Name: Geração rápida de amilóide a partir de proteínas nativas in vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Aprenda a gerar rapidamente fibrilas de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro usando tampão MES, temperatura elevada e reticulação com EDC. Este método permite estudar mecanismos de misfolding proteico relevantes para doenças neurodegenerativas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho é apoiado por doações para W.C. do National Institutes of Health Grant AI074809 e do Programa de Bolsas de Pesquisa Institucional do MD Anderson Cancer Center da Universidade do Texas.

1. Preparar o buffer MES
<ol>
	<li>Use tampão MES (ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico 0,1 M e NaCl 0,9 M) para preparar oligômeros de amilóide somente de proteína e oligômeros de proteína solúvel estabilizados. Pesar 1,95 g de MES e 5,27 g de NaCl. Adicione H2O e ajuste o pH para 4,7. Perfazer o volume final de 100 ml. Conservar a 4º C até 6 meses.</li>
</ol>
2. Prepare amilóide somente de proteína diretamente de proteínas nativas
<ol>
	<li>Pesar a proteína de escolha (qualquer proteína ou peptídeo nativo) e reconstituir a 10 mg/ml em tampão MES.</li>
	<li>Incubar a 65 ºC em banho-maria durante 4 horas. No final do período, o precipitado branco é visível em solução.</li>
	<li>Neutralize a amostra com 10% (v/v) de Tris-HCl (1 M, pH 10,5).</li>
	<li>Dialise a proteína em um de diálise durante a noite para trocar para o tampão desejado para análise posterior.</li>
	<li>Uma amostra de controle de proteína nativa pode ser preparada seguindo as etapas 2.1, 2.3 e 2.4 sem precipitação de calor (etapa 2.2).</li>
</ol>
3. Prepare amilóide híbrido a partir de oligômeros solúveis estabilizados de proteínas nativas
<ol>
	<li>Preparar oligômeros de proteínas solúveis estabilizadas
	<ol>
		<li>Pesar a proteína de sua escolha e reconstituir a 10 mg/ml em tampão MES. Deixe em temperatura ambiente por 15 min.</li>
		<li>Pesar cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) e preparar uma nova matéria-prima de 20 mg/ml em tampão MES.</li>
		<li>Misture soluções de proteínas e EDC na proporção de 2:5 (v/v), ou seja, 2 mg de proteína para cada 10 mg de EDC.</li>
		<li>Incube em temperatura ambiente por 2 horas.</li>
		<li>Neutralize a amostra com 10% (v/v) de Tris-HCl (1 M, pH 10,5).</li>
		<li>Dialise a proteína em um de diálise durante a noite para trocar para o tampão desejado para análise posterior.</li>
		<li>Conservar o oligómero de proteínas solúveis estabilizado a 4 ºC durante 4 semanas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prepare amilóides híbridos a partir de oligômero de proteína solúvel estabilizada.
	<ol>
		<li>Para preparar amilóide contendo DNA, misture DNA e oligômero de proteína solúvel estabilizada na proporção de 1:1 (p/p). Deixar a 4 ºC durante, pelo menos, 2 horas. Durante este período, o precipitado insolúvel é visível em solução quando a concentração inicial de proteína é de 0,5 mg / ml ou superior.</li>
		<li>Para preparar amilóide contendo RNA, misture RNA e oligômero de proteína solúvel estabilizada na proporção de 1:1 (p/p). Deixar a 4 ºC durante, pelo menos, 2 horas. Durante este período, o precipitado insolúvel é visível em solução quando a concentração inicial de proteína é de 0,5 mg / ml ou superior.</li>
		<li>Para preparar amilóide contendo heparina, misture heparina e oligômero de proteína solúvel estabilizada na proporção de 1:1 (p/p). Deixar a 4 ºC durante, pelo menos, 2 horas. Durante este período, o precipitado insolúvel é visível em solução quando a concentração inicial de proteína é de 0,5 mg / ml ou superior.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+proteins+in+fatal+ways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding proteins in fatal ways.</a> Nature. 426, 900-904 (2003).</li>
<li>Schnabel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding%3A+The+dark+side+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein folding: The dark side of proteins.</a> Nature. 464, 828-829 (2010).</li>
<li>Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+and+protection+against+misfolded+or+damaged+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins.</a> Nature. 426, 895-899 (2003).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+functional+amyloid%2C+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366 (2006).</li>
<li>Goldschmidt, L., Teng, P. K., Riek, R., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+amylome%2C+proteins+capable+of+forming+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3487-3492 (2010).</li>
<li>Fowler, D. M., Koulov, A. V., Balch, W. E., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+amyloid+-+from+bacteria+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional amyloid - from bacteria to humans.</a> Trends Biochem. Sci. 32, 217-224 (2007).</li>
<li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Escherichia+coli+Curli+Operons+in+Directing+Amyloid+Fiber+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Escherichia coli Curli Operons in Directing Amyloid Fiber Formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li>
<li>Barnhart, M. M., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curli+Biogenesis+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Curli Biogenesis and Function.</a> Annu. Rev. Microbiol. 60, 131-147 (2006).</li>
<li>Claessen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+n%09olved+in+aerial+hyphae+formation+in+Streptomyces+coelicolor+by+forming+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A n	olved in aerial hyphae formation in Streptomyces coelicolor by forming amyloid-like fibrils.</a> Genes Dev. 17, 1714-1726 (2003).</li>
<li>Maji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Amyloids+As+Natural+Storage+of+Peptide+Hormones+in+Pituitary+Secretory+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional Amyloids As Natural Storage of Peptide Hormones in Pituitary Secretory Granules.</a> Science. 325, 328-332 (2009).</li>
<li>Badtke, M. P., Hammer, N. D., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Amyloids+Signal+Their+Arrival%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Functional Amyloids Signal Their Arrival.</a> Sci. Signal. 2, pe43(2009).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIP1%2FRIP3+Necrosome+Forms+a+Functional+Amyloid+Signaling+Complex+Required+for+Programmed+Necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RIP1/RIP3 Necrosome Forms a Functional Amyloid Signaling Complex Required for Programmed Necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li>
<li>Stefani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+biophysical+features+of+both+oligomer%2Ffibril+and+cell+membrane+in+amyloid+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Biochemical and biophysical features of both oligomer/fibril and cell membrane in amyloid cytotoxicity.</a> FEBS J. 277, 4602-4613 (2010).</li>
<li>Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+classification+of+toxic+amyloid+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural classification of toxic amyloid oligomers.</a> J. Biol. Chem. 283, 29639-29643 (1074).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+with+nucleic+acids+or+glycosaminoglycans+converts+soluble+protein+oligomers+to+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding with nucleic acids or glycosaminoglycans converts soluble protein oligomers to amyloid.</a> J. Biol. Chem. 287, 736-747 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+in+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).</li>
<li>Jiménez, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-DNA+Interaction+at+the+Origin+of+Neurological+Diseases%3A+A+Hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Alzheimer%27s+Dis%22%5BJournal%5D)">Protein-DNA Interaction at the Origin of Neurological Diseases: A Hypothesis.</a> J. Alzheimer's Dis. 22, 375-391 (2010).</li>
<li>Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Mechanism+of+Aggregation+and+Fibril+Formation+from+Bovine+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).</li>
<li>Vetri, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+Serum+Albumin+protofibril-like+aggregates+formation%3A+Solo+but+not+simple+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Bovine Serum Albumin protofibril-like aggregates formation: Solo but not simple mechanism.</a> Arch. Biochem. Biophysics. 508, 13-24 (2011).</li>
<li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li>
<li>McParland, V. J., Kalverda, A. P., Homans, S. W., Radford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+properties+of+an+amyloid+precursor+of+b2-microglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural properties of an amyloid precursor of b2-microglobulin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 9, 326-331 (2002).</li>
<li>Chiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+conditions+for+in+vitro+formation+of+amyloid+protofilaments+and+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3590-3594 (1999).</li>
<li>McParland, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+Unfolded+States+of+b2-Microglobulin+and+Amyloid+Formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro.</a> Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).</li>
<li>Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glimpse+of+a+possible+amyloidogenic+intermediate+of+transthyretin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).</li>
<li>Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+aggregation+kinetics+of+the+repeat+domain+of+a+functional+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Pmel17.+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid.</a> Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid-containing+amyloid+fibrils+potently+induce+type+I+interferon+and+stimulate+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).</li>
<li>Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β.</a> Nat. Immunol. 9, 857(2008).</li>
<li>Masters, S. L., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+amyloid+and+misfolded+protein+aggregates+activate+the+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome.</a> Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

O método descrito aqui oferece um meio rápido e flexível para preparar fibrilas amilóides in vitro a partir de praticamente qualquer proteína ou peptídeo de sua escolha. Vários tipos diferentes de amilóide podem ser preparados de forma confiável - fibrilas somente de proteínas ou agregados híbridos contendo DNA, RNA ou glicosaminoglicanos. Os procedimentos envolvidos são simples, diretos e não requerem treinamento técnico avançado. O amiloide preparado por este método é bastante estável e pode ser armazenado com...

As proteínas são as macromoléculas biológicas mais abundantes presentes em todos os tipos de células. Eles ocorrem em uma grande variedade de tamanhos, estruturas e modificações pós-traducionais e cumprem uma enorme gama de funções biológicas importantes quando em suas formas nativas. Mais de duas dúzias de polipeptídeos aberrantes foram implicados em inúmeras condições patológicas humanas, como doença de Alzheimer, doença de Parkinson e diabetes tipo 21-4. As proteínas terminais mal dobradas acumulam como fibrilas amilóides os agregados estáveis insolúveis que ocorrem extracelularmente ou intracelularmente.
Apesar da implicação de proteínas específicas em certas doenças, evidências crescentes apóiam a noção de que todos os polipeptídeos têm propriedades intrínsecas que permitem a transformação amilóide. Uma pesquisa de sequência genômica completa identificou o "amiloma", pelo qual fragmentos propensos a amilóide constituem cerca de 15% de todos os segmentos peptídicos codificantes de E. coli a humanos5. Assim, um número crescente de amilóides funcionais, que participam de vários processos celulares importantes, foi descoberto nos últimos anos. Por exemplo, as bactérias montam amilóides para formar biofilme e estruturas de esporos que são críticas para sua sobrevivência e patogênese6-9. Os hormônios peptídicos formam depósitos amilóides durante o armazenamento dentro dos grânulos secretores de mamíferos antes de serem liberados, implicando ainda que a forma amilóide da proteína pode servir a funções biológicas benéficas6,10,11. Além disso, as proteínas também podem se reunir em fibrilas amilóides para transmitir sinais celulares críticos12,13.
Por muitos anos, os amilóides mais estudados são preparados a partir de peptídeos individuais associados a doenças humanas, como o beta-amilóide ou o peptídeo príon. Esses peptídeos geralmente carecem de estrutura bem definida e formam espontaneamente amilóide em solução ao longo do tempo, um processo mediado por um intermediário parcialmente mal dobrado que serve como precursor da amilóide insolúvel. O precursor da amiloide também é chamado de oligômero de proteína solúvel, que é raro e instável quando gerado a partir de peptídeos naturais14,15. No entanto, conforme descrito anteriormente, quase qualquer proteína, em princípio, pode adotar a conformação amilóide sob as condições apropriadas. Recentemente, estabelecemos um método para preparar oligômeros solúveis estabilizados de proteínas nativas, que prontamente formam amilóide na presença de vários cofatores16. As fibrilas amilóides resultantes refletem a natureza complexa dos agregados de dobramento incorreto da proteína terminal17,18. Aqui usamos o termo amilóide somente de proteína para nos referir às fibrilas proteicas sem cofatores e amilóide híbrida para as fibrilas contendo componentes não proteicos.
Anteriormente, vários métodos foram desenvolvidos para gerar amilóide in vitro aplicando condições conhecidas por favorecer o desdobramento de proteínas, como alta temperatura, ambiente hidrofóbico e variaçõesde pH 19-23. No entanto, eles se associam a vários problemas, como baixa eficiência, dobra reversível, grandes variações de lote ou cinética lenta. A abordagem descrita aqui é reprodutível, fácil de escalar e permite controlar com precisão o tempo e a condição da conversão amilóide.

<table><tbody><tr><td>Ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetil-aminopropil] carbodiimida (EDC)</td><td>Thermo/Pierce</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>DNA de esperma de salmão</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>RNA de levedura torula</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Heparina da mucosa intestinal suína</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Banho-maria</td><td>Fisher Science</td><td>Isotemp 210</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer de diálise</td><td>Thermo / Pierce</td><td>66380</td><td></td></tr></tbody></table>

geração rápida de amilóide a partir de proteínas nativas in vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

As proteínas realizam tarefas cruciais nos organismos, exercendo funções provocadas a partir de suas dobras tridimensionais específicas. Embora as estruturas nativas dos polipeptídeos cumpram muitos propósitos, agora é reconhecido que a maioria das proteínas pode adotar uma montagem alternativa de amilóide rica em folha beta. As fibrilas amilóides insolúveis são inicialmente associadas a várias doenças humanas, mas são cada vez mais mostradas como atores funcionais que participam de vários processos celulares importantes. Além disso, a amiloide depositada nos tecidos do paciente contém componentes não proteicos, como ácidos nucléicos e glicosaminoglicanos (GAGs). Esses cofatores podem facilitar a formação de amilóide, resultando na geração de diferentes tipos de precipitados insolúveis. Aproveitando nossa compreensão de como as proteínas se dobram incorretamente por meio de um estágio intermediário de precursor amilóide solúvel, desenvolvemos um método para converter proteínas nativas em fibrilas amilóides in vitro. Essa abordagem permite preparar amilóide em grandes quantidades, examinar as propriedades do amilóide gerado a partir de proteínas específicas e avaliar as mudanças estruturais que acompanham a conversão.

A capacidade de converter proteínas nativas diretamente em amiloides depende da mudança conformacional provocada em alta temperatura no tampão MES. A precipitação na solução é um bom indicativo de agregação proteica e possivelmente da formação de amiloides. Por outro lado, para permitir a estabilização de oligômeros proteicos solúveis, o EDC é utilizado para reticulação das proteínas, consolidando a conformação oligomérica induzida no tampão MES. Como resultado, os oligômeros proteicos estabilizados são proteínas multimé...

As proteínas podem adotar uma estrutura nativa ou se dobrar em amilóide insolúvel. As condições que favorecem a via de desdobramento levam à formação de diferentes tipos de fibrilas amilóides. Os métodos descritos aqui permitem a rápida conversão de proteínas nativas em amilóide in vitro.

Geração rápida de amilóide a partir de proteínas nativas in vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

O objetivo geral do experimento a seguir é obter rapidamente o amilóide de qualquer proteína in vitro. Isso é obtido dissolvendo a proteína de escolha no tampão MES para induzir o dobramento incorreto da estrutura. A proteína pode então ser incubada em alta temperatura, o que promove a formação de amilóide na ausência de outros cofatores.Alternativamente, a proteína é reticulada por EDC para gerar ligamentos proteicos solúveis estabilizados, o precursor da amilóide. Finalmente, cofatores não proteicos são misturados com oligômeros de proteínas solúveis estabilizados para permitir a formação de resultados híbridos de amilóide que mostram que as proteínas nativas podem ser prontamente convertidas em confirmação amilóide quando facilitadas por condições favoráveis. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em doenças de dobramento incorreto de proteínas, como a precisão com que a amilóide se forma a partir de oligômeros de proteínas solúveis e se diferentes tipos de amilóide têm funções biológicas e patológicas distintas.Para começar, prepare o tampão MES conforme descrito no protocolo de texto para proteína apenas amilóide e proteína solúvel estabilizada. Todos os ligament

rapid-generation-of-amyloid-from-native-proteins-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Geração Rápida de Amiloide a partir de Proteínas Nativas In vitro

SDD-AGE é uma técnica útil para a detecção e caracterização de amilóide como polímeros nas células. Aqui nós demonstramos uma adaptação que torna esta técnica passível de aplicações em larga escala.

Triagem para Agregação de amilóide por Semi-desnaturação Eletroforese Gel Detergente-Agarose

Fonte: Balczon, R., et al. Métodos para detecção de amilóides citotóxicos após infecção de células endoteliais pulmonares por Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra o procedimento para gerar sobrenadante citotóxico a partir de células endoteliais pulmonares após infecção por Pseudomonas aeruginosa. Ele descreve como as proteínas efetoras bacterianas interrompem a estrutura da célula hospedeira e induzem a liberação de oligômeros amilóides citotóxicos no sobrenadante.

Obtenção de amilóides citotóxicos após infecção bacteriana de células endoteliais pulmonares de ratos

Um método cromatográfico de duas etapas é descrito para a purificação da proteína Shadoo recombinante expressa como corpos de inclusão em Escherichia coli, bem como um protocolo para fibrilar Shadoo purificado em estruturas amilóides.

Purificação e redobramento de amilóide fibrilas de (seu)<sub&gt; 6</sub&gt; tagged proteína recombinante Shadoo Expresso como Corpos de Inclusão em<em&gt; E. coli</em

Este relatório descreve protocolos para medir as taxas de degradação de proteínas mal dobradas por ensaios baseados em western blot ou fluorescência. Os métodos podem ser aplicados à análise de outras proteínas mal dobradas e para triagem de alto rendimento.

Os ensaios para a degradação de proteínas em células deformadas

Um protocolo de expressão livre de células fácil de usar para a incorporação específica de resíduos de análogos de aminoácidos não canônicos em proteínas, incluindo análise a jusante, é apresentado para estudos médicos, farmacêuticos, estruturais e funcionais.

Incorporação específico de resíduos de não-canônicos Aminoácidos em proteínas modelo Usando um<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Sistema de transcrição-tradução livre-Cell

Há uma demanda para fazer pré-clínicos de teste para uma novela classe de drogas "órfão" chamado acompanhantes farmacológicos podem ser reproduzidos, rápido e eficiente. Desenvolvemos um ensaio de baseado em cultura celular altamente padronizado, simples e versátil para tela para pacientes elegíveis, bem como drogas de romance acompanhante farmacológica.

In Vitro Enzima de medição para teste farmacológico acompanhante receptividade em Fabry e a doença de Pompe

Métodos simples são descritos para demonstrar a produção de amiloides citotóxicos após infecção do endotélio pulmonar por Pseudomonas aeruginosa.

Métodos para detecção de citotóxicos amiloides seguir infecção de pulmonar células endoteliais por Pseudomonas aeruginosa

Aqui nós apresentamos um protocolo para análise de crescimento de Aspergillus flavus e produção de aflatoxinas em grãos de milho expressar uma proteína antifúngica.  Estamos usando uma estirpe de GFP-expressando a. flavus monitorado a infecção e a propagação do fungo em sementes maduras em tempo real. O ensaio é rápido, confiável e reprodutível.

Inibição do crescimento de Aspergillus flavus e produção de aflatoxina em milho transgénicos que expressar o inibidor de α-amilase de Lablab purpureus L.

Fornecido aqui é um protocolo para investigar as interações entre a forma nativa, prefibrillar, e fibrilas amiloides maduras de diferentes peptídeos e proteínas com mitocôndrias isoladas de diferentes tecidos e várias áreas do cérebro.

Interações com e permeabilização de membrana de mitocôndrias cerebrais por fibrilas amiloides

Aqui, descrevemos um sistema de levedura reconstituindo a γ-secretase humana. Este sistema permite a identificação e o estudo de mutações que afetam a atividade e a triagem de inibidores da γ-secretase (GSIs). Utilizando as propriedades de perda de função dos mutantes familiares da doença de Alzheimer, é possível rastrear moduladores de γ-secretase (GSMs).

Saccharomyces cerevisiae Modelos da doença de Alzheimer para rastrear genes, mutações e produtos químicos que afetam a produção de beta-amilóide pela γ-secretase

Aprenda a gerar rapidamente fibrilas de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro usando tampão MES, temperatura elevada e reticulação com EDC. Este método permite estudar mecanismos de misfolding proteico relevantes para doenças neurodegenerativas.

Geração rápida de amilóide a partir de proteínas nativas in vitro

Explorar mais vídeos