Name: Geração rápida de amilóide a partir de proteínas nativas in vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Aprenda a gerar rapidamente fibrilas de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro usando tampão MES, temperatura elevada e reticulação com EDC. Este método permite estudar mecanismos de misfolding proteico relevantes para doenças neurodegenerativas.

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Este trabalho é apoiado por doações para W.C. do National Institutes of Health Grant AI074809 e do Programa de Bolsas de Pesquisa Institucional do MD Anderson Cancer Center da Universidade do Texas.

1. Preparar o buffer MES
<ol>
	<li>Use tampão MES (ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico 0,1 M e NaCl 0,9 M) para preparar oligômeros de amilóide somente de proteína e oligômeros de proteína solúvel estabilizados. Pesar 1,95 g de MES e 5,27 g de NaCl. Adicione H2O e ajuste o pH para 4,7. Perfazer o volume final de 100 ml. Conservar a 4º C até 6 meses.</li>
</ol>
2. Prepare amilóide somente de proteína diretamente de proteínas nativas
<ol>
	<li>Pesar a proteína de escolha (qualquer proteína ou peptídeo nativo) e reconstituir a 10 mg/ml em tampão MES.</li>
	<li>Incubar a 65 ºC em banho-maria durante 4 horas. No final do período, o precipitado branco é visível em solução.</li>
	<li>Neutralize a amostra com 10% (v/v) de Tris-HCl (1 M, pH 10,5).</li>
	<li>Dialise a proteína em um de diálise durante a noite para trocar para o tampão desejado para análise posterior.</li>
	<li>Uma amostra de controle de proteína nativa pode ser preparada seguindo as etapas 2.1, 2.3 e 2.4 sem precipitação de calor (etapa 2.2).</li>
</ol>
3. Prepare amilóide híbrido a partir de oligômeros solúveis estabilizados de proteínas nativas
<ol>
	<li>Preparar oligômeros de proteínas solúveis estabilizadas
	<ol>
		<li>Pesar a proteína de sua escolha e reconstituir a 10 mg/ml em tampão MES. Deixe em temperatura ambiente por 15 min.</li>
		<li>Pesar cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) e preparar uma nova matéria-prima de 20 mg/ml em tampão MES.</li>
		<li>Misture soluções de proteínas e EDC na proporção de 2:5 (v/v), ou seja, 2 mg de proteína para cada 10 mg de EDC.</li>
		<li>Incube em temperatura ambiente por 2 horas.</li>
		<li>Neutralize a amostra com 10% (v/v) de Tris-HCl (1 M, pH 10,5).</li>
		<li>Dialise a proteína em um de diálise durante a noite para trocar para o tampão desejado para análise posterior.</li>
		<li>Conservar o oligómero de proteínas solúveis estabilizado a 4 ºC durante 4 semanas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prepare amilóides híbridos a partir de oligômero de proteína solúvel estabilizada.
	<ol>
		<li>Para preparar amilóide contendo DNA, misture DNA e oligômero de proteína solúvel estabilizada na proporção de 1:1 (p/p). Deixar a 4 ºC durante, pelo menos, 2 horas. Durante este período, o precipitado insolúvel é visível em solução quando a concentração inicial de proteína é de 0,5 mg / ml ou superior.</li>
		<li>Para preparar amilóide contendo RNA, misture RNA e oligômero de proteína solúvel estabilizada na proporção de 1:1 (p/p). Deixar a 4 ºC durante, pelo menos, 2 horas. Durante este período, o precipitado insolúvel é visível em solução quando a concentração inicial de proteína é de 0,5 mg / ml ou superior.</li>
		<li>Para preparar amilóide contendo heparina, misture heparina e oligômero de proteína solúvel estabilizada na proporção de 1:1 (p/p). Deixar a 4 ºC durante, pelo menos, 2 horas. Durante este período, o precipitado insolúvel é visível em solução quando a concentração inicial de proteína é de 0,5 mg / ml ou superior.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+proteins+in+fatal+ways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding proteins in fatal ways.</a> Nature. 426, 900-904 (2003).</li>
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<li>Stefani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+biophysical+features+of+both+oligomer%2Ffibril+and+cell+membrane+in+amyloid+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Biochemical and biophysical features of both oligomer/fibril and cell membrane in amyloid cytotoxicity.</a> FEBS J. 277, 4602-4613 (2010).</li>
<li>Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+classification+of+toxic+amyloid+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural classification of toxic amyloid oligomers.</a> J. Biol. Chem. 283, 29639-29643 (1074).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+with+nucleic+acids+or+glycosaminoglycans+converts+soluble+protein+oligomers+to+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding with nucleic acids or glycosaminoglycans converts soluble protein oligomers to amyloid.</a> J. Biol. Chem. 287, 736-747 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+in+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).</li>
<li>Jiménez, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-DNA+Interaction+at+the+Origin+of+Neurological+Diseases%3A+A+Hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Alzheimer%27s+Dis%22%5BJournal%5D)">Protein-DNA Interaction at the Origin of Neurological Diseases: A Hypothesis.</a> J. Alzheimer's Dis. 22, 375-391 (2010).</li>
<li>Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Mechanism+of+Aggregation+and+Fibril+Formation+from+Bovine+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).</li>
<li>Vetri, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+Serum+Albumin+protofibril-like+aggregates+formation%3A+Solo+but+not+simple+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Bovine Serum Albumin protofibril-like aggregates formation: Solo but not simple mechanism.</a> Arch. Biochem. Biophysics. 508, 13-24 (2011).</li>
<li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li>
<li>McParland, V. J., Kalverda, A. P., Homans, S. W., Radford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+properties+of+an+amyloid+precursor+of+b2-microglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural properties of an amyloid precursor of b2-microglobulin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 9, 326-331 (2002).</li>
<li>Chiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+conditions+for+in+vitro+formation+of+amyloid+protofilaments+and+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3590-3594 (1999).</li>
<li>McParland, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+Unfolded+States+of+b2-Microglobulin+and+Amyloid+Formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro.</a> Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).</li>
<li>Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glimpse+of+a+possible+amyloidogenic+intermediate+of+transthyretin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).</li>
<li>Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+aggregation+kinetics+of+the+repeat+domain+of+a+functional+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Pmel17.+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid.</a> Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid-containing+amyloid+fibrils+potently+induce+type+I+interferon+and+stimulate+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).</li>
<li>Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β.</a> Nat. Immunol. 9, 857(2008).</li>
<li>Masters, S. L., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+amyloid+and+misfolded+protein+aggregates+activate+the+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome.</a> Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

O método descrito aqui oferece um meio rápido e flexível para preparar fibrilas amilóides in vitro a partir de praticamente qualquer proteína ou peptídeo de sua escolha. Vários tipos diferentes de amilóide podem ser preparados de forma confiável - fibrilas somente de proteínas ou agregados híbridos contendo DNA, RNA ou glicosaminoglicanos. Os procedimentos envolvidos são simples, diretos e não requerem treinamento técnico avançado. O amiloide preparado por este método é bastante estável e pode ser armazenado com...

As proteínas são as macromoléculas biológicas mais abundantes presentes em todos os tipos de células. Eles ocorrem em uma grande variedade de tamanhos, estruturas e modificações pós-traducionais e cumprem uma enorme gama de funções biológicas importantes quando em suas formas nativas. Mais de duas dúzias de polipeptídeos aberrantes foram implicados em inúmeras condições patológicas humanas, como doença de Alzheimer, doença de Parkinson e diabetes tipo 21-4. As proteínas terminais mal dobradas acumulam como fibrilas amilóides os agregados estáveis insolúveis que ocorrem extracelularmente ou intracelularmente.
Apesar da implicação de proteínas específicas em certas doenças, evidências crescentes apóiam a noção de que todos os polipeptídeos têm propriedades intrínsecas que permitem a transformação amilóide. Uma pesquisa de sequência genômica completa identificou o "amiloma", pelo qual fragmentos propensos a amilóide constituem cerca de 15% de todos os segmentos peptídicos codificantes de E. coli a humanos5. Assim, um número crescente de amilóides funcionais, que participam de vários processos celulares importantes, foi descoberto nos últimos anos. Por exemplo, as bactérias montam amilóides para formar biofilme e estruturas de esporos que são críticas para sua sobrevivência e patogênese6-9. Os hormônios peptídicos formam depósitos amilóides durante o armazenamento dentro dos grânulos secretores de mamíferos antes de serem liberados, implicando ainda que a forma amilóide da proteína pode servir a funções biológicas benéficas6,10,11. Além disso, as proteínas também podem se reunir em fibrilas amilóides para transmitir sinais celulares críticos12,13.
Por muitos anos, os amilóides mais estudados são preparados a partir de peptídeos individuais associados a doenças humanas, como o beta-amilóide ou o peptídeo príon. Esses peptídeos geralmente carecem de estrutura bem definida e formam espontaneamente amilóide em solução ao longo do tempo, um processo mediado por um intermediário parcialmente mal dobrado que serve como precursor da amilóide insolúvel. O precursor da amiloide também é chamado de oligômero de proteína solúvel, que é raro e instável quando gerado a partir de peptídeos naturais14,15. No entanto, conforme descrito anteriormente, quase qualquer proteína, em princípio, pode adotar a conformação amilóide sob as condições apropriadas. Recentemente, estabelecemos um método para preparar oligômeros solúveis estabilizados de proteínas nativas, que prontamente formam amilóide na presença de vários cofatores16. As fibrilas amilóides resultantes refletem a natureza complexa dos agregados de dobramento incorreto da proteína terminal17,18. Aqui usamos o termo amilóide somente de proteína para nos referir às fibrilas proteicas sem cofatores e amilóide híbrida para as fibrilas contendo componentes não proteicos.
Anteriormente, vários métodos foram desenvolvidos para gerar amilóide in vitro aplicando condições conhecidas por favorecer o desdobramento de proteínas, como alta temperatura, ambiente hidrofóbico e variaçõesde pH 19-23. No entanto, eles se associam a vários problemas, como baixa eficiência, dobra reversível, grandes variações de lote ou cinética lenta. A abordagem descrita aqui é reprodutível, fácil de escalar e permite controlar com precisão o tempo e a condição da conversão amilóide.

<table><tbody><tr><td>Ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetil-aminopropil] carbodiimida (EDC)</td><td>Thermo/Pierce</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>DNA de esperma de salmão</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>RNA de levedura torula</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Heparina da mucosa intestinal suína</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Banho-maria</td><td>Fisher Science</td><td>Isotemp 210</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer de diálise</td><td>Thermo / Pierce</td><td>66380</td><td></td></tr></tbody></table>

geração rápida de amilóide a partir de proteínas nativas in vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

As proteínas realizam tarefas cruciais nos organismos, exercendo funções provocadas a partir de suas dobras tridimensionais específicas. Embora as estruturas nativas dos polipeptídeos cumpram muitos propósitos, agora é reconhecido que a maioria das proteínas pode adotar uma montagem alternativa de amilóide rica em folha beta. As fibrilas amilóides insolúveis são inicialmente associadas a várias doenças humanas, mas são cada vez mais mostradas como atores funcionais que participam de vários processos celulares importantes. Além disso, a amiloide depositada nos tecidos do paciente contém componentes não proteicos, como ácidos nucléicos e glicosaminoglicanos (GAGs). Esses cofatores podem facilitar a formação de amilóide, resultando na geração de diferentes tipos de precipitados insolúveis. Aproveitando nossa compreensão de como as proteínas se dobram incorretamente por meio de um estágio intermediário de precursor amilóide solúvel, desenvolvemos um método para converter proteínas nativas em fibrilas amilóides in vitro. Essa abordagem permite preparar amilóide em grandes quantidades, examinar as propriedades do amilóide gerado a partir de proteínas específicas e avaliar as mudanças estruturais que acompanham a conversão.

A capacidade de converter proteínas nativas diretamente em amiloides depende da mudança conformacional provocada em alta temperatura no tampão MES. A precipitação na solução é um bom indicativo de agregação proteica e possivelmente da formação de amiloides. Por outro lado, para permitir a estabilização de oligômeros proteicos solúveis, o EDC é utilizado para reticulação das proteínas, consolidando a conformação oligomérica induzida no tampão MES. Como resultado, os oligômeros proteicos estabilizados são proteínas multimé...

As proteínas podem adotar uma estrutura nativa ou se dobrar em amilóide insolúvel. As condições que favorecem a via de desdobramento levam à formação de diferentes tipos de fibrilas amilóides. Os métodos descritos aqui permitem a rápida conversão de proteínas nativas em amilóide in vitro.

Geração rápida de amilóide a partir de proteínas nativas in vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

O objetivo geral do experimento a seguir é obter rapidamente o amilóide de qualquer proteína in vitro. Isso é obtido dissolvendo a proteína de escolha no tampão MES para induzir o dobramento incorreto da estrutura. A proteína pode então ser incubada em alta temperatura, o que promove a formação de amilóide na ausência de outros cofatores.Alternativamente, a proteína é reticulada por EDC para gerar ligamentos proteicos solúveis estabilizados, o precursor da amilóide. Finalmente, cofatores não proteicos são misturados com oligômeros de proteínas solúveis estabilizados para permitir a formação de resultados híbridos de amilóide que mostram que as proteínas nativas podem ser prontamente convertidas em confirmação amilóide quando facilitadas por condições favoráveis. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em doenças de dobramento incorreto de proteínas, como a precisão com que a amilóide se forma a partir de oligômeros de proteínas solúveis e se diferentes tipos de amilóide têm funções biológicas e patológicas distintas.Para começar, prepare o tampão MES conforme descrito no protocolo de texto para proteína apenas amilóide e proteína solúvel estabilizada. Todos os ligamentos então pesam a proteína de escolha e a reconstituem a 10 miligramas por mililitro em tampão MES. Nesta demonstração, é usada albumina sérica humana ou HSA, incubar a solução a 65 graus Celsius em banho-maria por quatro horas.No final do período, um precipitado branco é visível na solução. Neutralize a amostra com 10% de volume por volume. T tris, HCL dialisa a proteína em um de diálise durante a noite para trocar para o tampão desejado.Para análise posterior, prepare uma amostra de controle de proteína nativa seguindo estas etapas sem precipitação de calor. Para preparar a proteína solúvel estabilizada, todos os ligamentos pesam a proteína de escolha e a reconstituem a 10 miligramas por mililitro. No tampão MES, deixe a solução de proteína em temperatura ambiente por 15 minutos.Preparar um novo caldo de 20 miligramas por mililitro EDC em tampão MES. Misture as soluções de proteína e EDC na proporção de dois para cinco e, em seguida, incube em temperatura ambiente por duas horas após a incubação. Neutralize a amostra com 10% de volume por volume de tris HCL e dialise a proteína em um de diálise durante a noite para troca para o tampão desejado.Para análise posterior. Armazene a proteína solúvel estabilizada em todo o ligamento a quatro graus Celsius por até quatro semanas. Esta suspensão será usada para preparar amilóides híbridos para a preparação do DNA contendo amilóide e do RNA contendo amilóide.Misture, o ácido nucléico e a proteína solúvel estabilizada em todos os ligamentos na proporção de um para um. Deixe a mistura a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas durante este período. O precipitado insolúvel é visível na solução quando a concentração inicial de proteína é de 0,5 miligramas por mililitro ou mais.Para preparar a heparina contendo amilóide, misture heparina e proteína solúvel estabilizada, todos os ligamentos na proporção de um para um antes de incubá-lo a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas. Semelhante ao ácido nucléico contendo amilóides no precipitado solúvel é visível em solução. Quando a concentração inicial de proteína é de 0,5 miligramas por mililitro ou mais, a capacidade de converter proteínas nativas diretamente em amilóide depende da mudança de confirmação ocorrida em alta temperatura.No tampão MES, a precipitação na solução é uma boa indicação da agregação de proteínas e possível formação de amilóide para permitir que os oligômeros de proteínas solúveis se estabilizem. O EDC é usado para reticular as proteínas para solidificar a confirmação oligomérica induzida no tampão MES. Como resultado, os allgas de proteínas estabilizadas são proteínas multiméricas distintas da proteína nativa monomérica ou agregados induzidos pelo calor.Quando separados por proteína solúvel estabilizada por página SDS, todos os ligamentos podem se ligar prontamente a ácidos nucléicos, incluindo DNA e RNA de maneira independente de sequência. Portanto, um ensaio de mudança de gel pode ser realizado para visualizar a interação direta entre a proteína solúvel estabilizada, todos os ligamentos e o DNA, o que resultaria na migração retardada do DNA em um gel AROS. A citotoxicidade é um caráter arquetípico da proteína solúvel.Todos os ligamentos estabilizaram a proteína solúvel, todos os ligamentos dosearam a morte celular induzida de forma dependente que é detectável por classificação de células ativadas por fluorescência. Como mostrado aqui, as células RP I 8 2 2 6 são extremamente suscetíveis à proteína solúvel, toda morte induzida por ligamento que é medida pela coloração com iodeto de propídio. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar diferentes tipos de amilóide a partir de qualquer proteína de sua escolha in vitro.

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Geração Rápida de Amiloide a partir de Proteínas Nativas In vitro

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