bexiga usando vacina peptídica direcionada ao antígeno MUC1 em camundongos transgênicos. Este modelo avalia a eficácia da imunoterapia.

Indução de carcinoma da bexiga invasivo de células transicionais em imunológico intacto Humanos MUC1 Ratos transgênicos: um modelo de desenvolvimento Imunoterapia (Vídeo) | JoVE Journal

Indução de carcinoma da bexiga invasivo de células transicionais em imunológico intacto Humanos MUC1 Ratos transgênicos: um modelo de desenvolvimento Imunoterapia

Explorar mais vídeos