Indução de carcinoma da bexiga invasivo de células transicionais em imunológico intacto Humanos MUC1 Ratos transgênicos: um modelo de desenvolvimento Imunoterapia

O objetivo geral do experimento a seguir é induzir efetivamente uma resposta de linfócitos T citotóxicos direcionada a um antígeno associado a tumor no câncer de bexiga. Isso é conseguido induzindo câncer de bexiga em camundongos que expressam o antígeno humano associado ao tumor mach um. Em seguida, uma vacina peptídica é injetada nos camundongos e uma resposta específica de linfócitos T citotóxicos mach one é gerada.

Em seguida, o tumor sérico e o baço são isolados e os tecidos são analisados quanto a citocinas, antígenos e resposta imune, respectivamente. A utilização de multiplex western blot, microesferas fluorométricas, imunoensaio imuno-histoquímico e uma análise de ponto vivo nos permite testar a eficácia de uma vacina peptídica contra o câncer de bexiga. Olá, sou o Dr. Gregory Wetz, pesquisador do Sistema de Saúde Davis da Universidade da Califórnia em Sacramento, Califórnia.

A principal vantagem dessa técnica em comparação com os métodos existentes, como xenoenxertos, é que os xenoenxertos requerem hospedeiros imunocomprometidos, enquanto nosso modelo utiliza um camundongo transgênico imune intacto que expressa um antígeno associado a tumor humano que é o alvo da vacina peptídica. Demonstrando as técnicas comigo estarão Daniel V e os doutores Chaga e Audrey Gutierrez, todos colegas cientistas pesquisadores, e o laboratório do Dr. Michael de Gregorio e o Sistema de Saúde da UC Davis. Antes de administrar a primeira dose de N butil, N quatro hidroxi, nitrosamina butílica ou OHBN para induzir câncer de bexiga, execute um sangramento submandibular em cada camundongo para coletar sangue total e tubos de coagulação do sangue e aguarde 30 minutos para que o sangue coagule.

A partir de oito semanas usando agulhas de gavagem de calibre 20 de aço inoxidável, administre o O-H-V-B-N por via oral cinco dias por semana durante 12 semanas. Na semana 20, use 600 microlitros de solução salina estéril a 0,9% para reconstituir cada frasco de vacina peptídica liofilizada e ressuspenda completamente retirando a solução através de uma agulha de calibre 27 de 0,5 polegada seis vezes usando solução salina. Ajuste a concentração para que a dose desejada seja administrada em um volume de 100 microlitros após a última dose de O-H-B-B-N e administre a vacina semanalmente por um ciclo de oito semanas usando uma agulha de calibre 25 para injetar 100 microlitros da vacina oito semanas após a última dose de O-H-B-B-N.

Depois de sacrificar todos os camundongos por asfixia por dióxido de carbono, coloque cada camundongo em uma placa de dissecação e prenda todos os quatro membros. Em seguida, usando fórceps e tesoura, faça uma incisão horizontal na região abdominal superior. Insira a tesoura na incisão entre a camada epidérmica e a parede abdominal e, com a ajuda de uma pinça, separe suavemente a pele do tecido subjacente.

Faça uma incisão vertical a partir da incisão horizontal seguindo o eixo do meio em direção à extremidade anterior do mouse. Em seguida, separe a pele da caixa torácica e, usando uma seringa de um mililitro e uma agulha de calibre 22, perfure o coração e colete o sangue com uma tração suave e constante usando uma pinça e uma tesoura. Corte e descasque o resto da camada epidérmica dentro de um gabinete de segurança biológica.

Corte a parede abdominal e o peritônio e assepticamente. Remova o tumor da bexiga para imuno-histoquímica ou IHQ e Western blot para IHQ. Coloque a amostra de tumor de bexiga em um de tecido e fixe-a em formina gelada durante a noite.

À temperatura ambiente, colete o baço para análise da viabilidade celular e um local de repouso para realizar o imunoensaio microbiano multiplex fluorométrico. Use 200 microlitros de tampão de ensaio para pré-umedecer. Uma placa inferior do filtro de 96 poços, permitindo que o filtro absorva completamente.

Em seguida, use um aparelho de vácuo de placa de 96 poços para drenar suavemente o filtro e use toalhas de papel para secar o fundo da placa usando uma pipeta multicanal, pipetar 25 microlitros de matriz de soro nos poços designados para os espaços em branco e padrões e pipetar 25 microlitros de tampão de ensaio nos poços designados para os controles e desconhecidos. Em seguida, pipete 25 microlitros dos padrões em branco, controles e incógnitas para os respectivos poços atribuídos. Vortex a mistura de contas por 20 segundos e transfira as contas para um reservatório.

Em seguida, pipete 25 microlitros da mistura de contas em cada um. Cubra bem a placa para protegê-la da luz e agite a placa em uma coqueteleira a 500 RPM por duas horas em temperatura ambiente, escorra a placa e use 200 microlitros de PBST para lavá-la duas vezes antes de escorrer e secá-la. Para preparar a solução de anticorpos de detecção, combine a quantidade necessária de 0,1% de PBST e anticorpo de detecção em um tubo de 15 mililitros e vórtice por 10 segundos.

Em seguida, pipete 25 microlitros em cada um. Agite bem a placa a 500 RPM durante uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, drene e lave a placa com 200 microlitros de 0,1% PBST duas vezes, drene e seque a pipeta seca 25 microlitros do estreptococo recém-preparado, AVID e FICO eryn ou SAPE para cada um, coloque bem a placa no agitador de placas e incube por 30 minutos em temperatura ambiente a 500 RPM.

Escorra e lave com PBST duas vezes. Para suspender as contas, adicione 100 microlitros de 0,1% PBST a cada poço e agite a 500 RPM por pelo menos dois minutos. Use a máquina Luminex LX 200 para ler e analisar a placa em um gabinete de segurança biológica.

Processe os baços de camundongo através de peneiras de tecido de náilon de 100 micrômetros em cinco mililitros de PBS estéril em placas de Petri estéreis. Coloque os aytes PLE em três mililitros de meio de separação de linfócitos em tubos estéreis de 15 mililitros. Centrifugue os tubos a 600 GS por 15 minutos.

Para separar os linfócitos dos glóbulos vermelhos, transfira os linfócitos em camadas acima do gradiente para novos tubos estéreis de 15 mililitros em tubos de centrífuga com tampa de rosca de 1,5 mililitro. Use o reagente de viabilidade de contagem para fazer a diluição seriada dos linfócitos. Em seguida, analise a musa.

Prepare um mapa de placas das amostras e condições para a placa pontual aliada, preparando a placa de acordo com o protocolo do fabricante e pipete 100 microlitros de peptídeo médio ou peptídeo embaralhado em cada um. Bem, adicione 100 microlitros de suspensão celular e incube a placa a 37 graus Celsius durante a noite. Siga o protocolo do fabricante para o ensaio de ponto ALI e use o microscópio de dissecção para analisar a placa de ponto de Aly desenvolvida.

Quantifique os resultados contando o número de manchas coloridas correspondentes a cada analito em cada poço. As manchas correspondem ao número de células formadoras de manchas em cada poço em nosso modelo de camundongo transgênico de indução com o carcinógeno químico. O-H-B-B-N resultou em uma alta taxa de incidentes de câncer de bexiga de carcinoma de células predominantemente transicionais ou TCC com algum carcinoma de células escamosas ou CEC, que é semelhante ao câncer de bexiga em humanos, conforme mostrado nesta figura.

Oito semanas após a indução de O-H-B-B-N, a taxa de incidência de câncer de bexiga para camundongos mach one transgênicos ou TG e do tipo selvagem foi de 67% A coloração de hematina e eosina confirmou a presença de TCCs e SCCs com TCCs predominando em uma proporção de dois para um. Entre estes, observamos uma variedade de tumores invasivos não invasivos a de alto grau de baixo e alto grau. Todas as amostras de câncer de bexiga de Mach um foram positivas para a expressão de mach um por IHQ.

Durante o desenvolvimento do modelo, os níveis séricos de citocinas inflamatórias foram monitorados em série entre as semanas oito a 28. Observamos que os níveis de citocinas inflamatórias aumentaram ao longo do tempo desde a indução até o final do estudo. Esse padrão de citocinas é muito semelhante ao que observamos anteriormente em nosso modelo de câncer de pulmão, o que sugere fortemente que o aumento dos níveis de citocinas inflamatórias pode se correlacionar com o desenvolvimento do tumor.

Para avaliar a resposta de uma citocina sérica à vacina peptídica, 15 camundongos mach one TG vacinados e 14 tratados com placebo foram eutanasiados e o sangue foi coletado ao final do estudo. 24 horas após o último tratamento vacinal. A análise multiplex mostra aumento dos níveis séricos de citocinas de TNF alfa, interferon gama, IL, dois IL 12 e IL 17 no grupo da vacina.

Em comparação com o grupo placebo, os níveis de TNF alfa, interferon gama e IL 17 foram significativamente maiores nos camundongos tratados com vacina. Esses resultados sugerem uma resposta de citocinas polarizadas à vacina peptídica para avaliar a resposta imune TH, TH dois à vacina peptídica. Os citos SP foram avaliados por interferon gama IL quatro pontos ALI mostrados aqui é uma avaliação de linfócitos isolados quanto à viabilidade após a semeadura de placas de pontos ALI com linfócitos viáveis, os resultados neste experimento foram claros e específicos interferon gama resposta ao peptídeo, o que confirma a resposta imune TH um à vacina peptídica Após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia do câncer explorarem novos imunoterápicos utilizando um modelo pré-clínico de câncer de bexiga avançado.